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Artigo de método

Gravação eletrofisiológica sem fio dos neurônios por tetrodes móveis em peixes livremente da natação

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DOI:

10.3791/60524

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26 de novembro de 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, 2Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Uma nova técnica sem fio para a gravação de sinais neurais extracelulares do cérebro de peixinho dourado livremente natação é apresentado. O dispositivo de gravação é composto por dois tetródos, um microdrive, um registrador de dados neurais e uma caixa impermeável. Todas as peças são feitas medida, exceto para o registrador de dados e seu conector.

Resumo

Os mecanismos neurais que regem o comportamento dos peixes permanecem em sua maioria desconhecidos, embora os peixes constituam a maioria de todos os vertebrados. A capacidade de registrar a atividade cerebral de peixes em movimento livre avançaria a pesquisa com base neural do comportamento dos peixes consideravelmente. Além disso, o controle preciso do local de gravação no cérebro é fundamental para estudar a atividade neural coordenada em todas as regiões do cérebro de peixes. Aqui, apresentamos uma técnica que grava sem fio do cérebro de peixes nadando livremente enquanto controlamos a profundidade do local de gravação. O sistema é baseado em um madeireiro neural associado a um novo implante compatível com água que pode ajustar o local de gravação por tetés controlados por microdrive. As capacidades do sistema são ilustradas através de gravações do telencefalon de peixinho dourado.

Introdução

Os peixes são o maior e mais diversificado grupo de vertebrados, e como outros vertebrados eles exibem habilidades cognitivas complexas, como navegar, socializar, dormir, caçar, etc. No entanto, os mecanismos neurais que regem o comportamento dos peixes permanecem em sua maior parte desconhecidos.

Nas últimas décadas, gravações extracelulares de peixes imobilizados foram implementadas principalmente para investigar diferentes aspectos da base neural do comportamento1,2. Embora esta técnica seja apropriada para alguns sistemas sensoriais, a investigação de todo o espectro da base neural de comportamento é difícil, se não impossível, em animais imobilizados. Os primeiros avanços envolveram a gravação das células Mauthner de peixes de natação amarrados3,4. No entanto, as células Mauthner são desproporcionalmente grandes e as amplitudes potenciais de ação registradas, que podem ir tão alto quanto alguns mV, facilitam a gravação. Mais tarde, Canfield et al. descreveu uma prova de conceito ao usar um animal amarrado para gravar a partir do telencefalon depeixes 5. Outra técnica recente para o registro da atividade neural a partir de peixes é a imagem de cálcio (ver comentários de Orger e de Polavieja6, e Vanwalleghem et al.7). Esta técnica foi desenvolvida para uso com larvas de zebrafish porque a pele e o crânio são transparentes durante o estágio larval. No entanto, esta técnica não pode ser usada para estudar comportamentos complexos em estágios posteriores de desenvolvimento.

Aqui, apresentamos uma nova técnica para a gravação da atividade neural extracelular dos cérebros dos peixes nadadores livremente. Esta é uma versão modificada do protocolo descrito em Vinepinsky et al.8. A principal inovação é a adição de um microdrive que possibilita controlar a posição dos eletrodos após a cirurgia. A técnica é projetada para a gravação do telencephalon do goldfish usando um jogo dos tetrodes que são conectados a um registrador neural dos dados através de uma microdrive. Toda a configuração é sem fio e ancorada no crânio do peixe. O peso específico do sistema é igualado ao peso específico da água, adicionando um pequeno flutuador que permite que os peixes nadem livremente.

A técnica é baseada no uso de um registrador de dados neural que amplifica, digitaliza e armazena o sinal em um dispositivo de memória a bordo. O sistema de telemetria madeireiro é usado para iniciar e parar as gravações, e para sincronização com a câmera de vídeo. Neste protocolo, um madeireiro neural de 16 canais é usado, embutido em uma caixa impermeável junto com o microdrive.

