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Artigo de método

Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

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DOI:

10.3791/60653

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25 de março de 2020

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1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

Neste artigo

Resumo

Aqui, dois modelos de cicatrização de feridas murinasão são descritos, um projetado para avaliar as respostas de cicatrização celular e citocina e o outro para quantificar a taxa de fechamento da ferida. Esses métodos podem ser usados com modelos de doenças complexas, como o diabetes, para determinar mecanismos de vários aspectos da má cicatrização de feridas.

Resumo

A cicatrização de feridas é um processo complexo que requer a progressão ordenada da inflamação, formação de tecido de granulação, fibrose e resolução. Os modelos murine fornecem uma valiosa visão mecanicista sobre esses processos; no entanto, nenhum modelo único aborda totalmente todos os aspectos da resposta de cicatrização de feridas. Em vez disso, é ideal usar vários modelos para abordar os diferentes aspectos da cicatrização de feridas. Aqui, dois métodos diferentes que abordam diversos aspectos da resposta à cicatrização de feridas são descritos. No primeiro modelo, esponjas de álcool polivinil são subcutâneamente implantadas ao longo do dorsum do rato. Após a recuperação da esponja, as células podem ser isoladas por ruptura mecânica, e os fluidos podem ser extraídos por centrifugação, permitindo assim uma caracterização detalhada das respostas celulares e citocinas no ambiente agudo da ferida. Uma limitação desse modelo é a incapacidade de avaliar a taxa de fechamento de feridas. Para isso, utiliza-se um modelo de excisão da pele da cauda. Neste modelo, um pedaço retangular de 10 mm x 3 mm da pele da cauda é excisado ao longo da superfície dorsal, perto da base da cauda. Este modelo pode ser facilmente fotografado para análise planimétrica para determinar as taxas de cura e pode ser extirparado para análise histológica. Ambos os métodos descritos podem ser utilizados em cepas de camundongos geneticamente alteradas, ou em conjunto com modelos de condições comórbidas, como diabetes, envelhecimento ou infecção secundária, a fim de elucidar mecanismos de cicatrização de feridas.

Introdução

Existem muitos sistemas de modelos murine disponíveis para examinar processos de cicatrização de feridas, cada um possuindo vantagens e limitações específicas1,2. Os seguintes métodos apresentam dois modelos de ferida murina, cada um dos quais aborda um aspecto específico da resposta de cicatrização da ferida, e que podem ser usados para identificar a causa e o efeito das perturbações na resposta à lesão. O processo de cicatrização de feridas ocorre em fases distintas. A primeira fase é inflamatória, caracterizada pelo rápido fluxo de plaquetas, neutrófilos e monócitos/macrófagos, bem como pela produção de citocinas proinflamatórias e quimiocinas. Após a resolução da inflamação, o ambiente passa para um estado mais reparador com a indução de citocinas profibroticas e proangiogênicas e fatores de crescimento. O tecido de granulação é depositado e os neovasos se formam com a migração de miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliais e células endoteliais. Nos estágios finais, a matriz extracelular provisória é remodelada, e a formação da cicatriz e o fechamento da ferida prosseguem2,3,4,5,6,7,8.

Nenhum modelo de murina único fornece um sistema para estudar todos os estágios de cicatrização de feridas2. Aqui, dois modelos de feridas cirúrgicas são descritos: um elucida respostas agudas de cicatrização celular e citocina, e o outro permite a avaliação do fechamento da ferida, bem como análises histológicas. Esses dois métodos podem ser empregados de forma complementar para avaliar os efeitos de uma perturbação ou comorbidade em diferentes aspectos da resposta à cicatrização de feridas. A implantação subcutânea dorsal de esponjas de álcool polivinilolito (PVA) é um sistema que tem sido usado em modelos de roedores há décadas para elucidar inúmeros aspectos das respostas do tecido celular e de granulação9,,10,,11,,12,,13,,14,15,,16,,17,18,19,20 ,21,,22,,23,,24. Esta abordagem permite a recuperação de fluidos de feridas ricos em citocinas e infiltrações celulares. Neste modelo, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm de esponja PVA são colocados em bolsos subcutâneos através de uma incisão de 2 cm feita na linha média dorsal posterior. A incisão é fechada com clipes cirúrgicos, e as esponjas podem ser recuperadas posteriormente para isolamento celular e fluido. O meio celular e citocina de esponjas isoladas reflete os estágios normais de cicatrização aguda da ferida até cerca de 14 dias após a implantação. Em pontos posteriores, o modelo é mais vantajoso para estudar a formação de tecidos de granulação e a resposta do corpo estranho1. Com este sistema, é possível isolar >106 células, o que oferece uma vantagem distinta para ensaios ofotinópicos e funcionais e isolamento de RNA, sobre células isoladas de outros métodos baseados em biópsia1,22,23,25,26.

