本文介绍了一种利用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏中分离小鼠肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治结构中对肝细胞进行长期培养的方法，以及对细胞骨架成分进行免疫标记，以研究胆小管的形成及其对处理的响应。
本文内容
摘要
摘要
肝细胞是肝脏中负责其代谢功能的核心细胞。因此，它们形成了一种独特的极性上皮结构，其中两个或多个肝细胞共同提供顶膜，以构建胆小管网络，胆汁通过该网络分泌。肝细胞的极性对于胆小管的正确形成至关重要，依赖于肝细胞细胞骨架、细胞间连接以及细胞外基质之间的相互作用。由于缺乏能够紧密模拟体内胆小管网络结构的细胞培养模型，目前对肝细胞细胞骨架在胆小管形成中的作用及其在病理条件下的反应的体外研究受到限制。本文描述了一种利用改良的胶原酶灌注技术从小鼠成年肝脏中分离肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治培养体系中进行细胞培养的方法，该体系可用于细胞骨架组分的免疫标记，以研究胆小管的形成及其在体外对处理因素的反应。结果表明，肝细胞的三维胶原三明治培养体系对毒素（如乙醇）或影响肌动蛋白细胞骨架的药物（例如，blebbistatin）处理具有响应性，是研究胆小管体外形成与功能的有力工具。
引言
肝细胞是肝脏的核心细胞结构，负责肝脏的代谢功能，属于具有独特极性的上皮细胞。肝细胞的极性在哺乳动物出生后不久即形成，导致胆小管网络的建立，对胆汁的正常分泌至关重要。肝细胞的顶膜共同构成胆小管，而基底膜则与肝窦内皮细胞保持接触。肝细胞极性的丧失会导致胆汁转运蛋白的重新分布，引发胆汁在肝脏内滞留相关的病理过程（即胆汁淤积）。
肝细胞极性的建立与维持以及胆小管的发育涉及复杂的机制。这些过程依赖于肝细胞细胞骨架、细胞间连接以及细胞与细胞外基质相互作用之间的协同调控1。肝细胞细胞骨架包含三种纤维网络：肌动蛋白细胞骨架、微管和中间纤维，它们为胆小管的形成提供结构支持。在三维胶原夹心培养的肝细胞体外模型中，细胞骨架组分在胆小管网络再生与维持中的不同作用已有报道2。
在胆小管形成位点肝细胞膜极化的初始阶段，肌动蛋白微丝和微管具有重要作用2。肌动蛋白细胞骨架建立了胆小管的结构与功能，形成与膜相关的微丝和环周纤维环，从而维持胆小管的结构完整性，并将肌动蛋白细胞骨架整合到紧密连接和黏附连接中3。位于肌动蛋白细胞骨架外侧的角蛋白中间纤维环进一步稳定了胆小管结构3。
在多种基因敲除小鼠模型中，肝细胞连接复合体中的蛋白质对胆小管结构的组织作用已有充分记载，缺乏紧密连接和/或黏附连接蛋白的小鼠均表现出胆小管形态扭曲4,5,6。研究表明，黏附连接蛋白α-catenin的缺失会导致肝细胞肌动蛋白细胞骨架紊乱、胆小管管腔扩张、紧密连接通透性增加，并最终形成胆汁淤积表型4。此外，体外研究也证实了黏附连接组分E-cadherin和β-catenin在肝细胞顶膜管腔重塑及蛋白质转运过程中的重要作用7。
引人注目的是，敲除作为主要角蛋白组织者的细胞骨架交联蛋白plectin后，所观察到的表型与肌动蛋白细胞骨架相关的表型相似8。这表明角蛋白中间丝在维持胆小管结构方面具有关键作用。利用三维肝细胞胶原夹心模型开展的体外研究也揭示了AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase）及其上游激活因子LKB1在胆小管网络形成中的重要性9。这些发现随后在后续的体内研究中得到了进一步验证10,11。因此，目前已有明确共识：体外研究对于深入理解肝细胞极性建立、正常胆小管网络形成以及胆汁分泌过程中涉及的信号通路至关重要。
在体外研究胆小管形成及其对病理状况反应的过程中，一个主要挑战是采用能够紧密模拟体内情况的细胞培养条件12。新分离的原代肝细胞不具备极性，因此在二维培养条件下会丧失其功能、形态以及功能性胆小管（例如基因调控、极化和去分化的改变13,14,15）。尽管如此，与肝源性细胞系相比，新分离的肝细胞仍最能真实反映体内肝脏的自然状态,16。尽管既往曾使用永生化细胞系，但这些细胞并不表现出肝细胞典型的上皮样形态特征，且其形成的胆小管腔室与真实肝小管的相似度较低7。近年来，来自小鼠和大鼠的原代肝细胞三维培养已成为研究体外胆小管网络形成相关过程的有力工具9。将原代肝细胞培养于两层胶原之间（称为三维胶原三明治培养）可在数天内实现细胞重极化。由于小鼠肝细胞在三维胶原三明治中培养的技术要求较高，本文提供了一套完整的实验方案，用于分离、培养并进行免疫标记嵌入三维胶原三明治中的小鼠肝细胞，以表征细胞骨架组分在胆小管形成过程中的作用。
方案