A montagem de microdrive é fabricada a partir de dois componentes principais: o microdrive em si e a carcaça de microdrive (Figura 1A,B). A habitação contém o microdrive e os tetrodes, e também atua como a âncora entre o crânio ea caixa madeireiro (Figura 1C). A caixa de registrador de PVC é fabricada usando um processo de máquina e é selada usando um Anel O(Figura 1E-G, veja também figura suplementar 1, Figura Suplementar 2e Figura Suplementar 3 para um diagrama tridimensional [3D]). Em uma extremidade, um pedaço de espuma de poliestireno é anexado à caixa de cabeçudo para compensar o peso do implante e fornecer o peixe com um implante neutro em flutuabilidade. A construção do microdrive descrito no protocolo segue o procedimento apresentado por Vandecasteele et al.9 com uma modificação para anexar o microdrive à habitação (Figura 1A). Todos os passos principais são apresentados.

O procedimento descrito no protocolo para preparar o crânio de peixe é semelhante ao apresentado em Vinepinsky et al.8 e é descrito brevemente no protocolo. Um dia após a cirurgia, os peixes são normalmente totalmente recuperados dos efeitos da anestesia e estão prontos para os experimentos comportamentais. Observe que a localização do téts pode ser ajustada girando o parafuso de microdrive. O parafuso tem um espaçamento de 300 μm por rotação completa e um avanço de 75 μm é recomendado até que a localização do cérebro alvo seja atingida. Um atlas cerebral apropriado deve ser consultado para atingir a região específica do cérebro de interesse. É aconselhável testar a impedância do elétrodo cada vez que os peixes são anestesiados para a bateria ou a recolocação do cartão de memória.

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Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser aprovados pelos comitês de ética locais sobre bem-estar animal (por exemplo, IACUC).

1. Construção da habitação Microdrive

  1. Para construir a habitação, corte uma placa de bronze de 1 mm de largura em uma placa de 19 mm x 29 mm x 1 mm usando uma serra. Corte duas fendas de 5,5 mm em cada um dos lados longos perpendiculares à borda, de modo que cada fenda é de 6,5 mm de distância dos lados estreitos (Figura 2A).
  2. Usando alicates, dobre a área entre as fendas nos lados longos para dentro, em seguida, dobre a parte inferior para dentro e o lado superior para fora para obter a habitação (Figura 2B,C).
  3. Usando uma broca de 3 mm, faça buracos para parafusos na carcaça do microdrive.
    Nota: Estes furos serão usados mais tarde para unir a carcaça à caixa do logger(figura 2D).
  4. Soldar os lados da habitação.
  5. Usando um arquivo circular fino, gerar um pequeno, 1,5 mm de raio, fenda semicircular na parte inferior da habitação (Figura 2E).
    Nota: Isto será usado mais tarde para introduzir o tubo de aço inoxidável para guiar os elétrodos.
  6. Use um pedaço de broca de 1 mm para fazer um buraco na parte de trás da habitação para os tetéides (Figura 2F).
    Nota: Um modelo 3D da habitação é encontrado no arquivo housing.stl suplementar.

2. Construção do Microdrive

  1. Usando um cortador, quebre uma peça de três pinos de uma única linha faixa de cabeçalho de alfinete masculino(Figura 1H). Usando alicates, retire o pino do meio.
  2. Usando um cortador, corte os pinos restantes para 10 mm de comprimento (2 mm a menos do que o comprimento do parafuso). Outra possibilidade é usar um parafuso mais longo (ver passo 2.4).
  3. Faça um buraco usando uma broca #65 pouco através do buraco do pino do meio. Faça um fio usando um toque de 00 a 99.
  4. Monte o microdrive e as placas de latão (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, ver Figura Suplementar 4) de tal forma que as placas de latão estão tocando os pinos. Insira um parafuso (#00-90 cabeça redonda, 12 mm, bronze) através da primeira placa de latão, em seguida, através do fio de cabeçalho do pino e a segunda placa de latão. Finalmente, coloque uma porca no parafuso e aperte suavemente o microdrive montado.
  5. Soldar os pinos junto com as placas de bronze, e a porca com a ponta do parafuso.
  6. Soldar o microdrive na carcaça do microdrive em quatro pontos nos lados das placas de bronze do microdrive.
  7. Corte um tubo de aço inoxidável de 6 mm de comprimento com um diâmetro interno de 1,5 mm e outro tubo de aço inoxidável 3 mm de comprimento com um diâmetro interno de 1,2 mm. polonês as extremidades dos tubos para evitar pontas afiadas.
  8. Glue o tubo de 6 mm de comprimento para a pequena fenda semicircular na parte inferior da habitação microdrive usando epóxi. Glue o aço inoxidável de 3 mm de comprimento para o cabeçalho pino, alinhadocom o tubo de 6 mm de comprimento na habitação.
  9. Corte dois segmentos de tubos de silicone de 5 cm de comprimento com diâmetro de 0,64 mm e um tubo de poliimida de 5 cm de comprimento com diâmetro de 0,250 mm.
  10. Insira os três tubos nos dois tubos de aço inoxidável. Cola os tubos ao tubo de aço inoxidável ligado ao cabeçalho pino usando cola de cianoacrilato. Parafuso o microdrive todo o caminho para cima e cortar o excesso de tubos da parte superior e inferior dos dois tubos de aço.
    Nota: O microdrive com a habitação está agora pronto para uso (Figura 1C).