A taxa de fechamento da ferida é determinada usando o modelo de excisão da pele da cauda. Neste modelo, como descrito inicialmente por Falanga et al. e relatado por outros27,28,29,30, uma seção de espessura total de 1 cm x 0,3 cm da pele da cauda é removida perto da base da cauda. A área da ferida é facilmente visualizada e pode ser medida ao longo do tempo. Alternativamente, o tecido da cauda pode ser isolado para análise histológica. Esta abordagem pode ser usada como uma alternativa ou em conjunto com o método bem estabelecido de biópsia de perfuração dorsal. As principais distinções entre esses dois modelos são a taxa de fechamento da ferida, a presença ou ausência de peles, e a estrutura da pele2,31,32. As feridas da pele da cauda oferecem um prazo mais longo para avaliar o fechamento da ferida, pois leva aproximadamente 21 dias para que ocorra o fechamento total. Isso se opõe às biópsias de socos dorsais não desponadas, que cicatrizam muito mais rápido (~7-10 dias), principalmente por contração devido à ação do carnoso panniculus. As biópsias de perfuração dorsal estaladas curam-se mais lentamente e diminuem os efeitos da cicatrização contífica, mas dependem da presença de um corpo estranho para restringir os mecanismos de contração11,2,,27,,30,,31,33.

Os modelos de feridas descritos são informativos para a compreensão dos processos normais de cicatrização de feridas na ausência de perturbação. Embora a cicatrização da pele de roedor difere de formas muito significativas da pele humana, incluindo estrutura solta, dependência da cura de contrações e outras diferenças anatômicas, o sistema murine oferece certas vantagens para estudos mecanicistas e de triagem. Entre eles está a disponibilidade de cepas de raça e mutantes genéticos, trabilidade genética e menor custo. A percepção mecanicista obtida a partir de estudos de murina pode ser traduzida em modelos animais complexos que imitam mais de perto a cicatrização da pele humana, como o sistema suíno2,31.

Além de examinar as respostas de cicatrização de feridas no estado estável, esses modelos podem ser combinados com condições comórbidas para entender a base de defeitos de cicatrização de feridas no nível celular, citocina e tecido bruto. É neste cenário específico que os dois modelos podem ser utilizados em conjunto para avaliar os efeitos de uma determinada condição comórbida, como pneumonia pós-operatória, tanto na resposta aguda de cicatrização da ferida celular quanto na taxa de fechamento da ferida30.

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Protocolo

Todos os estudos em animais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso De Animais Institucionais da Universidade Brown e realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais dos Institutos Nacionais de Saúde.  NOTA: no vídeo, a cortina cirúrgica foi omitida para fins de demonstração.

