Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Abstract

A diferenciação in vitro das células-tronco embrionárias humanas (hESCs) transformou a capacidade de estudar o desenvolvimento humano em níveis biológicos e moleculares e forneceu células para uso em aplicações regenerativas. Abordagens padrão para a cultura hESC usando cultura do tipo colônia para manter hESCs indiferenciados e corpo embrionário (EB) e formação de roseta para diferenciação em diferentes camadas germinais são ineficientes e demorados. Apresentado aqui é um método de cultura unicelular usando hESCs em vez de uma cultura do tipo colônia. Este método permite a manutenção das características de hESCs indiferenciados, incluindo a expressão de marcadores hESC em níveis comparáveis aos hESCs tipo colônia. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para a geração de células progenitoras neurais (NPC) de hESCs do tipo unicelular que produz NPCs dentro de 1 semana. Estas células expressam altamente vários genes marcador NPC e pode se diferenciar em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Este sistema de cultura unicelular para hESCs será útil na investigação dos mecanismos moleculares desses processos, estudos de certas doenças e telas de descoberta de medicamentos.

Introduction

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm o potencial de se diferenciar em três camadas germinais primárias, que se diferenciam em várias linhagens celulares progenitoras multipotentes. Estas linhagens posteriormente dão origem a todos os tipos de células do corpo humano. Os sistemas de cultura in vitro hESC transformaram a capacidade de estudar o desenvolvimento embrionário humano e serviram como uma ferramenta valiosa para obter novos insights sobre como esses processos são regulados nos níveis biológico e molecular. Da mesma forma, estudos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) gerados a partir da reprogramação de células somáticas isoladas de pacientes humanos fornecem novos insights sobre várias doenças. Além disso, progenitor e células diferenciadas derivadas de hESCs podem ser úteis para pesquisas envolvendo terapia com células-tronco e triagem de medicamentos^1,2,3,4.

hESCs podem ser induzidos a se diferenciar em células progenitoras neurais (NPCs), que são células multipotenciais com uma extensa capacidade de auto-renovação. Posteriormente, essas células podem ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos^5,6. Npcs também oferecem um sistema celular para estudos in vitro de biologia do neurodesenvolvimento e várias doenças neurológicas. No entanto, os métodos atuais de cultura do tipo colônia envolvendo hESCs e sua diferenciação em NPCs são ineficientes e muitas vezes envolvem cocultura, bem como o corpo embrionário (EB) e formação de rosetas^5,7,8,9. Esses protocolos apresentam menores taxas de sobrevida e diferenciação espontânea e são mais demorados.

Apresentado aqui é um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável e usa cultura de alta densidade tipo unicelular de hESCs¹⁰. A inclusão do inibidor roh-kinase (ROCK) contribuiu para aumentar significativamente a eficiência de sobrevivência durante a cultura do tipo unicelular do hESC^{10,11,12,13,14}. Neste sistema de cultura, hESCs podem ser facilmente mantidos e expandidos. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para gerar NPCs a partir da cultura do tipo unicelular de hESCs, que permite a produção de NPCs altamente puros. Inibição de BMP/TGFβ/activin sinalização vias com inibidores alk eficientemente induzir diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs^15,16, que então pode ser induzido a se diferenciar em linhagens neurais funcionais, tais como neurônios dopaminérgicos e astúcias.

Em resumo, o protocolo de cultura do tipo unicelular usando hESCs oferece um modelo atraente para estudar a diferenciação dessas células em várias linhagens, incluindo NPCs. Este protocolo é facilmente escalável e, portanto, adequado para a geração de células para pesquisas envolvendo terapia regenerativa e triagem de medicamentos.

Protocol

1. Preparação de placas revestidas de matriz de membrana de porão qualificadas por hESC

1. Descongele lentamente a matriz de membrana de porão qualificada ao hESC (ver Tabela de Materiais)solução em 4 °C por pelo menos 2-3 h ou durante a noite para evitar a formação de um gel.
2. Para preparar placas revestidas de matriz de membrana de porão, diluir matriz em DMEM/F12 a frio para uma concentração final de 2%. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL da solução de matriz diluída.
3. Incubar as placas revestidas de matriz de membrana do porão à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 3 h ou a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Placas com matriz de membrana de porão podem ser armazenadas a 4 °C por 1 semana antes que a solução da matriz seja removida e as placas sejam usadas.