3. Preparando a matriz do tetrode

  1. Para fabricar um implante de duas com quatro eletrodos em cada tetéde, prepare oito fios, cada 12 cm de comprimento, Forvar isolado, de 25 μm de diâmetro de arame de tungstênio.
    Nota: O mesmo projeto pode acomodar quatro tetés.
  2. Coloque um titular para uma placa de interface de eletrodo de 16 canais (EIB-16) PCB (ver Tabela de Materiais)o microscópio.
  3. Usando uma pinça de ponta macia e um isqueiro, retire o revestimento de cada um dos oito fios de um lado usando a chama.
    Nota: Isto é para garantir que o fio será devidamente conectado ao conector PCB mais tarde.
  4. Empurre um fio em um dos buracos no BeI-16 com o lado revestido no buraco. Coloque um alfinete e pressione-o usando alicates. Verifique a conectividade medindo a resistência entre o pino e o lado não revestido do fio.
    Nota: A resistência está na ordem de dezenas de Ohms.
  5. Repita o passo 3.4 com todos os oito fios.
  6. Fita dois grupos de quatro fios juntos usando fita adesiva na extremidade de cada fio.
    Nota: Cada grupo será colado mais tarde para formar um tetrode.
  7. Corte um pedaço de fio de tungstênio 12 cm de comprimento com um diâmetro de 50 μm. Conectá-lo a uma das conexões DOIB-16.
    Nota: Este fio servirá como o eletrodo de referência.
  8. Corte dois fios de prata nus com 12 cm de comprimento com um diâmetro de 75 μm que servirá como motivo para o madeireiro de gravação. Soldar os dois fios para a conexão de terra no BEI-16.
  9. Segure o BEI-16 acima de um dispositivo de giro motorizado e coloque a fita adesiva de um grupo de quatro fios no dispositivo de ajuste motorizado. Aplique 130 rodadas no sentido horário, seguida por 20 rotações no sentido horário. Aplique cola de cianoacrilato para cobrir o tetrode.
  10. Espere a cola para curar. Corte o tetrode perto da fita adesiva.
  11. Repita os passos 3.9 e 3.10 com o segundo tetrode.
    Nota: Isso produz a matriz de dois tetrodes acabados(Figura 1D).