1. Implantação subcutânea de esponjas PVA

  1. Use uma tesoura para cortar folhas de esponja PVA em pedaços de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Reidrate os pedaços de esponja PVA submergindo-os em 1x PBS estéril em um béquer.
  2. Autoclave as esponjas em 1x PBS para esterilizar, e esfriar completamente. Armazene esponjas autoclaved em 1x PBS estéril a 4 °C.
  3. Antes de realizar a implantação cirúrgica, alíquota o número necessário de esponjas em um prato de cultura estéril em condições estéreis em uma capa de fluxo laminar. Guarde as esponjas extras em 1x PBS estéril a 4 °C para uso futuro. Certifique-se de que as esponjas incharam para 1 cm x 1 cm x 0,5 cm após a reidratação. Uma imagem de esponjas PVA desidratadas é mostrada na Figura 1A.
    NOTA: Para manter a esterilidade do local cirúrgico, o procedimento de implantação da esponja PVA requer um indivíduo para manusear o rato e preparar o local cirúrgico, e uma segunda pessoa para realizar a implantação.
  4. Anestesiar um rato C57BL/6J macho de 8-12 semanas de idade por injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia.  Confirme a profundidade da anestesia pela perda de um reflexo do pedal. Prepare o local cirúrgico removendo o cabelo ao longo do dorso com cortadores. Utilizando gaze estéril, aplique solução de povidone-iodo na área de raspagem 2x, seguida por 70% de etanol.
  5. Coloque o rato em cortinas cirúrgicas estéreis. Coloque uma almofada aquecida abaixo das cortinas cirúrgicas para manter a temperatura do núcleo do mouse.
  6. Use luvas cirúrgicas estéreis para a realização da cirurgia. Puxe a pele dorsal para longe do tecido subjacente com fórceps, e usando uma tesoura cirúrgica estéril, faça uma incisão de 2 cm ao longo da linha média dorsal aproximadamente 2 cm anterior à base da cauda. Enquanto segurar a incisão aberta com fórceps estéreis, use uma tesoura cirúrgica estéril curvada e de ponta cega para formar um bolso subcutâneo ao longo do dorso em uma das posições indicadas na Figura 1B.
  7. Continue a usar fórceps para levantar a pele do tecido subjacente. Usando uma tesoura cirúrgica estéril, aperte suavemente uma esponja PVA no prato de cultura para remover o excesso de PBS. Pegue a esponja PVA por um canto usando uma tesoura cirúrgica estéril e, levando com o canto segurado pela tesoura, coloque a esponja no bolso subcutâneo formado no passo 1.4.
  8. Repita este processo 5x, colocando um total de seis esponjas em bolsos subcutâneos, conforme mostrado na Figura 1B.
  9. Aperte a pele dorsal incisada juntamente com fórceps estéreis e feche a incisão com dois clipes de ferida de aço inoxidável.
  10. Use um novo conjunto de instrumentos cirúrgicos estéreis para cada rato. Alternativamente, use um esterilizador de miolos para esterilizar instrumentos entre ratos.

2. Isolamento de fluidos de esponjas PVA

  1. Para avaliar o meio de citocina aguda da ferida, isole esponjas entre 1 e 14 dias após a implantação.
  2. Prepare um tubo de coleta de fluidos aninhando o barril de uma seringa de 5 mL em um tubo de cultura de 16 mL.
  3. Eutanie um rato com esponjas PVA implantadas por asfixia de CO2 seguida de luxação cervical.
  4. Remova os grampos cirúrgicos e abra a incisão com fórceps dentados. Use uma tesoura para estender a incisão ao longo da linha média dorsal.
  5. Usando fórceps, extraia uma esponja do bolso subcutâneo e transfira-a para o barril de seringa preparado, tendo o cuidado de minimizar a pressão sobre a esponja. Desassociar qualquer tecido conjuntivo que permaneça aderido à superfície da esponja. Use uma tesoura para dissecar a esponja do tecido circundante, se necessário. Repita o processo de remoção da esponja com as esponjas restantes. Coloque o tubo contendo as esponjas no gelo.
  6. Para isolar o fluido da ferida, centrifugar o tubo de cultura contendo a seringa de 5 mL com as esponjas a 700 x g por 10 min.
  7. Após a centrifugação, descarte a seringa e as esponjas. O fluido da ferida será coletado no tubo de cultura de 16 mL. Uma imagem representativa do fluido coletado de uma ferida dia 7 é mostrada na Figura 1D. Transfira o fluido da ferida para um tubo limpo para armazenamento a -80 °C.