所有动物实验均按照欧洲指令2010/63/EU的规定进行，并经捷克中央动物福利委员会批准。
1. 材料
- 根据国际实验动物科学联合会指南，将动物饲养于特定病原体阴性条件下，自由摄取常规饲料和饮用水。保持12小时光照/12小时黑暗的饲养周期。用于肝细胞分离与培养的动物应为8–12周龄。
- 储备液 A 和 B
- 根据以下步骤配制储备液A和储备液B 表1 和 表2，分别提前溶解于1 L蒸馏水中。2O (dH2O
- 将溶液的 pH 值调节至 7.2，并通过 0.2 μm 滤膜过滤。两种溶液均可在 4 °C 下保存长达 6 个月。
- 储备液 C
- 在原代肝细胞分离当天配制溶液C。
- 根据以下说明添加所有组分 表3， 用去离子水定容至 50 mL 总体积2O，并溶解。调节pH至7.3。
- 将溶液每50 mL分装至50 mL离心管中，每只动物使用一管。将所有需要的分装样品置于预热的水浴（37 °C）中。
- 储备液 D
- 在原代肝细胞分离当天配制溶液D。
- 根据以下说明添加所有组分 表4，用去离子水定容至30 mL总体积2O，并溶解。调节pH至7.3。
- 将30 mL溶液分装至50 mL离心管中。向溶液D中加入胶原酶I（5 mg/30 mL）。每只动物使用一份分装液。将所有分装液置于预热的水浴锅中（37 °C）。
- 储备液 E
- 在原代肝细胞分离当天配制溶液E。
- 根据以下说明添加所有组分 表5， 用去离子水定容至 50 mL 总体积2O，并溶解。调节pH至7.3。
- 将溶液分装至50 mL离心管中，每管50 mL。向溶液E中加入白蛋白V（0.65 g/50 mL）。每只动物使用一份分装液。将所有分装液置于预热的水浴（37 °C）中。
2. 胶原三明治的制备
- 在原代肝细胞分离前一天，制备I型胶原的底层结构。
注意：操作全程需在冰上进行，并使用预冷的溶液、枪头、培养皿和离心管，以尽量减少I型胶原的非预期凝胶化。 - 根据生产商说明书，中和所需量的I型胶原（来自大鼠尾部）。每个实验样本（3.5 cm培养皿）需使用100 µL中和后的I型胶原（1.5 mg/mL）。配制1 mL中和后的I型胶原（1.5 mg/mL）时，向500 μL I型胶原（储存浓度 = 3 mg/mL）中加入100 μL 10× DMEM、1.5 μL 1 M NaOH和48.5 μL dH2O。用石蕊试纸检测中和后胶原的pH值（pH应约为7.5）。
- 将3.5 cm培养皿置于冰上，用预冷的200 μL枪头将100 μL中和后的I型胶原溶液均匀铺展于培养皿表面。
- 在标准培养条件下（37 °C、5% CO2的培养箱）过夜孵育。在原代肝细胞分离当天，向第一层I型胶原上加入1 mL预热至37 °C的PBS，于37 °C孵育2–3小时，使胶原充分再水化。
3. 仪器设备设置
- 按照材料表中列出的清单准备所有设备，并按照图1所示进行设置。
4. 手术步骤
- 通过肌肉注射替来他明（60 mg/kg 体重）、唑拉西泮（60 mg/kg）和赛拉嗪（4.5 mg/kg）对小鼠进行麻醉。数分钟后，通过脚趾夹捏法确认麻醉效果。若动物对夹捏无反应，则进行步骤 4.2。
- 将麻醉后的小鼠置于解剖板上，并用胶带固定其四肢，使其保持仰卧位。用 70% 乙醇擦拭腹部，从耻骨区域至前肢做 V 形切口打开腹腔。将皮肤向胸部翻折以暴露腹腔。将解剖板置于解剖显微镜下。
- 将胰岛素注射器针头（30 G）弯成 45° 角。将肠道和结肠向尾侧移动，暴露下腔静脉（IVC）。
- 用套管针将 2.5 mL 预热（37 °C）的溶液 C 装入 2 mL 注射器中。确保套管针和注射器中无气泡。
- 在插管下腔静脉前，用湿润（PBS）的棉签轻压肝脏叶使其贴紧膈肌以重新定位肝叶。在肝脏下方的下腔静脉周围放置丝线缝合线（图 2A,B）。
- 使用针头弯成 45° 角的胰岛素注射器向门静脉注射 10 µL 肝素（5000 U/mL）（图 2C）。
- 为对肝脏进行插管，使用显微外科剪刀在靠近肝脏的下腔静脉处（缝线下方；图 2D）做一个足够插入套管针的小切口。用缝合线和两个外科结将套管针固定在位（图 2E）。
- 切断门静脉（图 2F），使灌注缓冲液可从肝脏流出，防止肝脏膨胀。
- 通过缓慢推动连接套管针的注射器，手动以 1.5 mL 预热的溶液 C 灌注肝脏（约需 15 秒）。此时可通过肝脏颜色变浅观察到血液从肝脏中被清除。
- 用预热（37 °C）的溶液 C 预填充蠕动泵。检查灌注装置，确保系统中无气泡。
- 小心地将套管针与注射器断开，并连接至以 2.5 mL/min 流速运行的蠕动泵管路。操作应迅速而谨慎，确保套管针保持原位，且无气泡进入管路或套管针。
