Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.
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Artigo de método
Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia intravital (IVM) é amplamente utilizada para monitorar processos fisiológicos e fisiopatológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O protocolo atual representa um método prático e reprodutível para visualizar a interação com o endotélio leucócito, levando ao recrutamento de leucócitos no tecido derivado do músculo esquelético dentro do organismo intacto do camundongo. O modelo é aplicável a todos os campos de pesquisa que se concentram na ativação de granulócitos e seu papel na doença.
Fornecemos um protocolo passo a passo para orientar através do método e destacar possíveis armadilhas e dificuldades técnicas. O protocolo abrange os seguintes aspectos: configurações experimentais e material necessário, anestesia do camundongo, dissecção do músculo cremaster, bem como cânula traqueal e carótida, gravações ivm e análise off-line. Formatos de dados como leucócitos aderentes, fluxo de rolamento (RF) e fração de fluxo de rolamento (RFF) são explicados detalhadamente e aplicativos apropriados são discutidos. Os resultados representativos dos camundongos mdx deficientes de distrofina são fornecidos na seção de resultados.
O IVM é uma ferramenta poderosa para avaliar o recrutamento de leucócitos em um ambiente in vivo; no entanto, delinear, por exemplo, a função endotelial e leucócito pode exigir uma combinação com configurações ex-vivo, como experimentos de câmara de fluxo. Além disso, o histórico genético de animais de interesse pode influenciar muito o recrutamento de base, exigindo ajuste fino individual do protocolo fornecido. Apesar de suas limitações, o IVM pode servir como uma plataforma para traduzir prontamente achados in vitro em um organismo vertebrado vivo.
Introdução
A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta comumente aplicada no campo da biologia leucócito. O recrutamento de leucócitos segue uma cascata de eventos bem definidos iniciados pela captura de leucócitos, rolamento e adesão à parede endotelial, e finalmente transmigração e extravasação de leucócitos para o local real de inflamação1. Cada passo é mediado e controlado por várias quimiocinas (por exemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por exemplo, LFA-1, Mac-1) e moléculas de adesão celular endotelial correspondentes (por exemplo, ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectin)2,3. A interação de diferentes locais reguladores, fatores de controle e mediadores da cascata de recrutamento de leucócitos como receptor de produtos finais de glicação avançada (RAGE), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), liga de motivos C-X-C (CXCL)1/2 e seu receptor CXCR2 foram descobertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.
O método do IVM tem sido descrito para muitos órgãos e tecidos diferentes, como o intestino10,pele11,linfonodos12,o saco de gema embrionária13 e outros. No entanto, o método mais estudado do IVM é o modelo cremaster, descrito pela primeira vez em ratos14. Embora ainda seja usado em ratos15,o método é hoje aplicado principalmente em camundongos devido à alta abundância de diferentes linhas transgênicas. Nosso grupo destacou recentemente o papel potencial do cremaster IVM no campo das muscolopatias inflamatórias como a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) estudando camundongos mdx deficientes de distrofina16. Devido à sua fina composição de fibras entrelaçadas e de fácil acesso, o músculo cremaster representa o músculo candidato ideal a ser estudado como um conjunto de montagem usando microscopia leve ou fluorescente. O recrutamento e extravasação de leucócitos ocorre principalmente em venules pós-capilar, que podem ser facilmente identificados em uma camada muscular contínua no músculo cremaster.
A vantagem da imagem in vivo em comparação com outros ensaios in vitro é seu contexto biológico em um organismo vivo. Ao mesmo tempo, delinear contribuições específicas de células para o recrutamento alterado de leucócitos pode exigir modelos adicionais in vitro, como câmaras de fluxo ou ensaios endoteliais. A combinação de múltiplos métodos produzirá dados mais convincentes. Os cientistas devem estar cientes das limitações do modelo cremaster, pois qualquer manipulação cirúrgica levará ao aumento do tráfico e recrutamento de leucócitos. Portanto, o recrutamento de base é difícil de estimar com este método. Apesar de sua ampla aplicação, o IVM do cremaster pode ser desafiador e uma nova configuração pode levar tempo e recursos para estabelecer. Agora fornecemos um protocolo fácil que ajudará a evitar alguns dos erros comuns no IVM. Além disso, serão discutidas limitações e os métodos complementares serão destacados quando aplicável.