3. Isolamento das células das esponjas PVA

  1. Para avaliar o meio celular de cicatrização aguda da ferida, colete esponjas entre 1-14 dias após a implantação da esponja. Esponjas obtidas de uma ferida 7 dias após a implantação são mostradas na Figura 1E.
  2. Preparar o meio de coleta contendo 1x HBSS (+cálcio/+magnésio/-fenol vermelho) suplementado com 1% de FBS, 1% HEPES e 1% de penicilina-estreptomicina.
  3. Alíquota de 5 mL do meio de coleta HBSS em um tubo cônico de 15 mL.
  4. Extrair as esponjas PVA de camundongos eutanizados como descrito em 2.2-2.4. Coloque as esponjas no tubo cônico contendo 5 mL de meio de coleta HBSS.
  5. Transfira as esponjas e o meio de coleta HBSS para um saco de liquidificador de 80 mL derramando. Pendure o saco do liquidificador da escotilha do liquidificador de pás, posicionado de modo que as pás atinjam as esponjas e a mídia. Ajuste as configurações do liquidificador de pás para funcionar em alta por 60 s. Pressione a partida.
  6. Transfira a mídia do saco do liquidificador de volta para o tubo cônico de 15 mL com uma pipeta, deixando as esponjas para trás no saco. Aperte as esponjas para liberar completamente a mídia. Ajuste as configurações do liquidificador de pás para funcionar por 30 s no alto. Adicione 5 mL de mídia ao saco do liquidificador e repita o processo de estômago 2x para um total de três lava-esponjas.
  7. Centrifugar o tubo cônico a 250 x g por 5 min. Uma pelota vermelha de células e glóbulos vermelhos será visível na parte inferior do tubo cônico após a centrifugação.
  8. Descarte o sobrenadante e realize uma lse de glóbulos vermelhos: adicione 900 μL de dH2O à pelota celular e pipeta para misturar. Neutralizar com 100 μL de 10x PBS. Adicione 4 mL de 1x PBS ao tubo para neutralizar totalmente a líse, depois centrífuga a 250 x g por 5 min.
    NOTA: O passo da lyse deve ser breve; Deixar a água em contato com as células para mais de 3-5 s pode resultar em lse de glóbulos não vermelhos.
  9. Após a centrifugação, uma pelota de células brancas contendo células feridas desprovidas de glóbulos vermelhos estará presente na parte inferior do tubo cônico. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota celular no meio desejado para análises a jusante.

4. Análise opcional de citometria de fluxo de leucócitos inatos isolados de feridas de esponja PVA

  1. Resuspender 0,5-1 x 106 células feridas em 25 μL de uma solução de 2x de anticorpo de bloqueio contendo 10 μg/mL anti-CD16/CD32 FcRγII/III anticorpo diluído em 1x PBS + 1% BSA.
    NOTA: Todos os anticorpos devem ser titulados para determinar concentrações ideais para análise de citometria de fluxo.
  2. Incubar as células com anticorpo de bloqueio por 10 min no gelo.
  3. Faça uma mistura 2x master de anticorpos contendo 2,5 mg/mL de PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/mL de FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F e 10 mg/mL de eFluor660-F4-80 diluído em 1x PBS + 1% BSA. Adicione diretamente 25 μL do coquetel de anticorpos às células incubando no anticorpo de bloqueio.
  4. Incubar as células por 20 min no gelo, protegidas da luz.
  5. Lave as células 2x com 1x PBS.
  6. Faça uma mistura mestre de amina-reativa viável viabilidade dye-eFluor506 diluída 1:1.000 em 1x PBS. Resuspenda a pelota celular em 50 μL da solução de tino de viabilidade.
    NOTA: O soro deve ser excluído da etapa de viabilidade fixável, pois evitará a ligação do tintura a proteínas endógenas. Incubar as células por 20 min no gelo, protegidas da luz.
  7. Lave as células 2x com 1x PBS. Resuspenda a pelota celular em 50 μL de 1% de paraformaldeído.
  8. Incubar as células com 1% de paraformaldeído por 15 min no gelo, protegidas da luz.
  9. Lave as células 1x com 1x PBS e resuspenda a pelota em 1x PBS para análise citométrica de fluxo.

