Bactérias gram-negativas produzem duas membranas espacialmente segregadas. A membrana externa é particionada da membrana interna por um periplasma e uma camada peptidoglicana. A capacidade de isolar as bicamadas duplas desses micróbios tem sido fundamental para a compreensão de sua fisiologia e patogênese.
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Artigo de método
Separação do envelope celular para bactérias gram-negativas em frações de membrana interna e externa com ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este método funciona dividindo o envelope de bactérias Gram-negativas em frações totais, internas e externas (OM) e conclui com ensaios para avaliar a pureza das bicamadas. O OM tem uma densidade global aumentada em comparação com a membrana interna, em grande parte devido à presença de lipooligossacarídeos (LOS) e lipopolissacarídeos (LPS) dentro do folheto externo. As moléculas de LOS e LPS são glicrarídeos anfipáticos que possuem uma estrutura semelhante, que consiste em um lipídio-A disaccharolipid e core-oligossacarídeo substitutivo. No entanto, apenas as moléculas de LPS são decoradas com uma terceira subunidade conhecida como O-polissacarídeo, ou O-antígeno. O tipo e a quantidade de glicolipídios presentes afetarão a densidade de OM de um organismo. Portanto, testamos se as membranas de bactérias com conteúdo glicolilílipídico variado poderiam ser isoladas da mesma forma usando nossa técnica. Para os organismos produtores de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium e Escherichia coli,as membranas foram facilmente isoladas e a moiety de o-antígeno LPS não impactou a particionamento bicamada. Acinetobacter baumannii produz moléculas de LOS, que têm uma massa semelhante às moléculas de LPS deficientes de O-antígeno; no entanto, as membranas desses micróbios não puderam ser inicialmente separadas. Nós raciocinamos que o OM de A. baumannii era menos denso que o de Enterobacteriaceae, de modo que o gradiente de sacarose foi ajustado e as membranas foram isoladas. A técnica pode, portanto, ser adaptada e modificada para uso com outros organismos.
Introdução
As bactérias gram-negativas produzem duas membranas que são separadas por um espaço periplasmático e uma parede celular peptidoglicana1. A membrana interna (IM) envolve o citosol e é um bicamada simétrico de fosfolipídeos. Peptidoglicano protege contra a pressão de turgor e fornece a bactéria com uma forma celular, e é anexado à membrana externa (OM) por lipoproteínas2,3. O OM envolve o periplasma e é predominantemente assimétrico. O folheto interno consiste em fosfolipídios e o folheto externo consiste de glicolipídios conhecidos como lipooligossacarídeos (LOS) ou lipopolissacarídeos (....
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Protocolo
1. Reagentes gerais e preparação de mídia para extração de membrana
- Mídia de crescimento bacteriano: Prepare e esterilize 1 L de caldo em um frasco de 2 L completamente limpo e autoclavdo.
- Tampão de resuspensão geral (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Dissolver 6,05 g de base tris em 30 mL de H2O. Ajuste pH para 7.5 com 5 M HCl. Ajuste o volume final para 50 mL com Ultrapure H2O.
- Estoque mestre da solução de quelação divalente (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Adicionar 18,6 g de tetraacetato de etileno dissódico·2H2O a 80 mL de H2O. Mexa vigorosamente e ajuste o pH a 8,0 com NaOH. Ajuste o volume final ....
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Resultados
Esta técnica fornece um meio eficaz para isolar os IMs e OMs para bactérias Gram-negativas. Ilustra-se um esboço de todo o procedimento (Figura 1). Em geral, a normalização das culturas para um OD600 de 0,6-0,8 em 1 L de mídia, ou a colheita entre 6,0 e 8,0 x 1011 células bacterianas garantirá que a quantidade apropriada de material de membrana seja coletada para posterior separação.
Ao averiar as bactérias e ultracentrifugiar o lysato, uma p.......
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Discussão
Esse método continuará auxiliando os pesquisadores na compreensão do papel do envelope celular na fisiologia bacteriana e na patogênese. Seguindo os passos sequenciais de ultracentrifugação, pode-se obter uma fração total purificada, interna e OM. Essas membranas podem ser submetidas isoladamente para testar hipóteses relacionadas à localização e função da proteína da membrana, transporte e tráfico através do periplasma e à composição dos bicamadas individuais sob várias condições ambientais. Estudos biológicos explorand.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesse declarado.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por P20GM10344 e R01AI139248 concedido a Z. D. Dalebroux.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frascos de centrífuga de 1 L, PC/PPCO, super velocidade, com tampa de vedação, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| Frasco de armazenamento de mídia Pyrex de 1 L com tampa de alta temperatura | VWR | 10416-312 | |
| Frasco Erlenmeyer de 2.000 mL, boca estreita | VWR | 10545-844 | |
| Géis de proteína pré-moldados mini PROTEAN de 4-20%, 12 poços | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Amostra Laemmli Tampão 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL tubos de centrífuga de polipropileno estéril | VWR | 89049-174 | |
| mL Homogeneizador de tecidos Dounce com dois pilões de vidro | VWR | 71000-518 | |
| Conjunto de garrafas de policarbonato de 70 mL Beckman | Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Ágar em pó | VWR | A10752 | |
| B10P Bancada Medidor de pH com sonda | de pH VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (versão de bancada) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA sal dissódico di-hidratado 99,0-101,0%, cristais, ultrapuro Biorreagente Grau de biologia molecular, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Rotor de ângulo fixo Fiberlite F13-14 x 50cy | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Ácido clorídrico 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Caldo Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Miller | VWR | 214906 | |
| Ovo, Grau Ultra Puro | VWR | VWRV0063 | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 - IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Produtos Pharmco ÁLCOOL PURO 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Solução de fenol, equilibrada com 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, BioReagent, para biologia molecular | Sigma - Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, sem EDTA | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Grau de Biologia Molecular | New England Biolabs | P8107S | |
| Hidróxido de sódio ≥ 99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Centrífuga Sorval RC 6 Plus | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Rotor de Balde Oscilante | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS, Trometamol) ≥ 99,9% (base seca), grau de biologia molecular de biorreagente ultrapuro, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Tipo 45 Ti Rotor de Titânio de Ângulo Fixo | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| 14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
Referências
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).<....
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Reimpressões e permissões