4. Montagem do implante

  1. Dane-se o microdrive todo o caminho.
  2. Usando 1 x 3M Phillips parafusos de cabeça redonda, anexar o BeI-16 para a placa de PVC.
  3. Usando pinças de extremidade macia, puxe todas as e fios através do buraco na frente da tampa da caixa de logger.
  4. Usando os parafusos de 2 x 6M Phillips cabeça plana, anexar a placa de PVC para a tampa da caixa de logger. Mantenha o conector DO BEI-16 na orientação correta para que o madeireiro possa ser montado no BEI-16. Certifique-se de que o BeI-16 está em vigor para evitar artefatos de movimento no sinal gravado.
  5. Selar os fios para a caixa usando epóxi. Aplique o mínimo possível, porque a vedação primária será feita pela temperatura ambiente vulcanização (RTV) mais tarde.
  6. Anexe a carcaça do microdrive à tampa da caixa do logger usando parafusos de 2 milímetros.
  7. Passe os tetródos e todos os fios através do buraco na parte de trás da habitação microdrive. Enfie os tetrodes através dos dois tubos de silicone no microdrive. Thread o fio de tungstênio 50 μm através do tubo de poliimide no microdrive.
  8. Cole as e fios em seus tubos aplicando cola de cianoacrilato na extremidade superior dos tubos, para garantir que o movimento seja consistente com o microdrive. Dane-se o microdrive todo o caminho até o topo.
  9. Aplique petróleo macio (ver Tabela de Materiais)no tetéide exposto e fios dentro da carcaça microdrive para evitar o movimento.
  10. Corte uma janela inferior da placa de Petri de 12 mm x 14,5 mm usando uma lâmina de barbear aquecida. Anexar a janela para a frente da habitação microdrive com epóxi. Mantenha os fios do chão do lado de fora da janela.
  11. Aplique o revestimento de RTV aos tetrodes e aos fios expor entre a tampa da caixa do logger e a carcaça do microdrive.
  12. Depois que o RTV é curado, feche a caixa com um peso pequeno para dentro, e submerga na água durante a noite para assegurar-se de que não haja nenhum escapamento da água na caixa.
  13. Corte as tetés e fio de referência para o comprimento desejado usando tesoura afiada.
  14. Anexar a espuma de poliestireno extrudida marcada (ver Mesa de Materiais)para a caixa. Ajuste seu tamanho assim que sua flutuabilidade é equilibrada quando submersa em um banho de água.
  15. Mergulhe as pontas do tetéide na solução preta platinada e use uma corrente direta (-0.2 μA) para revestir os elétrodos e ajustar a impedância dos elétrodos como desejado. Use um testador de impedância multieletrodo (ver Tabela de Materiais)para medições de revestimento e impedância.
    Nota: No pallium peixinho dourado, um valor de 40 kOhm é o melhor. Dependendo da aplicação, a impedância do eletrodo pode ser ajustada modificando o revestimento preto platinado10,11.

5. Preparação anestesia - 1% MS-222 Stock Solution

CUIDADO: A preparação da anestesia inclui o uso de MS-222 em pó, um agente cancerígeno. Assim, os passos 5.2 e 5.3 devem ser feitos em um capô químico usando luvas.

  1. Adicione 100 mL de água a um tubo que pode conter mais de 100 mL.
  2. Em uma capa química, coloque uma placa de ponderação descartável em uma escala. Adicione 1 g de MS-222 em pó usando uma espátula, em seguida, adicione o pó ao tubo.
  3. Agite bem o tubo.
    Nota: Na forma líquida, ms-222 pode ser usado fora do capô químico usando luvas, mas não requer uma máscara.
  4. Coloque uma placa de ponderação descartável em uma escala. Adicione 2 g de bicarbonato de sódio usando uma espátula, em seguida, adicione o pó ao tubo. Agite bem o tubo.

6. Preparando o crânio de peixe

Nota: Nesta fase, o peixe está pronto para a cirurgia de implante. Antes da cirurgia, certifique-se de que todos os componentes e suprimentos tenham sido esterilizados pelos procedimentos apropriados. Para esta etapa, um suporte de peixe em forma de U fora de água é necessário. Neste protocolo, um suporte de alumínio que cabe uma cabeça de 15 cm ao goldfish longo da cauda é usado. Este sistema prende os peixes fora da água ao perfundir as brânquias com água oxigenada. Para mais detalhes veja Vinepinsky et al.8.