- 用溶液 C 灌注肝脏 2 分钟（5 mL 溶液 C）。更换为溶液 D，继续灌注额外 10 分钟（25 mL 溶液 D）。
- 肝脏灌注完成后，将其从腹腔中取出。此时肝脏将非常脆弱且颜色苍白（图 3）。
5. 原代肝细胞的分离
- 从小鼠体内取出肝脏。导管仍与肝脏相连，因此使用镊子夹住带有肝脏的导管，并小心剪断所有筋膜连接。将肝脏转移至含有20 mL预温溶液E的50 mL离心管中。
- 用镊子夹住带有肝脏的导管，通过在管壁周围揉搓肝脏来解离组织，使分离的肝细胞进入缓冲液中。将分离的细胞置于冰上保存。
注意：分离得到的原代肝细胞在冰上可保持数小时的活性。如有需要，可重复步骤4.1至5.2，从另一只供体小鼠中分离原代肝细胞，或直接进入下一步。 - 将一个70 µm尼龙细胞筛置于50 mL离心管上方，过滤分离的细胞悬液。
- 在4 °C条件下，以50 × g 离心5分钟。吸除上清液。为去除死细胞并提高活细胞比例，将沉淀重悬于20 mL含40% Percoll的DMEM中。
- 在4 °C条件下，以50 × g 离心5分钟。吸除含有死细胞的上清液，将沉淀重悬于20 mL溶液E中。
- 在4 °C条件下，以50 × g 离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于10 mL溶液E中。
- 使用台盼蓝染色法检测原代肝细胞的得率和活力。利用Neubauer细胞计数板进行细胞计数，并将细胞浓度调整为3.75 × 105 个活细胞/mL。细胞保持在冰上保存。
6. 三维胶原夹心培养原代肝细胞
- 配制肝细胞培养基（HCM）。向50 mL完全培养基（DMEM，高糖，10% FBS，1%青霉素-链霉素）中加入15 µL胰高血糖素（1 mg/mL）、15 µL氢化可的松（50 mg/mL）和40 µL胰岛素（10 mg/mL）。
- 将2 mL（5 × 105 个细胞/mL）活的原代肝细胞均匀分散至预先包被的3.5 cm培养皿中。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养3小时。重要提示：在将培养皿放入培养箱前，通过向各个方向倾斜培养皿使细胞均匀分布。
- 配制中和的I型胶原蛋白（每3.5 cm培养皿100 µL；即按照上述[步骤2.1]所述所有培养皿所需的足够体积）。使用前置于冰上保存。
- 培养3小时后，小心移除培养基和未贴壁的细胞，向每个3.5 cm培养皿中加入100 µL中和的I型胶原蛋白，以在细胞上形成胶原三明治的上层。将胶原三明治在标准细胞培养条件（37 °C，5% CO2）下继续培养1小时。培养1小时后，小心加入2 mL HCM。
- 培养24小时后，更换为新鲜的HCM培养基。
- 根据胆小管的形成情况，继续培养3–8天。每天在显微镜下观察培养状态（图4）。每隔两天更换一次HCM培养基。
7. 三维胶原夹心结构中原代肝细胞的免疫标记
- 移除肝细胞三明治结构中的培养基，然后用预热的 PBS 轻柔洗涤。用 1 mL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 在室温（RT）下固定三明治结构 30 分钟。
- 固定后，用 2 mL 含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBS-T）洗涤三明治结构，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。
- 用 1 mL 含 0.1 M 甘氨酸和 0.2% Triton X-100 的 PBS 在室温下透化细胞 1 小时。随后用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 使用连接真空抽吸装置的 10 μL 加样枪头轻柔扰动胶原蛋白上层，以确保抗体充分渗透。
- 用含 5% BSA 的 PBS-T（即封闭液）封闭 2 小时。随后加入用封闭液稀释的一抗，于 37 °C 过夜孵育。用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 15 分钟。
- 洗涤后，加入二抗于 37 °C 孵育 5 小时。用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 15 分钟，最后用蒸馏 H2O 洗涤 1 次。
- 使用抗荧光淬灭封片剂（见材料表）封片，用于显微镜观察。
结果
分离小鼠原代肝细胞并接种于三维胶原夹心培养体系中。接种后数小时内，相邻细胞之间开始形成胆小管。细胞形成簇状结构，并在约1天内自组织成较为规则的胆小管网络（图4）。在3–6天内，通常可观察到由5–10个细胞组成的细胞簇，肝细胞完全极化并形成胆小管网络（图4）。
