A preparação de complexos de cobalto pincer SNS (II) de álcool hepático desidrogenase é apresentada aqui. Os complexos podem ser preparados reagindo ao precursor do ligante com CoCl2·6H2O e podem então ser recristalizados permitindo que o éter dietil se difunde lentamente em uma solução de acetonitrilo que contém o complexo de cobalto.
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Artigo de método
Preparação de Complexos modelo sns cobalto(ii) de álcool hepático desidrogenase
Neste artigo
Resumo
Resumo
Complexos de modelos químicos são preparados para representar o local ativo de uma enzima. Neste protocolo, uma família de precursores de ligadores de pinça tridentato (cada um possuindo duas funcionalidades de átomo de doador de nitrogênio (SNS) e baseada sinuosa (compostos de bis-imidazole ou bis-triazole) são metalizadas com cocl2·6H2O para pagar complexos de cobalto de pinça sns tridentado(II). A preparação dos complexos do modelo de cobalto(II) para álcool hepático desidrogenase é fácil. Com base em uma rápida mudança de cor ao adicionar o CoCl2·6H2O à solução acetonitrila que contém o precursor do ligante, o complexo se forma rapidamente. A formação do complexo metálico é completa depois de permitir que a solução reflua durante a noite. Estes complexos de cobalto (II) servem como modelos para o local ativo de zinco no álcool hepático desidrogenase (LADH). Os complexos são caracterizados por difração de raios-X de cristal único, espectrometria de massa eletrospray, espectroscopia visível ultravioleta e análise elementar. Para determinar com precisão a estrutura do complexo, sua estrutura cristalina única deve ser determinada. Cristais únicos dos complexos adequados para a difração de raios-X são então cultivados através da difusão lenta de vapor de éter dietil em uma solução de acetonitrilo que contém o complexo de cobalto(II). Para cristais de alta qualidade, a recristalização normalmente ocorre durante um período de 1 semana, ou mais. O método pode ser aplicado à elaboração de outros complexos de coordenação de modelos e pode ser utilizado em laboratórios de ensino de graduação. Finalmente, acredita-se que outros possam encontrar esse método de recristalização para obter cristais únicos benéficos à sua pesquisa.
Introdução
O objetivo do método apresentado é preparar análogos de pequenas moléculas de LADH para entender melhor a atividade catalítica das metaloenzimas. LADH é uma enzima dimérica que contém um domínio de ligação cofator e zinco(II) domínio catalítico contendo metal1. LADH, na presença do co-fator NADH, pode reduzir cetonas e aldeídos aos seus respectivos derivados de álcool2. Na presença de NAD+, LADH pode realizar catálise reversa de oxidação de álcoois a cetonas e aldeídos2. A estrutura cristalina do local ativo da LADH mostra que seu centro metálico de zinco (II) está ligado a um átomo de nitrogênio, fornecido por uma cadeia lateral de histidina e dois átomos de enxofre e oferecido por dois ligantes de cisteína3. Outras pesquisas mostraram que o centro metálico de zinco é ligado com uma molécula de água labile, resultando em geometria pseudo-tetraédrico ao redor do centro metálico4.
Já reportamos e utilizamos precursores de ligante sns, bem como metalizamos os precursores do ligante com ZnCl2 para formar complexos Zn(II) que contêm o precursor do ligante tridentato5,,6,7. Estes precursores de ligante são mostrados na Figura 1. Estes complexos de zinco (II) apresentaram atividade para a redução estequiométrica de aldeídos pobres em elétrons e, portanto, são complexos de modelo para LADH. Posteriormente, a síntese e caracterização de uma série de complexos de cobre(I) e cobre(II) que contêm precursores de ligantes SNS foram relatadas8,,9,10.
Embora ladh seja uma enzima de zinco (II), estamos interessados em preparar complexos de modelo de cobalto (II) de LADH, a fim de obter mais informações espectroscópicas sobre os análogos de cobalto (II) de LADH. Os complexos de cobalto (II) são coloridos, enquanto os complexos de zinco (II) são off-white. Uma vez que os complexos de cobalto (II) são coloridos, espectros visíveis ultravioletas dos complexos podem ser obtidos, nos quais também podem ser coletadas informações sobre a força do campo de ligante nos complexos de cobalto(II). Usando informações de cálculos gaussianos e dos espectros visíveis ultravioleta obtidos experimentalmente, informações sobre a força do campo de ligante podem ser deduzidas. O cobalto(II) é um bom substituto para o zinco(II), uma vez que ambos os íons têm raios iônicos semelhantes e acidez semelhante de Lewis11,12.