5. Excisão da pele da cauda

  1. Anestesiar um rato C57BL/6J macho de 8-12 semanas de idade por injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia. Confirme a profundidade da anestesia pela perda de um reflexo do pedal.
  2. Prepare o local cirúrgico na cauda do rato anestesiado utilizando gaze estéril para aplicar a solução de povidone-iodo 2x, seguida de uma aplicação de 70% de etanol.
  3. Defina uma seção de 10 mm x 3 mm na superfície dorsal da cauda, 10 mm da base da cauda(Figura 1C)usando um marcador permanente para rastrear a partir de um modelo pré-fabricado.
  4. Coloque o mouse anestesiado em cortinas cirúrgicas estéreis.
  5. Use luvas cirúrgicas estéreis para realizar os procedimentos cirúrgicos. Com uma lâmina de bisturi estéril, faça uma incisão de espessura total ao longo das bordas direita, inferior e esquerda da área da ferida.
  6. Usando fórceps estéreis, retire a pele excisada da cauda e use uma tesoura cirúrgica estéril para cortar a borda superior da área da ferida.
  7. Aplique pressão com gaze estéril para parar o sangramento.
  8. Aplique uma aplicação de barreira de spray no leito da ferida.
  9. Fotografe as feridas de uma distância fixa em intervalos de tempo regulares. Analisar fotografias por análise planimétrica para determinar as medições da área da ferida. Alternativamente, use pinças para obter medidas de comprimento e largura da ferida.

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Resultados

Resposta inflamatória sistêmica após implantação de esponja PVA
A cirurgia de implantação da esponja PVA gerou uma resposta inflamatória sistêmica, como demonstrado pela indução de IL-6 no plasma 1 dia após a ferida(Figura 2A). Outras citocinas proinflamatórias, incluindo TNF-α e IL-1β, bem como uma série de quimiocinas, incluindo CCL2 e CXCL1, foram induzidas sistemicamente nos primeiros 7 dias após a implantação da esponja PVA, e foram descritas em outros lugares

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Discussão

Este artigo descreve dois modelos de ferida murina tratável que permitem a avaliação da resposta aguda de cicatrização da ferida. O primeiro método envolve a implantação cirúrgica de esponjas PVA no espaço subcutâneo dorsal. Esta abordagem oferece uma vantagem distinta sobre os modelos de feridas baseadas em biópsia para estudar a resposta de cicatrização de feridas celulares devido ao grande número de células e quantidade de fluidos de ferida obtidos a partir das esponjas isoladas. Para a execução bem sucedida deste pro...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Kevin Carlson do Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility para consulta e assistência com experimentos de citometria de fluxo. As imagens das Figuras 1B e C foram criadas com o BioRender. Kayla Lee e Gregory Serpa são gratos por sua assistência fotográfica. Este trabalho foi apoiado por subsídios da seguinte: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Instituto Nacional de Ciência ambiental (NIES) T32-ES7272 (Treinamento em Patologia Ambiental) e o Prêmio Brown University Research Seed Award.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x Tampão com Fosfato SalinoFisher ScientificBP3991
Tubos de centrífuga de 15 mL, OlympusGenesee28-103
1x HBSS (+Cálcio, +Magnésio, – Vermelho de fenol)ThermoFisher Scientific14025076
Seringa de 5mlBD309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750BioLegend109852Clone 104
Anti-mouse F4 / 80-eFluor660ThermoFisher Scientific50-4801-82Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITCBD Biosciences553104Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710ThermoFisher Scientific46-9668-82Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700BD Biosciences565183Clone E50-2440
Aplicador de Clipe de Aço Inoxidável AutoclipBraintree ScientificNC9021392
Autoclip Clipes de Aço Inoxidável, 9mmBraintree ScientificNC9334081
Saco Liquidificador, 80mLde Cultura 14258201Fisher
Scientific, 16mL, 17x100Genesee Scientific21-130
Soro Fetal Bovino - PadrãoThermoFisher Scientific10437028
Corante de Viabilidade Fixável eFluor506ThermoFisher Scientific65-0866-14
Solução de Hepes, 1MGenesee Scientific25-534
ImageJ SoftwareNIH
Penicilina-Estreptomicina (5000 U/mL)ThermoFisher Scientific15070-063
Esponja de álcool polivinílico - tamanho de poro grandeIvalon/PVA Unlimitedwww.sponge-pva.com
Solução de iodopovidona, 10%Fisher Scientific3955-16
Filme de barreira de spray, Cavilon3M3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110VSeward0080/000/AJ
Tubo

Referências

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