Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Abstract

A diferenciação in vitro das células-tronco embrionárias humanas (hESCs) transformou a capacidade de estudar o desenvolvimento humano em níveis biológicos e moleculares e forneceu células para uso em aplicações regenerativas. Abordagens padrão para a cultura hESC usando cultura do tipo colônia para manter hESCs indiferenciados e corpo embrionário (EB) e formação de roseta para diferenciação em diferentes camadas germinais são ineficientes e demorados. Apresentado aqui é um método de cultura unicelular usando hESCs em vez de uma cultura do tipo colônia. Este método permite a manutenção das características de hESCs indiferenciados, incluindo a expressão de marcadores hESC em níveis comparáveis aos hESCs tipo colônia. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para a geração de células progenitoras neurais (NPC) de hESCs do tipo unicelular que produz NPCs dentro de 1 semana. Estas células expressam altamente vários genes marcador NPC e pode se diferenciar em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Este sistema de cultura unicelular para hESCs será útil na investigação dos mecanismos moleculares desses processos, estudos de certas doenças e telas de descoberta de medicamentos.

Introduction

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm o potencial de se diferenciar em três camadas germinais primárias, que se diferenciam em várias linhagens celulares progenitoras multipotentes. Estas linhagens posteriormente dão origem a todos os tipos de células do corpo humano. Os sistemas de cultura in vitro hESC transformaram a capacidade de estudar o desenvolvimento embrionário humano e serviram como uma ferramenta valiosa para obter novos insights sobre como esses processos são regulados nos níveis biológico e molecular. Da mesma forma, estudos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) gerados a partir da reprogramação de células somáticas isoladas de p....

Protocol

1. Preparação de placas revestidas de matriz de membrana de porão qualificadas por hESC

1. Descongele lentamente a matriz de membrana de porão qualificada ao hESC (ver Tabela de Materiais)solução em 4 °C por pelo menos 2-3 h ou durante a noite para evitar a formação de um gel.
2. Para preparar placas revestidas de matriz de membrana de porão, diluir matriz em DMEM/F12 a frio para uma concentração final de 2%. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL da solução de matriz diluída.
3. Incubar as placas revestidas de matriz de membrana do porão à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 3 h ou a 4 °C durante a no....

Results

Apresentado aqui é um protocolo melhorado para a manutenção e expansão da cultura do tipo unicelular de hESCs e sua diferenciação eficiente em células progenitoras neurais, que posteriormente se diferencia em várias linhagens neurais a jusante, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos.

Imagens representativas de contraste de fase mostram morfologia celular em diferentes etapas durante a adaptação de hESCs tipo colônia para a cultura do tipounicelular( Figur.......

Discussion

Métodos escaláveis e eficientes para a diferenciação de hESCs em várias linhagens e a geração de número suficiente de células diferenciadas são critérios importantes para o rastreamento de medicamentos e terapia com células-tronco. Vários métodos de passagem de células únicas foram publicados, nos quais as células são cultivadas na presença de inibidor de ROCHA ou outras pequenas moléculas para melhorar a sobrevivência, mas os produtos finais desses métodos de cultura são os hESCs tipo colônia^17,<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm m-pratos	ibidi	81156	Placa de cultura de células
Placas de 6 poços	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Solução de desprendimento de células
Activin A	R& D sistema	338-AC-050
Ácido Ascórbico	Sigma Aldrich	A4403
B27 suplemento	Thermo Fisher	17504044
suplemento B27 (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Applied Biological Materials	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
Centrifugador	DAMON/ICE	428-6759
Incubadora de CO2	Thermo Fisher	4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)	Corning	354277	Matriz de membrana basal (usada para a maior parte do protocolo aqui)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Solução de congelamento de células
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Soro Bovino Fetal	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Materiais Biológicos Aplicados	Z101705
GDNF	Applied Biological Materials	Z101057
Geltrex matrix	Thermo Fisher	A1569601	Matriz de membrana do porão
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Suplemento de glutamina,
linha de células-tronco embrionárias humanas 100X H9 (WA09)	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
Laminin Sigma		Aldrich L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC meio de cultura
N2 suplemento Thermo	Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P3655
Inibidor de ROCK	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Materiais Biológicos Aplicados	Z200617
Meio progenitor neural Stemdiff	Stemcell Technologies	5833	Meio de expansão NPC