Method Article

Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano

DOI:

10.3791/60610

⸱

March 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic, Cardiac and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen, 2Acandis GmbH, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Stuttgart, 4Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma avaliação abrangente da hemocompatibilidade de dispositivos de contato com o sangue usando implantes neurovasculares cortados a laser. Um modelo de loop de fluxo com sangue humano fresco e heparinizado é aplicado para imitar o fluxo sanguíneo. Após a perfusão, vários marcadores hematológicos são analisados e comparados aos valores obtidos diretamente após a coleta de sangue para avaliação da hemocompatibilidade dos dispositivos testados.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso crescente de dispositivos médicos (por exemplo, enxertos vasculares, stents e cateteres cardíacos) para fins temporários ou permanentes que permanecem no sistema circulatório do corpo exige uma abordagem confiável e multiparamétrica que avalia as possíveis complicações hematológicas causadas por esses dispositivos (ou seja, ativação e destruição de componentes sanguíneos). O teste abrangente de hemocompatibilidade in vitro de implantes de contato com o sangue é o primeiro passo para a implementação bem-sucedida in vivo. Portanto, a análise extensiva de acordo com a Organização Internacional para a Padronização 10993-4 (ISO 10993-4) é obrigatória antes da aplicação clínica. O ciclo de fluxo apresentado descreve um modelo sensível para analisar o desempenho hemostático dos stents (neste caso, neurovascular) e revelar efeitos adversos. O uso de sangue inteiro humano fresco e amostragem de sangue suave são essenciais para evitar a pré-ativação do sangue. O sangue é perfundido através de uma tubulação heparinizada contendo a amostra de ensaio usando uma bomba peristáltica a uma taxa de 150 mL/min a 37 °C por 60 min. Antes e depois da perfusão, marcadores hematológicos (i.e., contagem de células sanguíneas, hemoglobina, hematócrito e marcadores plasmáticos) indicando a ativação de leucócitos (polimorfonuclear [PMN]-elastase), plaquetas (β-tromboglobulina [β-TG]), o sistema de coagulação (thombin-antitrombina III [TAT]), e a cascata complementar (SC5b-9) são analisadas. Em conclusão, apresentamos um modelo essencial e confiável para testes extensivos de hemocompatibilidade de stents e outros dispositivos de contato com o sangue antes da aplicação clínica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aplicação in vivo de implantes e biomateriais, que interagem com o sangue humano, requer intensos testes pré-clínicos com foco na investigação de vários marcadores do sistema hemosático. A Organização Internacional para a Padronização 10993-4 (ISO 10993-4) especifica os princípios centrais para a avaliação de dispositivos de contato com o sangue (ou seja, stents e enxertos vasculares) e considera o projeto do dispositivo, utilidade clínica e materiais necessários1.

O sangue humano é um fluido que contém várias proteínas e células plasmáticas, incluindo leucócitos (glóbulos brancos [CS),eritrócitos (glóbulos vermelhos [RBCs]) e plaquetas, que realizam funções complexas no corpo humano2. O contato direto de materiais estranhos com sangue pode causar efeitos adversos, como a ativação do sistema imunológico ou coagulante, que pode levar a inflamações ou complicações trombóticas e problemas graves após a implantação3,4,5. Portanto, a validação da hemocompatibilidade in vitro oferece uma oportunidade anterior à implantação para detectar e excluir quaisquer complicações hematológicas que possam ser induzidas ao contato do sangue com uma superfície estranha6.

O modelo de loop de fluxo apresentado foi estabelecido para avaliar a hemocompatibilidade de stents neurovasculares e dispositivos similares, aplicando uma taxa de fluxo de 150 mL/min na tubulação (diâmetro de 3,2 mm) para imitar condições de fluxo cerebral e diâmetros da artéria2,7. Além da necessidade de um modelo in vitro ideal, a fonte de sangue é um fator importante na obtenção de resultados confiáveis e inalterados ao analisar a hemocompatibilidade de um biomaterial8. O sangue coletado deve ser usado imediatamente após a amostragem para evitar alterações causadas pelo armazenamento prolongado. Em geral, uma coleta suave de sangue sem estase usando uma agulha de 21 G deve ser realizada para minimizar a pré-ativação de plaquetas e a cascata de coagulação durante a coleta de sangue. Além disso, os critérios de exclusão dos doadores incluem aqueles que fumam, estão grávidas, estão em estado de saúde ruim ou tomaram contraceptivos orais ou analgésicos nos últimos 14 dias.