2. Adaptação de hESCs tipo colônia para cultura hESC unicelular

1. Para passar as culturas livres de alimentador do tipo colônia H9 (WA09) hESCs cultivadas na matriz de membrana do porão, aspirar o meio dos poços (Figura 1A)⁹.
2. Lave 1x com 1 mL de DPBS. Adicione 1 mL de solução dispase (1 U/mL) por poço e incubar a 37 °C por 20 min.
3. Retire a dispase, lave as células 1x suavemente com 2 mL de DMEM/F12, retire o meio e adicione 2 mL de DMEM/F12 a cada prato.
4. Delicadamente separar colônias por suavemente tubulação para cima e para baixo e transferir para um tubo de 15 mL.
5. Centrífugaas as pelotas para 2 min em 370 x g e aspiram o meio.
6. Para dissociar as pelotas celulares em células individuais, adicione 2 mL de solução de desprendimento celular (concentração de 1x, ver Tabela de Materiais)e incubar a 37 °C por 10 minutos.
7. Células centrífugas por 2 min a 370 x g e remover a solução de desprendimento.
8. Adicione o mTeSR1 médio humano esc fresco e dissociar as células em células individuais por tubulação suave para cima e para baixo.
9. Para adaptar os hESCs do tipo colônia a uma cultura do tipo unicelular, placa de aproximadamente 1,5-2,0 x 10⁶ hESCs em cada poço da placa de 6 poços revestida smatrea de membrana do porão em 2 mL de mTeSR1 contendo 10 μM inibidor DE ROCHA por 24 h (Figura 1A).
10. Após 24 h, substitua o meio hESC por mTeSR1 fresco sem inibidor DE ROCHA e permita que os hESCs cresçam como um tipo unicelular por 3 dias. Mude o meio diariamente.
11. No dia 4, quando as culturas atingem quase 100% de confluência, dissociam as células em solução de desprendimento e, em seguida, reformulam conforme descrito no passo 2.6.
    NOTA: O inibidor da ROCHA melhora a sobrevivência celular durante os 24 h iniciais da cultura hESC do tipo unicelular.

3. Formação embrionária do corpo e diferenciação em três camadas germinas(Figura 2)

1. Para formar EBs, primeiro resuspender as células em 3 mL de mTeSR1 médio com inibidor de ROCHA 10 μM durante as primeiras 24 h, em seguida, incubar durante a noite em 60 milímetros pratos de baixa fixação em uma incubadora de 37 °C para permitir a gregação.
2. Após 24 h, os pequenos EBs são transferidos para um tubo de 15 mL. Deixe os EBs resolver até o fundo do tubo e retire suavemente o meio com uma pipeta. Transfira EBs para o meio EB (nocaute-DMEM complementado com substituição de soro de 20% por nocaute, suplemento de glutamina 1x [ver Tabela de Materiais],1% NEAA [aminoácidos não essenciais; ver Tabela de Materiais], e 0,2% β-mercaptoetanol) e permitir-lhes expandir em pratos de baixa fixação por 7 dias. O meio pode ser alterado a cada dois dias, conforme descrito acima (Figura 2A).
3. No dia 7, recolher os EBs dos pratos e transferi-los para um tubo de 15 mL. Retire suavemente o meio com uma pipeta e transfira os EBs para uma placa de 6 poços revestida de matriz de membrana do porão.
4. Permita que os EBs se anexem à placa e incubam por 12 dias no meio eb, durante os quais eles se diferenciarão nas três camadas germinas(Figura 2B). Mude o médium a cada dois dias.
   NOTA: Durante a agregação de células, o prato de baixa fixação ajuda a evitar o apego EB.

4. Diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs(Figura 3)

1. Para induzir a diferenciação de NPC, dissociar hESCs do tipo unicelular com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubação de 10 min a 37 °C.
2. Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de DMEM/F12 e resuspenda as células por tubulação suave.
3. Células de placa em uma placa de 6 poços revestidas de matriz de membrana do porão a uma densidade de 2 x 10⁵ células/poço em 2 mL de mTeSR1 contendo inibidor de ROCHA de 10 μM.
4. Após 24 h, substitua o meio de cultura pelo meio de indução neural (DMEM por 1% B27 menos vitamina A) complementado por 1 μM dorsomormorfina e 5 μM SB431542.
5. Mude o meio a cada dois dias durante os primeiros 4 dias de indução neural, em seguida, todos os dias até chegar a confluência no dia 7(Figura 3B).
   NOTA: (1) Dorsomorphin inibe a via BMP, visando ALK2,3,6 receptores e também inibe AMPK; SB431542 é um inibidor da via TGFβ/Activin, visando ALK5,7. (2) O mesmo protocolo foi testado com outra linha ESC (WA01), que produziu resultados semelhantes aos WA09¹⁶. (3) Nós usamos geralmente Matrigel para a matriz da membrana do porão; no entanto, as células podem ser cultivadas em Geltrex e, em seguida, diferenciadas em NPCs com resultados muito semelhantes, como indicado pela expressão de vários marcadores npc (Figura 4D,E). Lidar com Geltrex da mesma forma que Matrigel (ver seção 1).