在三维胶原夹心培养体系中，用毒素（乙醇）或细胞骨架调节药物（如blebbistatin、冈田酸）处理原代小鼠肝细胞，可导致肝细胞细胞骨架、胆小管宽度、形态以及胆小管数量发生变化，这些变化通过角蛋白8（肝细胞中最丰富的角蛋白）抗体、鬼笔环肽（标记F-actin）以及紧密连接蛋白ZO-1（zonula occludens-1）抗体进行免疫荧光染色得以显示（图5）。
乙醇处理对角蛋白8的排列仅有轻微影响；然而，它增加了胆小管宽度的扭曲度（从F-肌动蛋白染色可见）及其分布范围（图5）。与未处理的对照组相比，经乙醇处理的胆小管中ZO-1染色信号强度降低，提示乙醇处理后紧密连接有所丧失。使用blebbistatin抑制肌动球蛋白收缩性显著影响了胆小管的形态和数量。与未处理的肝细胞相比，规则的胆小管网络被重组为形态紊乱的胆小管，厚而圆形的胆小管出现频率增加，而细长型胆小管减少（从胆小管宽度的直方图中可见）。
此外，使用冈田酸（OA）处理以抑制磷酸酶，会显著影响角蛋白的物理特性，这一点此前已有报道8,17。OA会改变角蛋白丝的溶解度，因此处理导致角蛋白网状结构发生显著重组，坍塌形成大的核周聚集物。F-肌动蛋白和紧密连接蛋白ZO-1均未定位于任何特定结构，表明胆小管结构几乎完全消失，肝细胞极性完全丧失。与未经处理的对照组相比，残存的胆小管明显变窄，胆小管宽度直方图中可见此现象（图5）。
为了将肝细胞骨架在显微镜下的变化与肝细胞对处理的生化反应相关联，本方案还检测了3D胶原夹心结构上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平（两种常用于肝细胞损伤标志物的肝脏酶）（图6）18。乙醇处理显著升高了ALT和AST的水平，提示存在严重的肝细胞损伤。与冈田酸处理相比，Blebbistatin处理未引起ALT和AST水平的明显变化；而冈田酸处理仅引发轻微的生化改变，表现为ALT水平升高，但AST水平无变化。因此，在体外从肝细胞上清液中测得的肝细胞损伤生化标志物与免疫染色观察到的细胞骨架变化相一致。
图1：实验装置示意图。（A）小鼠呈仰卧位固定，术前置于解剖显微镜下。所有所需外科器械均放置于托盘中。（B）小鼠肝脏灌流过程中灌流系统的布局，显示硅胶管路连接盛有温热缓冲液的储液瓶与正在灌流的小鼠。（C）B的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：打开腹腔及下腔静脉（IVC）插管。 从耻骨区域至前肢处作V形切口以打开腹腔。将皮肤向胸部翻折，以暴露并扩大腹腔。为暴露下腔静脉（IVC），需将肠道和结肠小心地向尾侧移位。（A, B）在进行IVC插管前，应用PBS润湿的棉签轻压肝叶使其向上复位于膈肌处。随后小心分离IVC周围组织，并在靠近肝脏处的IVC周围放置丝线缝合线。图B为图A所示腹腔结构的示意图，标示了肝叶、肠道、下腔静脉（IVC，红色）和缝合线。（C）使用胰岛素注射器（30 G针头弯成45°角）向门静脉（PV，箭头）注射肝素。（D）为进行肝脏灌流，需在紧邻肝脏处（缝合线下方）切开IVC。（E）插入导管后，通过打两个外科结的方式用缝合线固定导管。（F）完全切断门静脉以确保灌流液自由流出，防止肝脏膨胀。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：灌注前后代表性肝脏图像。（A、B）插管肝脏被切除后，在2.5 mL/min的流速下灌注12分钟。注意灌注后肝脏颜色明显变浅（B），与刚切除的肝脏（A）相比有显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：原代小鼠肝细胞的3D胶原三明治培养。 小鼠原代肝细胞在3D条件下培养1、2和3天的代表性明场图像。应注意的是，培养3天后可形成更大且高度有序的细胞簇。方框区域显示约3倍放大的图像。箭头指示胆小管。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：通过免疫荧光显微镜评估细胞在毒性应激下的形态学反应。 原代小鼠肝细胞在三维胶原夹心结构中培养，在培养第3天用毒素（乙醇、blebbistatin或冈田酸）处理。固定后的细胞经染色以显示细胞骨架成分：角蛋白8（绿色）、F-肌动蛋白（红色）和紧密连接蛋白-1（ZO-1，品红色）的免疫荧光信号。毒性处理导致所观察的细胞骨架成分排列紊乱，并减少了胆小管的数量，同时增加了其扭曲程度。在未处理和已处理的肝细胞中测量了胆小管的宽度，并以宽度分布的直方图形式展示。箭头指示胆小管位置。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：三维肝细胞胶原夹心结构体外毒性损伤反应的生化分析。 在经毒素（乙醇、blebbistatin和冈田酸）处理的三维肝细胞胶原夹心结构的上清液中，检测了ALT和AST的水平，二者均为公认的肝细胞损伤标志物。与未处理组相比，处理组细胞中ALT和AST水平升高。数据以算术平均值±标准误（SEM）表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 储存液 A（10 倍浓度） | |
