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Análise de deslocamento da Deformação Mecânica Miocárdica (DIAMANTE) revela heterogeneidade segmental da função cardíaca em zebrafish embrionário

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DOI:

10.3791/60547

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6 de fevereiro de 2020

 , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles, 2Ronald Reagan UCLA Medical Center, 3Veterans Affairs West Los Angeles Medical Center

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é detalhar um novo método para a avaliação da função cardíaca segmental em zebrafish embrionário sem condições fisiológicas e patológicas.

Resumo

Os zebrafish são cada vez mais utilizados como um organismo modelo para cardiomiopatias e regeneração. Os métodos atuais que avaliam a função cardíaca não detectam de forma confiável a mecânica segmental e não são facilmente viáveis em zebrafish. Aqui apresentamos um método semiautomatizado de código aberto para a avaliação quantitativa da função cardíaca segmental tetradimensional (4D): análise de deslocamento da deformação mecânica do miocárdio (DIAMOND). Zebrafish embrionário transgênico foram imagens in vivo usando um sistema de microscopia de fluorescência de folha de luz com sincronização de movimento cardíaco 4D. Corações digitais 3D adquiridos foram reconstruídos em systole final e diastole final, e o ventrículo foi segmentado manualmente em conjuntos de dados binários. Em seguida, o coração foi reorientado e isotropicalmente reamostrado ao longo do verdadeiro eixo curto, e o ventrículo foi dividido uniformemente em oito porções (I-VIII) ao longo do eixo curto. Devido aos diferentes aviões de reamostragem e matrizes em matrizes de fim de systole e diastole final, foi aplicada uma matriz de transformação para registro de imagem para restaurar a relação espacial original entre as matrizes de imagem sistólica reamostrada e diastólica. Após o registro de imagem, o vetor de deslocamento de cada segmento de systole final para diastole final foi calculado com base no deslocamento de centrosids de massa em três dimensões (3D). Diamond mostra que os segmentos basais do miocárdio adjacentes ao canal arioventricular passam pela maior deformação mecânica e são os mais suscetíveis à lesão cardíaca induzida por doxorubicina. No geral, a DIAMOND fornece novas percepções sobre a mecânica cardíaca segmental em embriões de zebrafish além da fração tradicional de ejeção (EF) em condições fisiológicas e patológicas.

Introdução

A toxicidade cardíaca induzida pela quimioterapia e a insuficiência cardíaca que se seguiu são uma das principais razões para a descontinuação da quimioterapia1. Portanto, a avaliação funcional cardíaca desempenha um papel crucial na identificação da toxicidade cardíaca e, mais importante, na previsão de lesão cardíaca precoce após a quimioterapia2. No entanto, as abordagens atuais para limitações de avaliação funcional cardíaca encontram limitações. Métodos como a fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF) fornecem apenas mecânica cardíaca global e muitas vezes retardada após lesão3,4. A imagem do Tissue Doppler fornece informações segmentais de deformação do miocárdio, mas sofre de significativa variabilidade intraobservador e interobservador, em parte devido à dependência do ângulo do feixe de ultrassom5. O rastreamento bidimensional (2D) utiliza o modo B de ecocardiografia, que teoricamente elimina a dependência do ângulo, mas sua precisão é limitada pelo movimento fora do plano6. Portanto, falta uma abordagem rigorosa para quantificar a função cardíaca segmental tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos.

Nesse contexto, desenvolvemos um método de quantificação 4D para a análise da função cardíaca segmentada que nomeamos a análise de deslocamento da deformação mecânica miocárdica (DIAMOND), para determinar os vetores de deslocamento de centrosides de massa miocárdica no espaço 3D. Aplicamos DIAMOND para a avaliação in vivo da função cardíaca e toxicidade cardíaca induzida por doxorubicina com zebrafish(Danio rerio) como modelo animal, escolhido devido ao seu miocárdio regenerador e genes de desenvolvimento altamente conservados7. Comparamos ainda o deslocamento segmental diamond com determinação da fração de ejeção global (EF) e cepa 2D após o tratamento da doxorubicina. Ao integrar o deslocamento DIAMOND com microscopia fluorescente de folha de luz 4D (LSFM) adquirida renderização de corações de zebrafish embrionários, diamond mostra que os segmentos basais miocárdio adjacentes ao canal arioventricular passam pela maior deformação mecânica e são os mais suscetíveis à lesão cardíaca aguda doxorubicina8.

   

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Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCLA (IACUC), e os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Escritório de Pesquisa Animal da UCLA.