Este estudo descreve um modelo in vitro para o extenso teste de hemocompatibilidade de implantes de stent em condições de fluxo. Ao comparar os stents revestidos com fibrina-heparina, os resultados dos testes abrangentes de hemocompatibilidade refletem a hemocompatibilidade melhorada dos stents revestidos com fibrina-heparina9. Em contraste, os stents não revestidos induzem a ativação da cascata de coagulação, como demonstrado por um aumento nas concentrações de thombin-antitrombina III (TAT) e perda de números de plaquetas sanguíneas devido à adesão das plaquetas à superfície do stent. No geral, recomenda-se a integração deste modelo de hemocompatibilidade como teste pré-clínico para detectar quaisquer efeitos adversos no sistema hemosático causados pelo dispositivo.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O procedimento de amostragem de sangue foi aprovado pelo Comitê de Ética da faculdade de medicina da Universidade de Tuebingen (código de identificação do projeto: 270/2010BO1). Todos os sujeitos forneceram consentimento por escrito e informado para inclusão antes da participação.

1. Preparação de Monovetas carregadas de heparina

  1. Misture a heparina não diluída (5.000 UI/mL) com cloreto de sódio (NaCl, 0,9%) solução e preparar uma solução com uma concentração resultante de 15 UI/mL de heparina.
  2. Adicione 900 μL da solução de heparina diluída a cada monovette neutra (9 mL) para obter uma concentração final de heparina de 1,5 UI/mL após a amostragem de sangue. Prepare três monovetas por doador mais três monovetas de reserva e armazene as monovetas carregadas de heparina a 4 °C até a amostragem de sangue.

2. Amostragem de sangue

  1. Tire as monovetas carregadas de heparina da geladeira 30 min antes da amostragem de sangue.
  2. Coletar uma amostra de sangue de 27 mL de cada doador saudável (n = 5) por punção venosa para o ciclo de fluxo. Aplique apenas um torniquete liso para evitar a ativação prematura das plaquetas e da cascata de coagulação sanguínea.
  3. Coletar amostras de sangue em três monovetas contendo 900 μL da solução de heparina (1,5 UI/mL) e juntar todas as três monovetas em um recipiente plástico para garantir que todos os componentes sejam distribuídos uniformemente.
  4. Transfira diretamente o sangue heparinizado agrupado em três monovetas diferentes contendo EDTA (1,2 mL), citrato (1,4 mL), ou uma mistura de citrato, teorilina, adenosina e dippiridamole (CTAD, 2,7 mL) para coletar valores de linha de base. Proceda com as amostras conforme descrito nas seções 5-8.
    NOTA: Para garantir o comportamento de coagulação não influenciado, os doadores devem evitar a ingestão de drogas que afetam a hemostasia (por exemplo, ácido acetilsalicílico, naproxeno e carbenicillin) nos últimos 14 dias, bem como contraceptivos orais e tabagismo.

3. Preparação do Ciclo de Fluxo

  1. Corte três tubos de cloreto de polivinil revestido sino revestido de heparina com um comprimento de 75 cm e diâmetro interno de 3,2 mm. Carregue os tubos com os implantes neurovasculares cortados a laser com ou sem o revestimento de fibrina-heparina. Lembre-se de deixar uma banheira descarregada como controle.
  2. Coloque uma extremidade do tubo em um reservatório preenchido com 0,9% de NaCl, conecte a tubulação à cabeça da bomba e insira a outra extremidade em um cilindro de medição.
  3. Ajuste as configurações da bomba peristáltica para obter uma taxa de fluxo de 150 mL/min usando um temporizador enquanto verifica o nível de preenchimento no cilindro de medição.

4. Desempenho dos testes de hemocompatibilidade

  1. Use uma seringa de 12 mL para encher os tubos com sangue. Deixe 6 mL de sangue fluir suavemente em cada tubo contendo uma amostra ou controle descarregado.
  2. Forme um circuito e feche os tubos firmemente usando um tubo de conexão de silicone de 0,5 cm. Coloque os tubos em um banho de água de 37 °C e inicie a perfusão por 60 min.

