Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Summary

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Abstract

O desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado requer uma coordenação precisa de comportamentos e interações celulares complexos. O uso de técnicas de imagem in vivo de alta resolução pode fornecer uma janela clara para esses processos no organismo vivo. Por exemplo, a divisão de células e sua descendência pode ser seguida em tempo real à medida que o sistema nervoso se forma. Nos últimos anos, os avanços técnicos em técnicas multicoloridas têm ampliado os tipos de questões que podem ser investigadas. A abordagem multicolor Brainbow pode ser usada não apenas para distinguir entre células semelhantes, mas também para codificar vários clones diferentes de células relacionadas que cada um deriva de uma célula progenitora. Isso permite uma análise de linhagem multiplex de muitos clones diferentes e seus comportamentos simultaneamente durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo sarco-íris ao longo do tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento. Isso é particularmente útil para acompanhar interações celulares entre células como células, que são difíceis de rotular diferencialmente usando cores tradicionais orientadas por promotores. Nossa abordagem pode ser usada para rastrear relações de linhagem entre vários clones diferentes simultaneamente. Os grandes conjuntos de dados gerados com essa técnica fornecem informações ricas que podem ser comparadas quantitativamente entre manipulações genéticas ou farmacológicas. Em última análise, os resultados gerados podem ajudar a responder perguntas sistemáticas sobre como o sistema nervoso se desenvolve.

Introduction

Nas fases iniciais do desenvolvimento, grupos de células progenitoras especializadas se dividem repetidamente em zonas proliferativas, produzindo diversos conjuntos de células filhas. As células nascidas durante esse período de desenvolvimento se diferenciarão e viajarão para formar os órgãos nascentes. No sistema nervoso, progenitores como glia radial dão origem a neurônios imaturos em zonas ventriculares. À medida que os neurônios migram para longe dos ventrículos e amadurecem, o tecido em expansão eventualmente forma as estruturas altamente complexas do cérebro^11,2,,3....

Protocol

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade Lewis & Clark.

1. Microinjeção de Embriões de Zebrafish

1. Configurar tipo selvagem, zebrafish adulto em tanques de acasalamento segregados por sexo na tarde anterior à realização de microinjeções^39,40.
2. Prepare a solução de DNA na manhã das microinjeções. Diluir hsp:Zebrabow¹¹ DNA plasmático para uma concentração de ~10 ng/μL em 0,1 mM KCl, juntamente com 2,5% de vermelho fenol e 3,75U Cre recombinação enzim....

Results

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a abordagem de imagem de lapso de tempo multicolor in vivo descrita aqui. Mostramos que os clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro-zebrafish em desenvolvimento¹⁴ (Figura 1).

Tipicamente, quando as células rotuladas por Brainbow eram dispostas ao longo de uma fibra radial particular, elas compartilhavam a mesma cor

Discussion

Este protocolo descreve um método para visualizar clones de células progenitoras e neurônios no cérebro-zebrafish em desenvolvimento e segui-los in vivo usando Brainbow e microscopia confocal de lapso de tempo¹¹. A principal vantagem deste protocolo em comparação com estudos in vitro ou ex vivo é a capacidade de observar diretamente a zona proliferativa do cérebro vertebrado em seu meio natural ao longo do tempo. Esta técnica baseia-se em estudos anteriores que rotularam um único clone usando veto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipeta de transferência de 1,5 mL (ponta fina)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-fenil-2-tioureia (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluído a 0,2 mM em E3 para prevenir a pigmentação do embrião
Tubos cônicos de 50 mL	Corning	352070	Para embriões que chocam o calor
Linha de pesca de nylon de 6 lb	SecureLine	NMT250	Para fazer manipuladores de embriões
Pipeta de transferência de 7,5 mL	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	Para
cotonetes	Puritan	867-WC SEM COLA	Para fazer manipuladores de embriões
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Banho seco digital	Genemate	490016-616	Usado para armazenar LMA a 42 ° C
			de dissecação de epifluorescência
Tubos capilares de vidro	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubadora	Forma Científica	3158	Para manter embriões a 28 &graus; C
Moldes de placa de injeção	Ferramentas de ciência adaptáveis	TU-1
Isotemp banho-maria	Fisher Scientific	2320	Para embriões de choque térmico
KCl	AMRESCO	0395	Para E3 e para solução de DNA para injeções
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	Para criar placas de injeção de agarose
Baixo ponto de fusão de agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Tanques de acoplamento	Aquaneering, Inc.
azul de metileno	Sigma	M9140	para E3
MgSO4	Sigma	9397	para micromanipulador
	E3 Instrumentos de precisão mundial	M3301
Extrator de micropipeta	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Estoque feito a 4 mg/mL em água de osmose reversa (RO) e, em seguida, adicionado gota a gota a E3 até a concentração final de 0,2 mM para anestesiar embriões
NaCl	J.T. Baker	4058-01	Para
placas de Petri E3 (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	Para abrigar embriões e criar câmara de imagem (60 mm)
Vermelho de fenol	Sigma	P0290
Marcadores	de anel de ponto macioTrevo Needlecraft, Inc.	354	Para criar câmara de imagem com placa de Petri
Super cola (controle Ultra gel)	Loctite	1363589	Para fazer manipuladores de embriões Agulhas
seringa	Beckton Dickinson	BD329412	Para descorionar embriões