Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.
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Artigo de método
In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vários protocolos foram relatados na literatura para o isolamento e a cultura das células epiteliais amnióticas humanas (HAEC). No entanto, estes assumem que o epitélio amniótico é uma camada homogênea. O amnion humano pode ser dividido em três regiões anatômicas: refletida, placentária e umbilical. Cada região tem diferentes papéis fisiológicos, como em condições patológicas. Aqui, descrevemos um protocolo para dissecar o tecido amnion humano em três seções e mantê-lo in vitro. Na cultura, as pilhas derivadas do amnion refletido indicaram uma morfologia cuboidal, quando as pilhas das regiões placental e umbilicais eram escamosas. No entanto, todas as células obtidas têm um fenótipo epiteliais, demonstrado pela imunodetecção de E-cadherin. Assim, como as regiões placentárias e refletidas in situ diferem em componentes celulares e funções moleculares, pode ser necessário que estudos in vitro considerem essas diferenças, pois podem ter implicações fisiológicas para o uso de HAEC em pesquisa biomédica e a aplicação promissora dessas células na medicina regenerativa.
Introdução
As células amnióticas do epitélio (HAEC) têm origem nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário, por volta de oito dias após a fertilização. Eles surgem de uma população de células epiteliais escamosas do epiblasto que derivam da camada mais interna da membrana amniótica1. Assim, haec são considerados remanescentes de células pluripotentes do epiblasto que têm o potencial de diferenciar as três camadas germinas do embrião2. Na última década, diversos grupos de pesquisa desenvolveram métodos para isolar essas células da membrana amniótica no termo da gestação para caracterizar suas propriedades presuntivas relaci....
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto Nacional de Perinatología, na Cidade do México (Registro número 212250-21041). Todos os procedimentos realizados nesses estudos estavam de acordo com os padrões éticos do Instituto Nacional de Perinatología, da Declaração de Helsínquia, e das diretrizes estabelecidas no Padrão Oficial mexicano do Ministério da Saúde.
1. Preparação
- Prepare uma solução de 1x PBS com EDTA. Para fazer isso, adicione 500 μL de 0,5 M DETA estoque em 500 mL de 1x PBS para uma concentração final de 0,5 mM EDTA.
- Prepare o meio de cultura para haec. Tome 450 mL de alta glicose-DMEM, com....
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Resultados
Haec foram isolados de cada uma das três regiões anatômicas da membrana amniótica e individualmente cultivadas in vitro. Após 48 h de cultura, células com fenótipo epiteliais aderiram à superfície da placa, embora a mídia também continha detritos celulares e células flutuantes, que foram removidas uma vez que o meio foi alterado (Figura 3).
Durante o processamento da cultura primária (passagem zero, P0), algumas complicações podem surgir que podem interferir na an.......
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Discussão
Implementamos um novo protocolo para isolar a HAEC das membranas a termo. Difere dos relatórios precedentes que cada membrana estêve dividida em suas três regiões anatômicas antes da isolação para analisar pilhas de cada um.
Uma das etapas mais críticas no protocolo é a lavagem da membrana para remover todos os coágulos sanguíneos, porque eles podem interferir com a atividade da tripseao separar as células epiteliais. A falha realizar corretamente esta etapa pode conduzir a obter uma cultura p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Nossa pesquisa contou com o apoio de doações do Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 e 21081) e CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Agradecemos a Jessica González Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas pelo apoio técnico.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes de cultura | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinante Humano EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Suplementado com alto teor de glicose e HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 M |
| Células-tronco embrionárias FBS, qualificado | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Aminoácidos Não Essenciais | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldeído | qualquer marca | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| solução salina (cloreto de sódio 0,9%) | qualquer marca | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Material descartável | |||
| 100 µ m Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| Placa de Cultura Tratada com TC de 100 mm | Corning | 430167 | |
| Placas de Poços Múltiplos Transparentes de 24 poços | Corning/Costar | 3526 | |
| Placas de Múltiplos Poços Transparentes de 6 poços | Corning/Costar | 3516 | |
| qualquer marca | com cônico fundo | ||
| Pontas estéreis não pirogênicas de 1.000 µ l, 200 µ l e 10 µl. | |||
| Gazes | |||
| Pipetas serológicas estéreis de 5, 10 e 25 mL de | qualquer marca | ||
| Luvas cirúrgicas estéreis | de qualquer marca | ||
| Equipamento | |||
| Cabine | |||
| Centrífuga | |||
| Micropipetas | |||
| Enchimento/dispensador | |||
| Copos estéreis de 500 mL | |||
| de corte de plástico estéril | |||
| Bisturis, tesouras, pinças, braçadeiras | |||
| estéril de aço inoxidável | |||
| estéril | |||
| Rotador de tubo | MaCSmix | ||
| Anticorpos e kits | ID de anticorpos | ||
| Anti-E-caderina | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Sinalização Celular | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Sinalização Celular | Anti-TRA-1-60 | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Cabra Anti-Rato Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Cabra Anti-Coelho Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Kit de Ensaio de Túnel | Abcam | 66110 |
Referências
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....
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Reimpressões e permissões
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