5. Análise completa da contagem sanguínea

  1. Coloque 1,2 mL de sangue após a amostragem (linha de base) ou após a perfusão em uma monoveta contendo EDTA e inverta cuidadosamente o tubo 5x.
  2. Insira a monoveta no analisador de sangue e faça uma análise de hemograma para cada amostra. Em seguida, incubar as monovetas no gelo por 15-60 min após a medição da contagem sanguínea para análise posterior, conforme descrito na seção 7.

6. Coleção de Plasma citrato

  1. Encha as monovetas contendo citrato com 1,4 mL de sangue (recém-desenhado ou após a circulação) e inverta cuidadosamente 5x.
  2. Centrifugar os tubos por 18 min a 1.800 x g à temperatura ambiente (RT). Alice três amostras de 250 μL da fração de plasma em tubos de reação de 1,5 mL e congele as amostras de plasma em nitrogênio líquido. Guarde-os a -20 °C até a análise.

7. Coleção de plasma EDTA

  1. Incubar as monovetas no gelo por 15-60 min após a medição da contagem sanguínea. Em seguida, centrifugue os tubos por 20 min a 2.500 x g e 4 °C.
  2. Alition três amostras de 250 μL da fração de plasma em tubos de reação de 1,5 mL após a centrifugação e congelar os tubos em nitrogênio líquido. Guarde-os a -80 °C até a análise.

8. Coleção de Plasma CTAD

  1. Encha as monovetas contendo a mistura de CTAD com 2,7 mL de sangue (recém-desenhado ou após a incubação) e inverta cuidadosamente 5x. Depois, incubar as monovetas no gelo por 15-60 min. Em seguida, centrifugue os tubos por 20 min a 2.500 x g e 4 °C.
  2. Transfira 700 μL da fração de plasma médio para um tubo de reação de 1,5 mL e centrifuga os tubos de reação preenchidos por 20 min a 2.500 x g e 4 °C.
  3. Alition duas amostras de 100 μL da fração média em tubos de reação de 1,5 mL após a centrifugação e congele os tubos em nitrogênio líquido. Guarde-os a -20 °C até a análise.
    NOTA: A coleção de plasma EDTA e plasma CTAD pode ser realizada em conjunto porque as condições de operação são as mesmas.

9. Medição de TAT humano a partir de plasma citrato

  1. Descongele o plasma citrato em um banho de água de 37 °C.
  2. Use o kit de ensaio imunosorbent (ELISA) ligado à enzima TAT de acordo com as instruções do fabricante. Reconstruir os padrões plasmáticos e controlar e diluir a solução de lavagem, anticorpo conjugado anti-humano-TAT (POD) e solução cromogenal. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT (15-25 °C) por 30 min antes de iniciar o teste.
  3. Pipet 50 μL do tampão de amostra em cada poço da placa de microtiter e adicione 50 μL do tampão de amostra (em branco), padrão de plasma, controle de plasma e amostra de plasma não diluída em duplicatas à placa do poço. Sele a placa e incuba a 37 °C por 15 min com agitação suave. Em seguida, lave a placa 3x com 300 μL de solução de lavagem.
  4. Adicione 100 μL do anticorpo anti-humano-TAT conjugado pod a cada poço. Sele a placa e incuba a 37 °C por 15 min com agitação suave. Em seguida, lave a placa 3x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 100 μL da solução cromógena recém-preparada para cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 30 min.
  6. Remova a filme de vedação e adicione 100 μL de solução de parada a cada poço. Leia a densidade óptica (OD) com um fotômetro a 490-500 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