5. Expansão npc e criopreservação

1. Após 7 dias de indução neural, dissociar as células com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubar para 10 min em 37 °C.
2. Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de npc expansão média (ver tabela de materiais)e resuspender as células por tubulação suave.
3. Placa 1 x 10⁵ células em 2 mL de npc de expansão média em membrana do porão matriz revestida 6 placas de poço.
4. Passagem npcs várias vezes, conforme necessário, quando as culturas atingem quase 90% de confluência. Durante as primeiras passagens 3-4, adicione 10 μM inibidor de ROCHA durante as 24 h iniciais para prevenir a morte celular. Após essas passagens, as células podem ser passagens e cultivadas sem inibidor de ROCHA. Mude o meio a cada dois dias durante a expansão.
5. Criopreservar NPCs quando as culturas atingem a confluência.
   1. Para criopreservação, dissociar as células em 1 mL de solução de desprendimento (1x) para 5 min a 37 °C, em seguida, suspensão centrífuga por 2 min em 370 x g para remover a solução de desprendimento.
   2. Adicione a solução de congelamento celular (ver Tabela de Materiais)para NPCs dissociados em 1 x 10⁶ células/mL e distribua 1 mL alíquotas para crioviais.
   3. Coloque os crioviais em recipiente de congelamento e armazená-los durante a noite em um freezer -80 °C.
6. Guarde os crioviais no nitrogênio líquido.

6. Preparação de placas revestidas poli-L-ornitina (OLP) e Laminin

1. Para preparar placas revestidas de OLP/laminina, diluir a solução de estoque da OLP em PBS ou água para uma concentração final de 10 μg/mL. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução de OLP diluída.
2. Incubar por pelo menos 2 h a 37 °C ou durante a noite a 4 °C.
3. Lave cada poço com PBS.
4. Diluir a solução de estoque de laminina em PBS frio ou água em 10 μg/mL. Misture bem a solução de laminado. Retire o PBS e revestir imediatamente cada bem com 1 mL da solução de laminado. Mantenha as placas a 4 °C e use dentro de 1 semana. Lave com PBS e adicione imediatamente o meio da cultura.
   NOTA: Não deixe que as placas revestidas de OLP/laminina sequem.

7. Diferenciação de NPCs derivados do hESC em neurônios dopaminérgicos(Figura 6A)

1. NPCs de placa em plo/pratos revestidos de laminina em meio de expansão npc em uma densidade de aproximadamente 50%.
2. Após 24 h, mude o meio para o meio DA1 (médio neurobasal contendo suplemento de glutamina 2 mM, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/mL SHH e 100 ng/mL FGF8) e mude o meio a cada dois dias.
3. Culturas de passagem quando atingem a confluência. Dissociar células com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubar por 10 min a 37 °C.
4. Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de da1 médio e resuspender as células por pipetting suave.
5. Placa 1 x 10⁵ células em 2 mL de da1 médio em PLO/ laminado revestido 6 placas de poço.
6. Após 10 dias, alteração para da2 médio (médio neurobasal contendo 2 mM suplemento de glutamina, 1x NEAA, 1x B27, 200 μM ácido ascórbico, 20 ng/mL BDNF, e 20 ng/mL GNDF) e mudar médio a cada dois dias por mais 20 dias (Figura 6A).
   NOTA: Adicione o ácido ascórbico fresco diariamente ao meio DA2. Nos primeiros 14 dias, as células diferenciadas devem ser passadas quando atingem 90% de confluência, mas não mais depois disso.