  1. Coloque o peixe em um banho de água 0,02% MS-222 por 20 min até que o peixe esteja dormindo.
  2. Usando luvas estéreis, tire o peixe da água e coloque-o no suporte.
    Nota: A água oxigenada que permea o peixe contém MS-222 a uma concentração de 0,02%, de modo que o peixe permanece anestesiado durante a cirurgia.
  3. Usando uma espátula estéril, aplique a pasta de lidocaína 5% na pele acima do local designado para cirurgia por 10 min, em seguida, retire a lidocaína.
    Nota: Consulte um atlas cerebral apropriado para atingir a região cerebral específica.
  4. Usando um bisturi estéril de 15 lâminas, retire a pele acima do crânio na região do implante.
  5. Usando uma broca dentária com brocas de 0,7 mm, faça 4 buracos no crânio. Insira um parafuso de 1 mm (3 mm de comprimento) em cada buraco e aplique cola de cianoacrilato nos buracos antes de inserir o parafuso.
  6. Usando um burnisher dental, aplique o cimento dental nos parafusos e na periferia do crânio expor.
  7. Usando a broca dental, faça um furo do diâmetro de 5 milímetros no crânio acima da região do cérebro do interesse. Retire o tecido adiposo entre o crânio e o cérebro e exponha o alvo da região cerebral usando pinças finas e papel de tecido mole. Tenha cuidado para não danificar os grandes vasos sanguíneos debaixo do crânio.
    Nota: Até o final desta etapa, o peixe está preparado para implantar a sonda. Apenas os principais passos específicos para este protocolo são descritos aqui. Vários procedimentos pós-operatórios (como documentação detalhada sobre a saúde do animal e esterilização das ferramentas e áreas de cirurgia) não são apresentados ou discutidos porque são aplicáveis a todas as cirurgias com peixes ou pequenos animais.

7. Implantando a sonda

Nota: Para completar a etapa final do protocolo, um manipulador que pode manter o implante no lugar enquanto ele é inserido no cérebro é necessário.

  1. Use o manipulador para segurar a tampa da caixa de logger com as apontando para baixo em direção ao cérebro de peixe.
  2. Dobre o eletrodo de referência de tal forma que quando os tetés são abaixados no cérebro, a referência permanece fora do cérebro.
  3. Corte os fundamentos de tal forma que eles se encaixam no crânio. Opcionalmente, ligue um fio de chão a um dos parafusos do crânio.
  4. Abaixe o implante de tal forma que os eletrodos são inseridos no cérebro, enquanto a parte inferior da habitação microdrive está perto do crânio.
  5. Comece a anexar o implante ao crânio aplicando uma pequena quantidade de cimento dental entre a habitação e o parafuso mais próximo do crânio.
  6. Após a primeira parte do cimento dental é curado, aplique cimento dental e feche o buraco acima do crânio e todo o crânio exposto.
    Nota: Geralmente várias rodadas de aplicações de cimento dental são necessárias para cobrir todo o crânio exposto.
  7. Instale o madeireiro e a bateria na caixa e selar a caixa com todos os parafusos.
  8. Aplique antibióticos e analgésicos locais de acordo com o tipo de peixe usado para os experimentos.
  9. Lave as guelras do peixe com água fresca até que o peixe comece a acordar. Retire o peixe do suporte e coloque-o de volta em seu tanque de casa.
    Nota: O peixe é recuperado inteiramente dentro de 60 minutos após a cirurgia.
  10. Certifique-se de que o peixe é capaz de nadar livremente com o implante (Figura 3, Vídeo Suplementar 1). Se necessário, reajustar o tamanho da espuma de poliestireno extruda acima da caixa de logger de tal forma que o peixe pode equilibrar facilmente.

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Resultados

Durante uma sessão de gravação, o peixinho dourado nadou livremente em um tanque de água quadrada, enquanto a atividade neural em sua telencefalon foi gravada. O objetivo desses experimentos era estudar como a atividade neural das células individuais determina o comportamento do peixe. Para isso, a atividade de cravagem precisava ser identificada nos dados registrados. A atividade cerebral, ao ser registrada, foi digitalizada em 31.250 Hz e alta passagem filtrada a 300 Hz pelo registrador...

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Discussão

Este protocolo detalha as etapas envolvidas na implantação de uma matriz de tetróda na telencefalon de peixinho dourado livremente natação. Esta técnica implementa um madeireiro neural que amplifica e registra os sinais adquiridos de até 16 canais, juntamente com um microdrive que pode ajustar a posição tetróna no cérebro. O microdrive torna possível ajustar a posição no cérebro para otimizar a gravação.