O IVM do cremaster representa uma abordagem ideal a ser implementada no campo dos estudos inflamatórios e infecciosos. Mais especificamente, o modelo cremaster pode ser de alto interesse para os cientistas que estudam biologia muscular esquelética no contexto da doença inflamatória.
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Protocolo
Os animais foram alojados sob condições controladas e específicas sem patógenos no IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo IRB local e pelo Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemanha.
1. Administração de anestesia
- Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal (i.p.) de 125 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina.
- Coloque e fixar o mouse em uma posição dorsais reclinada em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse (36,5-38 °C). Use uma sutura estéril não absorvível (6/0) para enrolar um laço simples ao redor dos dentes frontais e fixar as extremidades de junção da sutura à almofada de aquecimento. Esta fixação visa manter a boca aberta, a fim de evitar distúrbios respiratórios.
- Verifique se o mouse tem a profundidade apropriada da anestesia por meio de uma pitada interdigital do dedo do dedo (a retirada não deve ser vista).
- Uma vez que a anestesia suficiente é alcançada, prossiga para a preparação cirúrgica. Confirmar repetidamente a anestesia ao longo do experimento em andamento a cada 30 min. Re-administrar drogas como descrito acima, se necessário.
- Solução de sal fisiológico equilibrado (PSS, composição: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) com 5% de CO2/95% N2 durante 15 minutos. Bolha contínua pss com 5% CO2/95% N2 durante todo o experimento e manter a 37 °C.
2. Preparação cirúrgica da traqueia e artéria carótida (opcional)
- Disseque a pele da área do pescoço puxando suavemente a pele com pinças na linha média. Use uma tesoura para aplicar um corte circular de 1-2 cm de diâmetro para dar espaço suficiente para a preparação cirúrgica.
- Disseque cuidadosamente os tecidos musculares, gorduras e conjuntivos ao redor usando pinças.
- Faça um corte transversal (~ 1,3 mm) na traquéia usando uma pequena tesoura cirúrgica e introduza um tubo de polietileno (I.D. x O.D. 0,034" x 0,050") dentro da extremidade caudal da traqueia para fixar as vias aéreas superiores.
- Fixar o tubo localizado na traqueia por uma única sutura circular (6/0 USP).
- Localize a artéria carótida ao longo do lado direito da traqueia e disseque o tecido circundante da parede da artéria carótida. Alternativamente, a jugular ou também a veia traseira poderia ser usada para acesso i.v. Tente evitar lesões no nervo vagal, pois ele está localizado de perto.
- Passe duas peças de sutura (6/0) por baixo da artéria carótida. Coloque a primeira sutura craniana proximal, perto da bifurcação das artérias carótidas e amarre-a permanentemente. A segunda sutura será localizada a cerca de 5-8 mm distal da primeira e depois será usada para fixar o tubo na artéria carótida. Não amarre ainda.
- Prepare um tubo de polietileno (I.D. x O.D. 0,011" x 0,024") com um comprimento de 30 cm, dobrando a parte final a uma agulha de seringa de 1 mL cheia de salina (0,9% NaCl). Descarga rigorosa é importante para evitar a embolização do ar durante a preparação.
- Use um grampo de vaso de 7 mm para fixar a artéria carótida distalmente da segunda sutura.
- Realize um pequeno corte transversal (~0,5 mm) na artéria carótida e introduza o tubo de polietileno estéril. Fixar o tubo na artéria usando a segunda sutura preparada antes.
- Remova o clipe do vaso e aplique delicadamente um pouco de tensão na seringa conectada ao tubo de polietileno. Este cateter carótida agora pode ser usado para administrar drogas ou colher amostras de sangue, se necessário, até mesmo o monitoramento da pressão arterial ou da freqüência de pulso é possível com os respectivos dispositivos.
3. Preparação cirúrgica do músculo cremaster
- Transfira o mouse na almofada de aquecimento (juntamente com a almofada de aquecimento) para a estrutura de plástico feita sob medida que segura o palco para microscopia posterior. Oriente o rato com seu escroto voltado para o estágio do microscópio.
- Reavaliar a profundidade da anestesia antes de prosseguir; re-administrar uma dose de meio quarto a meia de anestesia, se necessário.
- Localize o escroto, segurando-o em sua parte mais distal usando pinças, puxe-o suavemente e corte uma seção circular de pele escrotal com cerca de 5 mm de diâmetro. Certifique-se de não prejudicar as estruturas subjacentes, como o músculo cremaster. Certifique-se de manter o tecido aberto bem hidratado com solução salina.
