Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar

Resumo

Este protocolo fornece um método fácil de manusear para cultura as células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus e é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceos.

Resumo

As células cultivadas primárias são usadas em uma variedade de disciplinas científicas como ferramentas excepcionalmente importantes para a avaliação funcional de substâncias biológicas ou caracterização de atividades biológicas específicas. No entanto, devido à falta de meios e protocolos de cultura celular universalmente aplicáveis, métodos de cultura celular bem descritos para organismos marinhos ainda são limitados. Enquanto isso, a contaminação microbiana que ocorre comumente e as propriedades polítas das células marinhas de invertebrados impedem ainda mais o estabelecimento de uma estratégia eficaz de cultura celular para invertebrados marinhos. Aqui, descrevemos um método fácil de manusear para cultivar células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus; além disso, fornecemos um exemplo de in vitro apoptose indução e detecção em células intestinais de cultura primária. Além disso, este experimento fornece detalhes sobre o método de coleta de células e meio de cultura apropriado. O protocolo descrito é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceo, e pode fornecer células suficientes para múltiplas aplicações experimentais in vitro. Esta técnica permitiria aos pesquisadores manipular eficientemente culturas de células primárias a partir de invertebrados marinhos e facilitar a avaliação funcional de materiais biológicos direcionados nas células.

Introdução

Cultivar células condições artificialmente controladas, e não em seu ambiente natural, fornece materiais experimentais uniformes para estudos biológicos, especialmente para espécies que não podem ser facilmente cultivadas em um ambiente de laboratório. Os invertebrados marinhos são responsáveis por mais de 30% de todas as espécies animais^1,e fornecem inúmeros materiais biológicos para a realização de pesquisas sobre os mecanismos regulatórios de processos biológicos específicos, como regeneração^2,3,resposta ao estresse^4,e adaptação ambiental^5,

Protocolo

1. Preparação média da cultura celular

1. Preparação de fluidocomicos
   1. Coleta de fluidos coelomicos: Em condições estéreis, dissecar um pepino do mar saudável (peso molhado de 85-105 g), coletar líquido coelomic, e armazená-lo em um frasco de vidro estéril.
   2. Remoção de células coelomicas: Centrífuga o fluido coelomicem-se em tubos de centrífuga de 50 mL a 1.700 x g por 5 min e transfira o supernatant para um novo frasco de vidro estéril; Em seguida, recolher o líquido coelomic livre de células do pepino do mar.
   3. Complemente a inativação de componentes: ....

Resultados

Aqui, estabelecemos a cultura primária das células intestinais de A. japonicus e passamos as células. A Figura 1 mostra células redondas em diferentes estágios de cultivo. E os ensaios de coloração edu fornecer evidências diretas para revelar a atividade proliferativa dessas células redondas em fase posterior (Figura 2). Também ajustamos ligeiramente o protocolo, cultivando blocos de tecido picados em vez de células filtradas; além disso, um tipo de cél.......

Discussão

Extensos esforços de pesquisa têm sido dedicados ao estabelecimento de linhas celulares nas últimas décadas, no entanto, ainda é difícil fazer um progresso na cultura de longo prazo das células de invertebrados marinhos^14,22. Tem sido relatado que as células cultivadas de regeneração de tecidos holothurian foram viáveis por um longo período de tempo e alta atividade de proliferação pode ser detectada em células específicas^17,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,1 μ m filtro	Millipore	SLVV033RS
0,22 μ m filtro	Millipore	SLGP033RB
0,25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μ m filtro	Falcon	352360
pratos de 4 cm	ExCell Bio	CS016-0124
solução de paraformaldeído a 4%	Sinopharm 80096618 de reagentes químicos		em centrífugas de bancada PBS
	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Incubadora	de 10005817
	Lucky Riptile	HN-3
Dexametasona	Reagente químico Sinopharm	XW00500221
banho-maria termostático elétrico	senxin17	DK-S28
Etanol	Reagente químico Sinopharm	80176961	75%
Fator de crescimento de fibroblastos (FGF)	PEPROTECH	100-18B
	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamicina	Sinopharm Reagente químico	XW14054101
Glicose	Sinopharm Reagente químico	63005518
Hoechst33258 Solução de coloração	Beyotime	C1017
Insulina	Sinopharm Reagente químico
Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Reagente químico Sinopharm	10016308
L-15	Genom	GNM41300
L-glutamina de Leibovitz (100 mg / mL)	Genom	GNM-21051
MgCl < sub > 2 < / sub >	Sinopharm Reagente	químico
Na2SO4	Sinopharm	Reagente Químico 10020518
NaCl	Reagente Químico Sinopharm	10019308
NaOH	Reagente Químico Sinopharm	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicilina-Estreptomicina	Genom
medidor de PH	Bante	A120
Taurina	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791

de temperatura constante de reagentes químicos Sinopharm Microscópio fluorescente XW1106168001XW77863031GNM15140