10. Medição de PMN-elastase de Plasma citrato

  1. Descongele o plasma citrato em banho-maria a 37 °C.
  2. Use o kit polimorfonuclear (PMN)-elastase ELISA de acordo com as instruções do fabricante: reconstrua o controle PMN-elastase e o padrão PMN-elastase para preparar uma curva padrão usando o tampão de diluição do kit.
  3. Diluir a solução de lavagem de acordo com a descrição do fabricante. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT por 30 min antes de iniciar o teste. Diluir as amostras de plasma citrato para 1:100 com o tampão de diluição.
  4. Adicione 100 μL do tampão amostral (em branco), a curva padrão PMN-elastase (15,6-1.000 ng/mL), os controles PMN-elastase (altas e baixas concentrações) e amostras de plasma diluídas em duplicatas para a placa do poço. Sele a placa e incubar-se em RT por 60 min com agitação suave. Depois, lave a placa 4x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 150 μL do anticorpo conjugado com enzimas a cada poço. Sele a placa e incubar-se em RT por 60 min com agitação suave. Depois, lave a placa 4x com 300 μL de solução de lavagem.
  6. Adicione 200 μL da solução de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)-substrato para cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 20 min no escuro. Em seguida, remova a película de vedação e adicione 50 μL da solução de parada a cada poço.
  7. Leia o OD com um fotômetro a 450 nm com uma leitura de referência a 630 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

11. Medição do Complexo Complementar terminal (TCC) do PLASMA EDTA

  1. Descongele o plasma EDTA em um banho de água a 37 °C, e armazene no gelo após o descongelamento.
  2. Utilize o kit eLISA em cascata complementar SC5b-9 de acordo com as instruções do fabricante: diluir a solução de lavagem conforme descrito no protocolo do fabricante. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT por 30 min antes de iniciar o teste. Diluir as amostras de plasma EDTA para 1:10 com o tampão de diluição do kit.
  3. Adicione 300 μL de solução de lavagem a cada poço para reidratar a superfície e aspirar após 2 min. Adicione 100 μL do tampão de amostra (em branco), padrões SC5b-9, controles SC5b-9 (altas e baixas concentrações) e as amostras de plasma diluídas em duplicatas para a placa do poço.
  4. Sele a placa e incubar em RT por 60 min. Em seguida, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 50 μL do anticorpo conjugado com enzimas em cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 30 min. Em seguida, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  6. Adicione 100 μL da solução tmb-substrato a cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 15 min no escuro.
  7. Remova a filme de vedação e adicione 100 μL da solução de parada a cada poço. Leia o OD com um fotômetro a 450 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

12. Medição de β-tromboglobulna do Plasma CTAD

  1. Descongele o plasma CTAD em banho-maria a 37 °C.
  2. Use o kit β-tromboglobulina (β-TG) ELISA de acordo com as instruções do fabricante: reconstrua o controle β-TG e o padrão β-TG e dilua a solução de lavagem usando h2O. Reconstrua o anticorpo conjugado com POD usando o tampão de fosfato fornecido. Deixe todos os reagentes e a placa de microtiter em RT por 30 min antes de iniciar o teste.
  3. Prepare a curva padrão e o controle de acordo com as instruções do fabricante com o tampão de fosfato fornecido. Diluir as amostras de plasma CTAD para 1:21.
  4. Adicione 200 μL do tampão fosfato (em branco), padrões β-TG, controles β-TG (altas e baixas concentrações) e amostras de plasma diluídas em duplicatas para a placa do poço. Sele a placa e incubar em RT por 60 min. Depois, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  5. Adicione 200 μL do anticorpo conjugado com enzimas a cada poço. Sele a placa e incubar em RT por 60 min. Depois, lave a placa 5x com 300 μL de solução de lavagem.
  6. Adicione 200 μL da solução tmb-substrato a cada poço. Sele a placa e incubar-se em RT por 5 min no escuro. Remova a película de vedação e pare a reação adicionando 50 μL de ácido sulfúrico de 1 M (H2SO4) a cada poço.
  7. Deixe a placa por 15-60 min, depois leia o OD com um fotômetro a 450 nm. Encaixe os dados da curva padrão como linha de tendência e calcule a concentração das amostras.

13. Preparação da amostra para microscopia eletrônica de varredura

  1. Remova o implante do tubo usando fórceps e enxágue o implante brevemente mergulhando-o em 0,9% solução NaCl 3x.
  2. Armazenar na solução de glutaraldeído (2% glutaraldeído em soro tampão de fosfato [PBS-buffer sem Ca2+/Mg2+]) durante a noite a 4 °C.
  3. Em seguida, incubar os implantes em PBS-tampão por 10 min. Desidratar as amostras incubando no etanol com concentração crescente de 10 min cada: 40, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% e 100%. Guarde as amostras desidratadas em 100% de etanol até análise suplementar.
  4. Realize a secagem de ponto crítico de acordo com as instruções do dispositivo de secagem ou literatura10 pouco antes de digitalizar a microscopia eletrônica (SEM).