- Disseque tecido conjuntivo solto usando duas pinças e localize ambos os testículos.
- Segure um testículo distalmente e comece a puxá-lo suavemente, removendo o tecido conjuntivo circundante passo a passo.
- Uma vez que o testículo é exteriorizado, fixe sua extremidade distal para o anel de borracha ao redor do palco. Após a exteriorização, hidrate o tecido com solução salina durante todo o processo.
- Passo crítico: Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo sem prejudicar o músculo cremaster subjacente. O excesso de tecido conjuntivo pode obstruir a visão em microscopia posterior e pode produzir imagens embaçadas.
- Fixar a parte distal do testículo para baixo e abrir o músculo cremaster por um pequeno corte transversal (cerca de 1 mm), seguido de incisão longitudinal do muito distal para a extremidade proximal. Como resultado, o músculo cremaster deve abrir esfericamente. O vaso macroscopicamente visível não deve ser cortado, pois isso pode afetar a hemodinâmica.
- Espalhe cuidadosamente o músculo sobre o palco de vidro e fixe-o no anel de borracha. Certifique-se de não tocar ou prejudicar a região central, pois a microscopia será realizada aqui.
Atenção: O excesso de estiramento pode obstruir o fluxo sanguíneo. - Fixar o teste restante é de lado para dar acesso à região de interesse. Certifique-se de umedecer com PSS repetidamente para evitar a secagem. O músculo montado está pronto para microscopia.
4. Microscopia intravital
- Coloque o músculo cremaster montado no microscópio vertical e realize a microscopia usando um objetivo de 40x.
- Adquira dados e exporte usando espectrografia de imagem de alto throughput.
- Executar gravações em superfusão contínua com PSS17pré-aquecidos (35-37 °C) Aplique superfusão por um pequeno tubo que foi colado ao objetivo vertical do microscópio para permitir gotejamento contínuo de PSS ao lado do objetivo até o tecido muscular.
- Identificar venulos pós-capilar (confluência de dois vasos menores) e medir a microcirculação em venos com diâmetro de 20-40 μm.
- Registre imagens de alta resolução da microcirculação do músculo cremaster em um intervalo de tempo de 30 s. Como pode haver uma leve contração e relaxamento do tecido muscular durante a gravação, certifique-se de ajustar continuamente o foco. Geralmente, o mouse tende a apresentar circulação estável por cerca de 2 horas. É possível adquirir várias gravações de diferentes embarcações de diferentes regiões. Um ou ambos testis podem ser usados posteriormente.
NOTA: Como este é um modelo de inflamação, as formas comuns de indução são: aplicação sistêmica ou injeção escrotal local de mediadores pró-inflamatórios, bem como superfusão com, por exemplo, N-Formylmethionyl-leucil-fenilanilinina (fMLP). A estimulação tnf-α local é comumente usada para desencadear o recrutamento de leucócitos; A endotoxemia induzida pelo LPS é um modelo de inflamação sistêmica grave do SIRS.
5. Visualização de leucócitos
NOTA: Leucócitos aderentes e rolamentos podem ser facilmente vistos sem maior visualização. Para determinar a velocidade da linha central dos leucócitos em movimento livre, realize a coloração diferencial.
- Se os camundongos rotulados eGFP forem usados, analise-os diretamente por microscopia de fluorescência.
- Para cepas de mouse não-eGFP rotuladas, use coloração de rhodamina.
- Administrar a rhodamina 6G a 0,2 mg/kg de peso corporal. Doses repetidas podem ser necessárias para alcançar intensidades de coloração suficientes. Certifique-se de manter pequenos volumes, pois volumes maiores podem afetar parâmetros hemodinâmicos.
- Para coloração instantânea de leucócitos, administre a mancha através da artéria carótida. Se a dissecção da artéria carótida não tiver sido realizada, pode ser obtida uma coloração suficiente pela aplicação i.p. utilizando a mesma dose18. Como alternativa ao cateterismo da artéria carótida, qualquer outro cateterismo venoso pode ser realizado.
NOTA: Tenha em mente que a coloração de rhodamina, ao contrário da rotulagem eGFP, mostra a decomposição temporal da intensidade da fluorescência, bem como um máximo de coloração global de cerca de 80% dos leucócitos em concentrações mais elevadas. - Visualize livremente a rhodamina manchada de leucócitos por microscopia de fluorescência.