Este protocolo pode ser facilmente modificado para gravação de outras regiões do cérebro (...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos a Nachum Ulanovsky e aos membros do laboratório Ulanovsky por toda a sua ajuda. Além disso, somos gratos a Tal Novoplansky-Tzur por uma assistência técnica útil. Reconhecemos com gratidão o apoio financeiro da THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION - FIRST Program (grant no. 281/15), e do Helmsley Charitable Trust através da Iniciativa de Robótica Agrícola, Biológica e Cognitiva da Universidade Ben-Gurion do Negev.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
redondas de 0,7 mmCompatível com a broca.
Bisturi de 15 lâminasSigma-Aldrich
16 canais placa PCBNeurlynxEIB-16
1x3M parafusosAço inoxidável. Qualquer tipo.
parafusos de cabeçaem aço inoxidável. Qualquer tipo.
de latão de 27 cm x 19 cm x 1 mmVeja a Figura 2
ParafusosAço inoxidável. Qualquer tipo.
3140 Revestimento RTVDow Crowning2767996
75 µ m Fio prateadoA-M Systems
Parafusos de máquina de latão #00-90947-1006
Placas de latão 7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mmÉ fornecido um desenho 3D. Veja suplementar 1
fio de tungstênio revestido 25µ mCalifornia Fine Wire Company5000160Dependendo da aplicação, os tetrodos podem ser fabricados a partir de qualquer tipo de fio. Fios populares são fios de nicroma que podem ser encontrados com diâmetros mais baixos (por exemplo. Sistemas A-M, 762000)
Fio de tungstênio revestido 50 µ mA-M Systems795500Pode ser substituído por qualquer outro fio com cola
cianoacrílica
Polidor DentalComDent UKQualquer pequena ferramenta de aço inoxidável estéril serve.
Cimento dentário - GCFujiPLUSGC431011Outros cimentos dentários provavelmente funcionariam também, embora nunca tenhamos tentado nenhum outro.
Broca odontológica ou brocaAs brocas odontológicas são caras, uma broca de esmalte pode ser um substituto barato.
Broca #65947-65
EpóxiQualquer epóxi de cura de 5 min pode ser usado aqui.
Caixa do registrador com vedaçãoUm desenho 3D é fornecido. Veja os 1-3 suplementares. A caixa deve ser fabricada à máquina (não use impressoras 3D). Use material transparente, para poder ver os LEDs indicadores no registrador.
de giro motorizadoFeito sob medida conforme descrito no site "open ephys". Também pode ser adquirido de neurolince ("Tetrode Spinner 2.0") ou construído por outros meios.
Mouselog-16 Registrador neuralDeuteron Technologies LtdExistem vários registradores neurais disponíveis no mercado, incluindo: SpikeGadget (UH32 32 canais) e Neurologger 2/2A/2B de Alexei Vyssotski. Deve-se notar que o peso não é uma restrição importante, pois pode ser contrabalançado com isopor flutuante
MS-222Sigma AldrichE10521Ethtl 3-aminobenzoato metanossulfonato 98%
Nano-Z chapeamentoWhite Matter LLCO nano-Z pode ser comprado em vários fornecedores. Qualquer medidor de impedância pode ser usado, por exemplo, IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
Pinos de PCBNeurlynxNeuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250 µ mA-M Systems822000
recarregável3.7 Bateria Lipo, 370 mAh. Armazena cerca de 6 horas de gravação. Baterias menores ou maiores podem ser usadas para reduzir o peso ou estender o tempo de gravação.
Tubo de silicone 0,64 mmA-M Systems806100
Aço inoxidável 1,5 mmA-M Systems846000
Sudium BicarbonateSigma AldrichS9625
Tap #00-90947-1301
VaselinaQualquer tipo de protetor de pele de petróleo macio pode ser usado aqui.
Brocas de cabeça chata Phillips redonda Phillips 1x3M Placa de cabeça chata Phillips 2x6M de baixa impedância de esmalte de cura rápida O-ring Dispositivo Bateria

Referências

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Reimpressões e permissões

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