1. Reprodução Tg (cmlc2:mCherry) zebrafish e coleta de embriões

  1. Siga os procedimentos de moradia, reprodução e coleta de embriões descritos em práticas de pecuária e reprodução previamente estabelecidas. Para mais detalhes, consulte Messerschmidt et al.9.
  2. Trate os embriões coletados com 0,003% 1-phenill-2-thiourea (UPT) na E3 médio 18 h pós-fertilização para manter a transparência dos embriões para a imagem LSFM.

2. Tratamento de doxorubicina para induzir lesão cardíaca

  1. Aos 3 dias de pós-fertilização (dpf), tratar os embriões com doxorubicina a uma concentração de 10 μM em água de peixe E3. Após um tratamento de 24 h para 4 dpf, substitua o meio de doxorubicina por meio E3 fresco.
    ATENÇÃO: Doxorubicina é um medicamento para quimioterapia. É necessário equipamentos de proteção individual adequados (EPE) e os resíduos devem ser descartados em recipientes de resíduos de risco biológico.

3. Modulação de caminho de entalhe

  1. Trate embriões de zebrafish com o inibidor de via notch (2S)-N-[(3,5-difluorofpheníl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glicina 1,1-dimetiletiletil (DAPT) em uma concentração de 10 μM em água de peixe E3 média de 3-6 dpf.
  2. Microinjetando os efeitos notch a jusante Notch Domínio intracelular (NICD) e Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA em concentrações de 10 pg/nL e 5 pg/nL, respectivamente, nos embriões de zebrafish estágio 1 células8,10.
    NOTA: A microinjeção é realizada um microscópio com o suporte de uma bomba de ar para controlar com precisão o volume injetado. A microinjeção mRNA na célula é feita quando o óvulo fertilizado está no estágio inicial da célula. Para obter detalhes sobre a preparação e sequência dos mRNAs, consulte Chen et al.8. Para obter detalhes sobre a microinjeção e preparação de agulhas de injeção, consulte Rosen et al.10.

4. Sincronização de imagem LSFM e sincronização pós-imagem

  1. Para as técnicas de imagem LSFM e algoritmo de sincronização pós-imagem, veja detalhes em publicações anteriores9,11.
    NOTA: Brevemente, nosso sistema utiliza um laser de onda contínua como fonte de iluminação para visualizar todas as linhas transgênicas de zebrafish. O módulo de detecção é composto por duas câmeras científicas complementares de óxido metálico (sCMOS) e dois conjuntos de filtros para imagens de dois canais. O módulo de detecção é instalado perpendicularmente no plano de iluminação. Cada quadro LSFM é adquirido dentro de um tempo de exposição de 20 msec, enquanto o poder de resolução na seção transversal é de ~0,65 μm e o tamanho do passo entre quadros consecutivos é de ~2 μm. Um laser de 589 nm foi usado para excitar sinais fluorescentes mCherry.

5. Reconstrução do coração sistólico e diastólico 3D

  1. Abra a pasta criada pelo algoritmo de sincronização pós e abra a pasta "Saída". Selecione o plano do meio do coração e carregue toda a pasta no ImageJ. Encontre a primeira fase diastólica e sistólica e grave o número do quadro.
  2. Abra a pasta "Saída/Por Estado" e encontre as pastas que tenham os mesmos números que os números do quadro acabaram de ser registrados. Converta as imagens na pasta em arquivos 3D TIFF (formato de arquivo de imagem marcado) e as nomeie "diastole.tif" e "systole.tif".

6. Segmentação do ventrículo

  1. Abra o software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais). Clique em Arquivo | Abra dadose carregue "diastole.tif" e "systole.tif". Digite o tamanho voxel de acordo com as configurações de imagem.
    NOTA: Para o sistema LSFM utilizado, o tamanho típico do voxel é de 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm.
  2. Clique no painel "SEGMENTAÇÃO" e segmente manualmente a parte de ventrículo do coração. A ferramenta"Limiar"incorporada que pode selecionar todas as regiões acima de uma certa intensidade pode facilitar esse processo. O ventrículo é a câmara mais grossa com uma fluorescência mais forte.
    NOTA: Certifique-se de remover o canal arioventricular e o trato de saída no ventrículo segmentado, pois isso afeta a análise de deslocamento.
  3. Depois que a segmentação for feita, clique no painel "Projeto". Clique direito no "diastole. Labels.tif" e "systole. Labels.tif" guias no console e clique em "Exportar Dados como" para salvar os dados como arquivos 3D TIFF.