| 试剂 | 终浓度（g/升） |
| NaCl | 80 |
| KCl | 4 |
| MgSO4·7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4·2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
表1：储备液A配方。
| 储存液 B（10 倍浓度） | |
| 试剂 | 终浓度（g/升） |
| NaCl | 69 |
| KCl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4·7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
表2：储备液B配方。
| 溶液 C | |
| 试剂 | |
| 储存液 A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0.1094 g |
| EGTA | 0.0095 g |
| dH2O | 加至 50 mL |
表3：储备液C配方。
| 溶液 D | |
| 试剂 | |
| 储存液 A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0.065 g |
| CaCl2 | 0.0125 g |
| dH2O | 加至 30 mL |
表4：储备液D配方。
| 溶液 E | |
| 试剂 | |
| 储存液 B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0.1 g |
| 葡萄糖 | 0.045 g |
| dH2O | 加至 50 mL |
表5：储备液E配方。
讨论
使用小鼠原代肝细胞培养物对于体外研究具有重要意义，有助于更好地理解肝细胞极性建立、胆小管结构正常形成以及胆汁分泌过程中所涉及的信号传导机制。在二维培养条件下，小鼠原代肝细胞的分离与长期培养面临诸多挑战，这推动了多种技术方法的发展，这些方法在提高细胞分离效率和延长细胞存活时间方面各有优劣。目前普遍认为，原代肝细胞的二维培养仅能在短时间内模拟肝脏生物学的有限特征。因此，尤其是在关注细胞骨架在肝脏生物学中的功能（如药物毒性作用或胆汁转运的空间组织）时，以胶原三明治结构为基础的三维培养已广泛取代二维培养条件。
自20世纪80年代以来，已有多种小鼠肝细胞分离方案被报道，且各有不同改进。其中，两步胶原酶灌注法已在许多实验室中得到广泛应用。在分离流程中加入梯度离心步骤，可有效去除死细胞19,20，并显著提高活细胞数量（本实验中通常可达约93%）。尽管该步骤会延长细胞操作时间并导致细胞得率降低21，但在三维胶原夹心培养中，此步骤对于胆小管网络的正常形成至关重要。此外，在灌注步骤中更关键的是要快速而准确地操作，以缩短细胞处理时间。
其他有助于提高细胞活力及其在三维环境中形成胆小管网络能力的重要因素，包括使用 freshly prepared 溶液以及在灌注过程中避免产生气泡。因此，所有溶液应在小鼠肝细胞分离当天配制，更换溶液时应检查蠕动泵和管路系统。若严格按照本方案操作，原代肝细胞的分离应能成功，获得高产量的活细胞。
长期三维肝细胞培养的另一个关键因素是所用原代肝细胞的初始来源。应使用8至12周龄的动物作为肝细胞的最佳供体。来自较年老动物的肝细胞在长期培养中效果较差，因为这些肝细胞更易发生形态改变、去极化，并停止胆小管网络的形成。此外，将肝细胞接种于由相对高浓度溶液制备并已适当中和的胶原凝胶上，是至关重要的一步。在大多数实验方案中，通常使用约1 mg/mL的浓度。经过多次优化，1.5 mg/mL的浓度最适合长期肝细胞培养，可获得高度有序且形成胆小管的肝细胞。