8. Diferenciação de NPCs derivados do ESC em Astrócitos

1. Células progenitoras neurais de placa em placas revestidas de OLP/laminina no meio de expansão do NPC a uma densidade de aproximadamente 50%.
2. Após 24 h, mude o meio para o meio astrocito (dmem/f12 médio incluindo 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/mL IGF, 10 ng/mL activin A, 10 ng/mL heregulin β-1, e 8 ng/mL bFGF) e alterar o meio a cada dois dias.
3. Culturas de passagem quando atingem a confluência. Dissociar células com 1 mL de solução de desprendimento (1x) e incubar por 10 min a 37 °C.
4. Centrífuga as células para 2 min em 370 x g e remover a solução de desprendimento supernatant. Adicione 1 mL de médio astrócito e resuspender as células por pipetting suave.
5. Placa 1 x 10⁵ células em 2 mL de meio de astrócito em PLO/estratificação revestida de 6 pratos bem.
6. Permitir que a diferenciação continue por um total de 5-6 semanas(Figura 6B).

9. Mancha de imunofluorescência

1. Células culturais em 35 mm μ-pratos como descrito acima para cada tipo de célula. Aspirar o meio e adicionar 1 mL de 4% pfa solução por prato e incubar por 20 min em RT.
2. Lave 2x por 5 min com PBS.
   NOTA: Uma vez que as células são fixas, as placas de ensaio podem ser seladas com parafilme e armazenadas a 4 °C. Mancha com um anticorpo dentro de 1 semana após a fixação.
3. Adicione 300 μL de solução de bloqueio (soro de cabra ou burro na PBS) por prato e incubar em RT por 30-60 min.
4. Lave o prato 2x com PBS por 5 min.
5. Adicione 300 μL de anticorpo primário (Tabela 1)solução (diluída em solução de bloqueio) e incubação em RT para 1,5 h ou durante a noite em 4 °C.
6. Lave 2x com PBS por 10 min.
7. Adicione 300 μL de anticorpo secundário fluorescente conjugado(Tabela 1)na solução de bloqueio e incubação no escuro por 1 h na RT.
8. Lave as células 2x por 10 min com PBS.
9. Adicione a solução de coloração Hoechst (1 μM concentração final em PBS) para manchar núcleos. Incubar as células no escuro por 5 min em RT.
10. Lave as células 1x com PBS por 5 min e, em seguida, adicione 500 μL de PBS. Mantenha os pratos no escuro, em seguida, observar a fluorescência com um microscópio confocal (Figura 2B, Figura 5C, Figura 6A,e Figura 7B).

Results

Apresentado aqui é um protocolo melhorado para a manutenção e expansão da cultura do tipo unicelular de hESCs e sua diferenciação eficiente em células progenitoras neurais, que posteriormente se diferencia em várias linhagens neurais a jusante, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos.

Imagens representativas de contraste de fase mostram morfologia celular em diferentes etapas durante a adaptação de hESCs tipo colônia para a cultura do tipounicelular( Figur...

Discussion

Métodos escaláveis e eficientes para a diferenciação de hESCs em várias linhagens e a geração de número suficiente de células diferenciadas são critérios importantes para o rastreamento de medicamentos e terapia com células-tronco. Vários métodos de passagem de células únicas foram publicados, nos quais as células são cultivadas na presença de inibidor de ROCHA ou outras pequenas moléculas para melhorar a sobrevivência, mas os produtos finais desses métodos de cultura são os hESCs tipo colônia^17,<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm m-pratos	ibidi	81156	Placa de cultura de células
Placas de 6 poços	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Solução de desprendimento de células
Activin A	R& D sistema	338-AC-050
Ácido Ascórbico	Sigma Aldrich	A4403
B27 suplemento	Thermo Fisher	17504044
suplemento B27 (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Applied Biological Materials	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
Centrifugador	DAMON/ICE	428-6759
Incubadora de CO2	Thermo Fisher	4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)	Corning	354277	Matriz de membrana basal (usada para a maior parte do protocolo aqui)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Solução de congelamento de células
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Soro Bovino Fetal	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Materiais Biológicos Aplicados	Z101705
GDNF	Applied Biological Materials	Z101057
Geltrex matrix	Thermo Fisher	A1569601	Matriz de membrana do porão
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Suplemento de glutamina,
linha de células-tronco embrionárias humanas 100X H9 (WA09)	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
Laminin Sigma		Aldrich L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC meio de cultura
N2 suplemento Thermo	Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P3655
Inibidor de ROCK	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Materiais Biológicos Aplicados	Z200617
Meio progenitor neural Stemdiff	Stemcell Technologies	5833	Meio de expansão NPC