7. Criação de paralelos retangulares para registro de imagem

  1. Execute "prepImage_1.m" no ambiente de programação (ver Tabela de Materiais). Abra "prepImage_1.m", "ImPath" na linha 5 para que a pasta contenha os arquivos TIFF originais e segmentados, e mude "fatia" na linha 4 para o número de fatias dos arquivos 3D tif.
  2. Após a execução do código, ele gerará cinco novos arquivos 3D TIFF ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" e "sysLabel200.tif"), bem como duas novas pastas ("resample_dia" e "resample_sys").

8. Reamostrar corações sistólicos e diastólicos 3D ao longo do plano de eixo curto

  1. Importe todos os cinco arquivos 3D TIFF no software de análise de imagens (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: O tamanho voxel é inalterado.
  2. Vá para o painel MULTIPLANAR. Escolha "diastole_200.tif" como dados primários. Alinhe o eixo X (a linha verde no plano XY) com o eixo longo vertical do ventrículo, e alinhe o eixo Z (a linha vermelha no plano YZ) com o eixo longo horizontal do ventrículo.
    NOTA: O eixo longo vertical é determinado encontrando o eixo mais longo que conecta o ápice e o trato de saída no plano XY, e o eixo longo horizontal é determinado encontrando o eixo mais longo que conecta o ápice e o trato de saída no plano YZ. Gire o eixo colocando o cursor na extremidade do eixo.
  3. Escolha três pontos aleatórios do oblíquo avião YZ (o plano de eixo curto) de forma anti-horário e registre suas coordenadas de posição 3D.
    NOTA: Certifique-se de que os pontos sejam escolhidos de forma anti-horário.
  4. Repita as etapas 8.2 e 8.3 para "systole_200.tif".
  5. Clique no painel "PROJECT". Crie um objeto "Slice" para "diastole_200.tif" clicando à direita em "diastole_200.tif" e procurando por "Slice" objeto. Clique à esquerda no objeto Slice apenas criado, e no painel Propriedades | Opções, verifique "Set Plane" e escolha três pontos em " Definiçãode Avião". Digite as coordenadas dos três pontos da etapa 7.3.
  6. Repita o passo 8.5 para "systole_200.tif".
    NOTA: O objeto de fatia criado deve ter o nome "Fatia 2".
  7. Clique direito em "diastole_200.tif" e procure "Resample Transformed Image" e crie o objeto. No painel Propriedades, escolha "Fatia" como a "Referência" e clique em Aplicar. Isso deve gerar um objeto chamado "diastole_200.transformado".
  8. Clique direito "diastole_200.transformado" e procure por "Resample" e crie o objeto. Escolha "Tamanho Voxel" como o "Modo" e mude "Tamanho Voxel" para ser x = 1, y = 1 e z = 1 no painel Propriedades.
  9. Clique em aplicar "inscreva-se". Isso deve gerar um objeto chamado "diastole_200.reamostrado". Clique direito em "diastole_200.resampled" e salve-o como um arquivo 3D TIFF.
  10. Repita o mesmo passo para "diaLabel.tif" e "test.tif". Salve "diaLabel.resampled" e "test.resampled" como arquivos 3D TIFF. Repita o mesmo passo para "systole_200.tif", "sysLabel.tif" e "test.tif" usando "Slice 2" como referência, e salve "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" e "test2.resampled" como arquivos 3D TIFF.
    NOTA: Certifique-se de que há um total de seis arquivos TIFF salvos nesta etapa.

9. Divisão do coração reamostrado

  1. Importe todos os seis arquivos reamostrados da etapa 8 para o ImageJ. Selecione uma fatia de "systole_200.resampled" na qual o canal arioventricular é claramente visualizado. Registre o número da fatia.
    1. Use a "Imagem | Transformar | Gire" função do ImageJ para que o canal arioventricular seja vertical. Aplique a mesma rotação a todos os arquivos. Feche todas as janelas e salve todas as mudanças.
    2. Mova "diastole_200.resampleado", "diaLabel.resampled" e "test.resampled" para a pasta "resample_dia" e mova "systole_200.resampleado", "sysLable.resampled" e "test2.resampled" para a pasta "resample_sys".
  2. Abra "divider_2_8_pieces.m". Mude "ImPath" na linha 5 e "ImPath" na linha 395 para o diretório de imagem. Altere a variável "Middle" na linha 22 e linha 411 para os números de fatias onde o canal arioventricular é claramente visualizado em "systole_200.resampleado" e "diastole_200.resampled".
  3. Execute o código e nas janelas solicitadas clique uma vez no centro do ventrículo e clique uma vez no centro do canal atrioventricular. Isso precisa ser feito duas vezes para imagens de systole e diastole.