O método apresentado envolve sintetizar e caracterizar complexos de modelos para tentar imitar o comportamento catalítico natural de LADH5,6. Já metalizamos uma família de precursores de ligantes com ZnCl2 para formar complexos modelo de zinco (II) de LADH, que modelou a estrutura e a reatividade do local ativo de zinco em LADH4. Através de múltiplos experimentos, esses ligantes de pinça provaram ser robustos em diferentes condições ambientais e permaneceram estáveis com uma coleção diversificada de grupos R ligados. 5,,6
Os ligantes tridentatos são preferíveis em comparação com os ligantes monodentatos, porque eles têm sido mais bem sucedidos com metalização devido aos fortes efeitos chelates de ligantes tridentatos. Esta observação deve-se a uma entropia mais favorecida da formação de ligante sinuoso em comparação com um ligante monodentado13. Além disso, os ligantes de pinça tridentato susceptíveis de evitar a dimerização dos complexos metálicos, o que é favorecido porque a dimerização provavelmente retardará a atividade catalítica de um complexo14. Assim, o uso de ligantes de pinça tridentato tem se mostrado bem sucedido na química organometálica na preparação de complexos catalíticos ativos e robustos. Os complexos de pinças SNS têm sido menos estudados do que outros sistemas de pinça, uma vez que os complexos de pinça geralmente contêm metais de transição de segunda e terceirafileira15.
Esta pesquisa sobre metaloenzymes pode ajudar a aprofundar a compreensão de sua atividade enzimática, que pode ser aplicada a outras áreas da biologia. Este método de sintetizar complexos de modelos em comparação com o método alternativo (sintetizando toda a proteína de LADH) é favorável por uma série de razões. A primeira vantagem é que os complexos modelo são baixos em massa molecular e ainda são capazes de representar com precisão a atividade catalítica e as condições ambientais do local ativo da enzima natural. Em segundo lugar, os complexos de modelos são mais simples de trabalhar e produzir dados confiáveis e relacionáveis.
Este manuscrito descreve a preparação sintética e caracterização de dois complexos de pinça de cobalto (II) de LADH. Ambos os complexos apresentam um ligante pinça que contém átomos de enxofre, nitrogênio e doador de enxofre. O primeiro complexo (4) é baseado em um precursor imidazol, e o segundo (5) é baseado em um precursor triazol. Os complexos mostram reatividade para a redução da estequiometria de aldeídos pobres de elétrons na presença de um doador de hidrogênio. Esses resultados de reatividade serão relatados em um manuscrito subseqüente.
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Protocolo
1. Síntese de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-metilleneimidazol-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [4]
- Para preparar o complexo 4, adicione 0,121 g (3,12 x 10-4 mol) de 2,6-bis (N-isopropyl-N'-metileneimidazol-2-thione)piridina (C19H25N5S2)6 a 15 mL de acetonitrile em um frasco de fundo redondo de 100 mL. Em seguida, a esta solução, adicione 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) de cloreto de cobalto hexahidrato (CoCl2·6H2O). A solução de reação deve mudar de cor de amarelo claro para verde esmeralda imediatamente após a adição do hexahidrato de cloreto de cobalto (II).
- Adicione uma barra de agitação ao frasco. Refluxo e mexa a reação por 20 h para garantir a reação completa. Remova o solvente usando um rotovap sob pressão reduzida.
2. Recristalização de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazol-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [4] por difusão lenta de vapor
- Dissolva o soluto em acetonitrilo (7,5 mL), filtre a solução e coloque a solução uniformemente em frascos de 1 dram. Encha cada frasco com 1,5 mL de solução acetonitrila.
- Adicione algodão para tampar os frascos, o que permite a difusão lenta de vapor. Coloque o algodão na abertura na parte superior do frasco.
- Coloque os frascos em um frasco de 240 mL contendo 50 mL de éter dietil. Feche o frasco com um boné.
- Permita que os cristais cresçam durante um período de 1 semana.
NOTA: A recristalização pode levar mais de 1 dia.
3. Síntese de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-metilenetriazole-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [5]
- Para preparar o complexo 5, adicione 0,183 g (4,70 x 10-4 mol) de 2,6-bis (N-isopropyl-N'-metilenetriazole-2-thione)piridina (C17H23N7S2)6 a 15 mL de acetonitrile em um frasco de fundo redondo de 100 mL. A esta solução, adicione 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) de hexahidrato de cloreto de cobalto (CoCl2·6H2O). A solução de reação deve mudar de cor de amarelo claro para azul real imediatamente após a adição do hexahidrato de cloreto de cobalto (II).
- Adicione uma barra de agitação ao frasco. Refluxo e mexa a reação por 20 h para garantir a reação completa. Remova o solvente usando um rotovap pressão reduzida.
4. Recristalização de cloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-metilenetriazole-2-thione)piridina]cobalto(II)tetraclorocobaltato [5] por difusão lenta de vapor
- Dissolva o soluto em acetonitrilo (9,0 mL), filtre a solução e coloque a solução uniformemente em frascos de 1 dram. Encha cada frasco com 1,5 mL de solução acetonitrila.