本方案操作简便，可实现小鼠原代肝细胞的长期培养。代表性结果表明，利用三维培养的小鼠原代肝细胞研究细胞骨架组分在胆小管形成中的作用时，具有广泛的应用前景。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了捷克共和国科学基金会（18-02699S）、捷克共和国卫生部基金会（17-31538A）、捷克科学院机构研究项目（RVO 68378050）以及捷克共和国教育、青年和体育部项目（LQ1604 NPU II、LTC17063、LM2015040、OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 和 OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775）的资助；查理大学（为 K.K. 提供个人津贴）以及布拉格—竞争力 Operational Program 项目（CZ.2.16/3.1.00/21547）的支持。我们感谢捷克共和国布拉格捷克科学院分子遗传学研究所光学显微镜核心设施（由捷克共和国教育、青年和体育部项目 LM2015062 和 LO1419 支持）在本研究中显微成像方面提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 细胞培养皿（TC处理） | Corning | 430165 | |
| 50 mL 离心管，SuperClear，超高速性能 | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm 尼龙细胞筛 | Biologix | 15-1070 | |
| 白蛋白第五组分 | ROTH | 8076.4 | |
| 动脉切开插管（1 mm） | Medtronic | 31001 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 大鼠尾胶原 I 型（3 mg/mL） | Corning | 354249 | |
| 胶原酶（来自溶组织梭菌） | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+)葡萄糖一水合物 | ROTH | 6780.1 | |
| 解剖显微镜 | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM，高糖 | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| 胰高血糖素 | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| 甘氨酸 | Pufferan | G 05104 | |
| 肝素（5000 U/mL） | Zentiva | 8594739026131 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 胰岛素注射器（30G） | BD Medical | 320829 | |
| 七水合硫酸镁 | ROTH | T888.1 | |
| 显微外科镊 | FST | 11252-20 | |
| 显微外科镊 | FST | 11251-35 | |
| 显微外科剪 | FST | 15025-10 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| 氯化钾 | ROTH | 6781.1 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| 圆形盖玻片，直径 30 mm，厚度 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| 黑色编织丝线 | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| 氯化钠 | ROTH | 3957.1 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 磷酸氢二钠二水合物 | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| 2 mL 注射器 | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 水浴锅 | Nuve | NB 9 | |
| Whatman 尼龙膜滤器，孔径 0.2 μm，直径 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH 指示试纸，pH 6.0–8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
参考文献
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