10. Registro de matrizes de imagem sistólica e diastólica

  1. Abra "register_3.m" e mude "ImPath"na linha 4 para o caminho da pasta de imagem. Pode levar de 5 a 20 min para executar este código dependendo do poder de computação do sistema.
    NOTA: Os paralelos retangulares criados artificialmente na etapa 7 são utilizados para registro rígido 3D que preserva a distância entre dois pontos e ângulos subscritos por três pontos. Quando o paralelo retangular de diastole final é registrado na matriz paralela retangular (verde) (verde), a localização 3D discrepant resultante permite a derivação de uma matriz única de transformação rígida que consiste em rotação e tradução da matriz de diastole final para a matriz de systole final(Figura 1H). Realizamos o registro e minimizamos energia regularizada para desfazer a matriz após a transformação utilizando uma caixa de ferramentas de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais). Para uma descrição matemática detalhada, consulte Chen et al.8.

11. Saída dos vetores de deslocamento

  1. Abra "displacement_4.m" e mude "ImPath" na linha 4 para o caminho da pasta de imagem.
  2. Execute "displacement_4.m", que gera um arquivo "vector8.txt" na pasta "vetores". Uma vez que o arquivo "vector8.txt" esteja aberto, haverá uma matriz de 8 x 4. Cada linha da matriz tem quatro números, que são as magnitudes do componente X, componente Y, componente Z e a magnitude SUM do vetor de deslocamento de um segmento específico do ventrículo.
    NOTA: O vetor de deslocamento é obtido calculando o deslocamento do centroide em massa de cada segmento no espaço 3D. Calculamos figure-protocol-1 as coordenadas 3D de centroid de massa (PS e PD) (onde k indica a coordenada X, Y ou Z, respectivamente) de cada segmento (I-VI) no conjunto de dados de segmentação de systole a diastole ( Figura1J). Definimos o centroide figure-protocol-2 em massa no espaço 3D da seguinte forma:
    figure-protocol-3
    onde Cx = X, Cy = Y, e Cz = Z, Mi = a massa de cada segmento (I ≤ i ≤ VI), m = o número de voxels de cada segmento, e ρ = a função de densidade como a região segmentada é 1 enquanto o resto é 0. A norma L2 dos vetores de subdeslocamento ao longo dos eixos X-, Y e Z e o vetor de deslocamento de soma são calculados durante o ciclo cardíaco. Há um total de oito linhas na matriz. A primeira fila e a oitava fila contêm o canal arioventricular e, portanto, são ignoradas em nossa análise. Os segmentos I a VI são representados pela segunda fila para a sétima fila.

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Resultados

O processo pelo qual o DIAMOND foi desenvolvido para avaliar a função cardíaca segmental 3D é apresentado na Figura 1. Após a aquisição e reconstrução de imagens lSFM em 3D do coração de zebrafish embrionário (Figura 1A),o verdadeiro plano de eixo curto foi determinado como o plano perpendicular para os eixos longos verticais e horizontais, ambos determinados em um espectador multiplano (Figura 1B)....

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Discussão

Uma estratégia rigorosa para quantificação da função miocárdio segmental é fundamental para avaliar a mecânica cardíaca além da EF tradicional, conhecida por ser um indicador insensível e atrasado de lesão miocárdica1,4,12. Assim, tem havido um crescente interesse em marcadores de mudanças miocárdicas precoces, e um corpo crescente de literatura apoia parâmetros de deformação do miocárdio como indicador inicial para prever disfu...

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Divulgações

Os autores declararam que não existe conflito de interesses.

Agradecimentos

O presente trabalho foi financiado pelas bolsas 16SDG30910007 e 18CDA34110338, e pelos subsídios do National Institutes of Health HL083015, HL111437, HL118650 e HL129727.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amira6FEISoftware de análise de imagem
DAPTMillipore SigmaD5942-5MG
Cloridrato de doxorrubicinaMillipore SigmaD1515-10MG
Etil 3-aminobenzoato metanossulfonatoMillipore SigmaE10521-10GTricaína
MATLABMathWorksAmbiente de programação
Caixa de ferramentas de processamento de imagens MATLAB Caixa deferramentas de processamento de imagensMathWorks

Referências

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