- Adicione algodão para tampar os frascos, o que permite a difusão lenta de vapor. Coloque o algodão na abertura na parte superior do frasco.
- Coloque os frascos em um frasco contendo 50 mL de éter dietil. Feche o frasco com um boné.
- Permita que os cristais cresçam durante um período de 1 semana.
NOTA: A recristalização pode levar mais de 1 dia.
5. Cristalografia de raios-X
- Monte um cristal de 4 em um laço de nylon. Colete os dados em um difrômetro de difração de Rigaku Oxford. Aqui, os dados de difração de raios-X são coletados a 173(2) K. Resolva a estrutura de cristal usando programas de solução de estrutura Olex216 e ShelXT17 usando métodos diretos. Refinar a estrutura com o pacote de refinamento ShelXL18 usando minimização de quadrados mínimos.
- Monte um cristal de 5 em um laço de nylon. Coletar os dados de difração de raios-X em um difusômetro de difração de Rigaku Oxford. Aqui, os dados de difração de raios-X são coletados a 173(2) K. Resolva a estrutura de cristal usando programas de solução de estrutura Olex216 e ShelXT17 usando métodos diretos. Refinar a estrutura com o pacote de refinamento ShelXL18 usando minimização de quadrados mínimos.
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Resultados
Síntese
As sinestes dos complexos 4 e 5 foram realizadas com sucesso reagindo a uma solução de acetonitrilo contendo um precursor de ligante bis-thione com hexahidrato de cloreto de cobalto(II) (Figura 2). Esta reação ocorreu a uma temperatura de refluxo na presença de ar. Em geral, os complexos 4 e 5 foram observados como solúveis em acetonitrila, sulfóxido de dimetila, diclorometano e metanol. Complexo ...
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Discussão
A preparação dos complexos 4 e 5 é fácil. O passo chave é adicionar o sólido CoCl2·6H2O a uma solução acetonitrila que contém o respectivo precursor do ligante. A solução fica verde escuro em segundos após a adição de CoCl2·6H2O para formar o complexo 4. A solução fica azul brilhante após a adição de CoCl2·6H2O para formar o complexo 5. Para garantir uma reação completa, a solução é coloca...
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
John Miecznikowski recebeu apoio financeiro do seguinte para este projeto: a Connecticut NASA Space Grant Alliance (Número de Prêmio P-1168), o Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield University Faculty Summer Research Stipend, e National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1827854) para fundos para adquirir um espectrômetro de RMN de 400 MHz. Ele também agradece a Terence Wu (Universidade de Yale) pela ajuda na aquisição de espectros de massa de eletrospray. Jerry Jasinski reconhece o Programa de Instrumentação de Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência (Grant Number CHE-1039027) para obter fundos para a compra de um difrômetro de raios-X. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch e Samantha Zygmont reconhecem o Hardiman Scholars Program por fornecer seu subsídio de pesquisa de verão.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frasco de fundo redondo de 100 mL | Chem Glass | CG150691 | 100mL Frasco de fundo redondo de gargalo único, 19/22 Junta externa |
| Acetonitrila | Fisher | HB9823-4 | Resfriador de grau HPLC |
| para roto-vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Cloreto de cobalto hexahidratado | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Éter | dietílicoFisher | E-138-1 | Diethyl Ether Anhydorus |
| cilindro graduado | Fisher | S63456 | 25 mL de placa de aquecimento de cilindro graduado |
| Fisher | 11-100-49SH | Isotemp Basic Agitando | |
| Frascos | Fisher | 05-719-481 | Frascos de 250 mL |
| Ligante | ----- | ----- | Sintetizado anteriormente pelo professor Miecznikowski |
| meio bolas de algodão | Fisher | 22-456-80 | bolas de algodão médio |
| frascos de uma dram | Fisher | 03-339 | frascos de uma dram com pipeta de tampa forrada TFE |
| Fisher | 13-678-20B | 5,75 polegadas | |
| Fisher | 03-448-21 | Lâmpada de látex da marca Fisher para | |
| prato de recristalização | Fisher | 08-741 D | 325 mL prato de recristalização para condensador de refluxo de banho de areia |
| Condensador de vidro químico | CG-1218-A-22 | com junta interna 19/22 | |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Evaporador Rotativo Heidolph Collegiate com banho ecológico Heidolph WB Evaporador Rotativo Heidolph |
| do mar para banho de areia | Acros Organics | 612355000 | areia do mar lavada para banho de areia |
| Barra de agitação | Fisher | 07-910-23 | Barra de agitação magnética em forma de ovo |
| Graxa a vácuo | Fisher | 14-635-5D | graxa de alto vácuo Dow Corning |
| para rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Controle de Válvula Heidolph Rotovac |
Referências
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Reimpressões e permissões