6. Fim do experimento
NOTA: O tempo total estimado para executar este protocolo deve ser de 90 a 150 minutos.
- Acabar com o experimento com eutanásia por luxação cervical.
- Para análises posteriores, como a transmigração, fixe o músculo cremaster em PFA enquanto ainda se estica no palco e manchado para histologia conforme necessário.
7. Análise offline
- Analise os seguintes parâmetros como contagens simples durante a reprodução do vídeo.
- Calcular fluxo de rolamento [número/min]: número de células de rolamento passando por uma linha imaginária/min
- Calcular adesão [número/mm2]: número de células adesivos à parede do vaso dentro do campo de visão ≥ 30 s/superfície vascular [mm2].
- Meça os seguintes parâmetros hemodinâmicos e microvasculares medidos utilizando-se imageJ.
- Calcule o diâmetro do vaso [μm] como o diâmetro da parede interna.
- Calcule o comprimento do vaso [μm] como o comprimento da linha central do vaso.
- Calcule a
![Símbolo de micrômetro por segundo [μm/s] para medição de velocidade em equações científicas.](/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg "figure-protocol-1")
velocidade da linha central obtida a partir da análise de vídeo quadro-a-quadro de leucócitos em movimento livre na linha central.
- Use as seguintes equações como uma estimativa.
- Calcular a superfície vascular em [mm2]: comprimento do vaso [μm] x diâmetro do vaso [μm] x π x 10-6.
- Calcular a taxa
de cisalhamento da parede: 4,9 x (velocidade da linha central de 8 x x 0,625/diâmetro do vaso [μm]). - Calcular a velocidade média do fluxo sanguíneo : velocidade da linha central x 0,625.
Calcular fluxo total de leucócitos: contagem de leucócitos sistêmicos ![Medição de concentração em unidades de número por microlitro [número/μL], usada em cálculos de laboratório.](/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg "figure-protocol-7")
x (velocidade média de fluxo sanguíneo x 60/1000) x π x 
.- Calcular fração de fluxo de rolagem [%]: fluxo de fluxo de rolagem/fluxo total de leucócitos x 100.
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Resultados
IvM de acordo com o protocolo fornecido produzirá insights únicos sobre a cascata de recrutamento de leucócitos no músculo esquelético. A seção de resultados se concentrará nos resultados típicos obtidos pelo IVM e destacará possíveis problemas que podem encontrar.
A configuração experimental para microscopia intravital está descrita na Figura 1. A preparação do músculo cremaster e a remoção do tecido conjuntivo são cruciais para obter imagens microscópicas focada...
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Discussão
O IVM como método tem sido amplamente utilizado para estudar diferentes tipos de células em diferentes órgãos e tem sido extensivamente descrito e discutido19. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma abordagem eficiente para configurar e executar ivm no músculo cremaster. A prática do método produzirá resultados confiáveis e reprodutíveis. Assim, o planejamento e a padronização são fatores-chave para dominar a técnica. Acima de tudo, a técnica é muito dependente de parâmetros hemodinâmico...
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) 01GL1746E como parte do Consórcio PRIMAL. Os autores reconhecem Britta Heckmann e Silvia Pezer por uma assistência técnica habilidosa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anestesia. Genérico / IUPAC Nome: cetamina |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Artigo-nr.: 1205 | anestesia. Nome genérico / IUPAC: xilazina (como cloridrato) |
| Solução salina | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | preparo cirúrgico. Genérico / IUPAC Nome: cloreto de sódio |
| Seringa agulha Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | preparação cirúrgica |
| Sutura 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | preparação cirúrgica |
| Tubo de polietileno #10 | BD | GmbH Fornecedor nº 427401 | preparação cirúrgica |
| Tubo de polietileno #90 | BD | GmbH Fornecedor nº 427421 | preparação cirúrgica |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Número CAS 989-38-8 | coloração de leucócitos. Nome genérico / IUPAC: etil 2-[3-(etilamino)-6-etilimino-2,7-dimetilxanteno-9-il]benzoato |
| Equipamento de Configuração | |||
| Microscópio vertical | Olympus | microscopia | BX51W1 |
| Zeiss | Achroplan 40 × /0,80 W | microscopia | |
| Software ImSpector Lavision | Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, EUA | ver. 1.51j8 | software |
Referências
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422(2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678(2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973(2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457(2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874(2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
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Reimpressões e permissões
