Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Summary

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Abstract

A otimização de bioprocessos para aumentar o rendimento dos produtos desejados é de importância na indústria biofarmacêutica. Isso pode ser alcançado através da seleção de cepas e do desenvolvimento de parâmetros de bioprocesso. Frascos de agitação foram usados para este fim. Eles, no entanto, não têm a capacidade de controlar os parâmetros do processo, como pH e oxigênio dissolvido (DO). Essa limitação pode ser superada com a ajuda de um micro-bioreator automatizado. Estes bioreatores imitam o cultivo em uma escala maior. Uma das principais vantagens deste sistema é a integração do Design of Experiment (DOE) no software. Essa integração permite estabelecer um projeto onde vários parâmetros de processo podem ser variados simultaneamente. Os parâmetros críticos do processo e as condições ideais de bioprocesso podem ser analisados dentro do software. O foco do trabalho aqui apresentado é introduzir o usuário às etapas envolvidas na concepção do processo no software e incorporação do DOE dentro da corrida de cultivo.

Introduction

O mercado biofarmacêutico global valia mais de US$ 250 bilhões em 2018 e vem continuamente expandindo¹. As empresas farmacêuticas estão se afastando da produção de pequenos fármacos moleculares para terapêuticas biotecnológicas, como proteínas recombinantes. Só estes são responsáveis por uma receita de mais de US $ 150 bilhões¹. As células dos mamíferos são agora amplamente utilizadas para a produção dessas proteínas farmacêuticas recombinantes. No período atual, dos 68 produtos aprovados produzidos por células de mamíferos, 57 são produzidos por células chinesas de ovário hamster (CHO)². As célul....

Protocol

1. Procedimento de pré-cultura

NOTA: Células COD44 recombinantes com uma concentração celular viável de 1 x 10⁷ células/mL são usadas para este protocolo.

1. Descongele o frasco contendo 1,2 mL de células à temperatura ambiente e transfira imediatamente a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL contendo 10 mL de meio de semente sinuosa.
2. Centrifugar o tubo cônico de centrífuga por 5 minutos a 190 x g e temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
3. Pré-calor 150 mL do meio de sementes em um frasco de shake de 500 mL a 36,8 °C.
4. Refira suavemente a....

Results

Uma visão geral do cultivo realizado neste estudo é apresentada na Figura 2.

Figura 2: Representação esquemática das condições experimentais para testar perfis de pH e velocidade de agitador nas estações de cultura. A figura também representa o layout correto para colocar os vasos.

Discussion

A otimização do processo para aumentar o rendimento é de fundamental importância na indústria biofarmacêutica. Frascos de agitação poderiam potencialmente ser usados para a triagem da cepa; no entanto, o monitoramento dos parâmetros do processo, como pH e DO, não está disponível nos frascos. Os micro-bioreatores têm uma vantagem, pois permitem o monitoramento contínuo e o controle do processo. Esses laços de controle no micro-bioreator também fornecem uma condição semelhante àquelas em maior escala e, portanto, fornecem .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ponteiras de pipeta descartáveis de 1 mL, esterilizadas	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0040
200 mM L-glutamina	Corning, Merck	25-005-CV
24 Placas de poços profundos	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0038
Ponteiras de pipeta descartáveis de 5 mL, esterilizadas	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0039
ambr 15 automatizadas sistema de microbiorreator	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-2804
ambr 15 Cultura de células 24 biorreatores descartáveis - Sparged	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-1B86
Emulsão antiespumante C	Sigma-Aldrich, Merck	A8011
Filtro estéril de tampa de garrafa	Corning, Merck	CLS431474	0,1 μ m tamanho dos poros
CEDEX Detergente (3% Mucosol)	Roche Innovatis AG	05-650-658-001
Contador de células	Roche Innovatis AG	05-650-216-001	CEDEX HiRes
CHO DG44 linha celular	Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)	Sigma-Aldrich, Merck	CR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)	Sigma-Aldrich, Meio de produção Merck	CR80026
CHOKO	Sigma-Aldrich, Merck	CR80027
CHOKO Stock Culture Meium	Sigma-Aldrich, Merck	CR80028
Chromaster sistema de cromatografia líquida de alta pressão	VWR Tubo de
	Corning, Merck	SIAL0790
Etanol	Merck
Frascos de Glicina	Carl Roth	56-40-6
HPLC	VWR International	SUPLSU860181
PBS	Sigma-Aldrich,Merck	P4417
Coluna de Proteína A	Thermo Fisher Scientific	1502226	POROS™ A 1.7  mL
de cloreto de sódio	Sigma-Aldrich,Merck	7647-14-5
Fosfato de sódio dibásico anidro	Sigma-Aldrich,Merck	7558-79-4
Trypan Blue	VWR International	VWRVK940
YSI YSI	Inc	2900D	YSI 2900 Selecionar