14. Microscopia eletrônica de varredura

  1. Conecte os implantes secos a um portador de amostra para o microscópio de varredura e sputter as amostras com paládio de ouro.
  2. Introduza os implantes sputtered na câmara de amostra. Tire fotos em ampliação de 100, 500, 1.000 e 2.500 vezes das áreas com a superfície representativa e aadesão celular.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resumido resumidamente, todo o sangue humano foi coletado em monovetas carregadas de heparina e então agrupadas e usadas para avaliar os níveis de base da contagem celular, bem como marcadores de hemocompatibilidade plasmática.

Posteriormente, o tubo contendo as amostras de implante neurovascular foi preenchido, e o sangue foi perfundido por 60 min a 150 mL/min e 37 °C usando uma bomba peristáltica. Novamente, o número de células foi analisado em todos os grupos, e as amostras de plasma foram ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado descreve um método abrangente e confiável para o teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue de acordo com a ISO 10993-4 em um modelo de fluxo de cisalhamento imitando o fluxo sanguíneo humano. Este estudo baseia-se no teste de implantes neurovasculares cortados a laser, mas pode ser realizado com uma variedade de amostras. Os resultados demonstram que este método permite a análise ampla de vários parâmetros, como a contagem de células sanguíneas, prevalência de vários marcad...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pela realização da microscopia eletrônica de varredura, agradecemos a Ernst Schweizer da seção de Ciência e Tecnologia de Materiais Médicos do Hospital Universitário tuebingen. A pesquisa contou com o apoio do Ministério da Educação, Juventude e Esportes do CR dentro do Programa Nacional de Sustentabilidade II (Projeto BIOCEV-FAR LQ1604) e pelo projeto da Fundação Ciência Tcheca nº 18-01163S.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
aqua ad iniectabiliaFresenius-Kabi, Bad-Homburg, Alemanha1088813
beta-TG ELISADiagnostica Stago, Düsseldorf, Alemanha00950
Centrífuga Rotana 460 RAndreas Hettich, Tuttlingen,Alemanha-Citrat
monovettes (1,4 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha6,16,68,001
monovettes CTAD (2,7 mL)BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha367562
monovettes EDTA (1,2 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha6,16,62,001
Etanol p.A. (1000 mL)AppliChem, Darmstadt, Alemanha1,31,08,61,611
Glutaraldeído (25% em água)SERVA Electroforese, Heidelberg, Alemanha23114.01
Revestimento de heparina para tubosEnsion, Pittsburgh,
(25.000 IE/ 5 mL)LEO Pharma, Neu-Isenburg, AlemanhaPZN 15261203
Leitor Multiplaca Mithras LB 940Berthold, Bad Wildbad,Alemanha-NaCl
0,9%Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Alemanha1312813
Monovettes neutros (9 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha2,10,63,001
Tampão PBS (sem Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha70011044
Bomba peristáltica ISM444BCole Parmer, Wertheim, Alemanha3475
Pipeta (100 µ L)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemanha3124000075
Pipeta (1000 µ L)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemanha3123000063
Recipiente de plástico (100 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha7,55,62,300
PMN-Elastase ELISADemeditec Diagnostics, Kiel AlemanhaDEH3311
Tubo de cloreto de polivinilaSaint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie França-Tubos
reação (1,5 mL)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Alemanha30123328
implantes neurovasculares cortados a laserAcandis GmbH, Pforzheim01-0011x
SC5b-9 ELISATECOmedical, Buende, AlemanhaA029
Microscópio eletrônico de varreduraCambridge Instruments, Cambridge, ReinoUnido-Fita de
96 poços)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha15036
Seringa 10/12 mL Norm-JectHenke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Alemanha10080010
Kit micro TATSiemens Healthcare, Marburg, AlemanhaOWMG15
Tipo de Banho de Água 1083Gesellschaft fü r Labortechnik, Burgwedel, Alemanha-
EUA-Heparina-Natrium de vedação (placa de

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