Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.
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Artigo de método
Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
A meiose é o processo celular-chave necessário para criar gametes haploides para reprodução sexual. Os organismos modelo têm sido fundamentais para entender os eventos cromossomos que ocorrem durante a profase do meioético, incluindo a combinação, a sinapse e eventos de recombinação que garantem a segregação adequada do cromossomo. Embora o mouse tenha sido um modelo importante para entender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos, nem todos os eventos meioticéticos neste sistema são análogos à meiose humana. Recentemente demonstramos o potencial excitante do zebrafish como um modelo de espermatogênese humana. Aqui descrevemos, em detalhes, nossos métodos para visualizar cromossomos meioóticos e proteínas associadas em preparações de propagação de cromossomos. Esses preparativos têm a vantagem de permitir a análise de alta resolução das estruturas cromossais. Primeiro, descrevemos o procedimento de dissecação de testículos de zebrafish adultos, seguido de dissociação celular, lise e disseminação dos cromossomos. Em seguida, descrevemos o procedimento para detectar a localização de proteínas cromossomos mestióticas, por detecção de imunofluorescência, e sequências de ácido nucleico, por fluorescência na hibridização situ (FISH). Essas técnicas compreendem um conjunto útil de ferramentas para a análise citológica da arquitetura de cromatina meiotic no sistema de zebrafish. Pesquisadores da comunidade de zebrafish devem ser capazes de dominar rapidamente essas técnicas e incorporá-las em suas análises padrão da função reprodutiva.
Introdução
A reprodução sexual prossegue através da combinação de dois gametes haploides, cada um carregando metade do complemento cromossomo de uma célula somática. Meiosis é uma divisão de células especializadas que produz gametas haploides através de uma rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação de cromossomos. Na profase I, os cromossomos homônimos (homologs) devem passar por pareamento, recombinação e sinapse, sendo este último caracterizado pela formação do complexo sinaponômico que compreende dois eixos homolog a ponteados pelo filaverso transversal, Sycp1(Figura 1A,B). A não execução desses processos pode levar à produção de gam....
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Protocolo
Todos os métodos envolvendo zebrafish foram realizados utilizando padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis.
1. Procedimento de propagação de cromossomo
NOTA: O protocolo a seguir foi projetado para criar slides 4-6, com centenas de núcleos meioéticos espalhados por slide. O número de testículos utilizados dependerá do tamanho do peixe. Espera-se utilizar 20 animais em ~60 dias após a fertilização (DPF) e 15 animais em ~6 meses após a fertilização (mpf). Para grandes zebrafish (por exemplo, 12 mpf) 10 animais devem ser suficientes. Saiba que os testículos de alguns ....
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Resultados
Traçamos um método para preparar a disseminação de espermatocitos de zebrafish. Quando realizado corretamente, nosso procedimento rende núcleos bem espalhados, não sobrepostos. Para recuperar tais núcleos, é importante ter a quantidade adequada de material inicial (ou seja, testículos), tratar testículos por tempo suficiente na trippsina e um número adequado de tratamentos de DNase I. Esses spreads podem então ser manchados para telômeros e proteínas mestióticas para estudar a progressão .......
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Discussão
Aqui descrevemos métodos para sondar a localização de telômeros e proteínas associadas ao cromossomo na superfície nuclear se espalha de espermatocitoses isolados de testículos de zebrafish. Esperamos que esses métodos sejam aplicáveis para análise de espermatocitocitos em outras espécies teleast com ajuste ao tamanho dos testículos.
Embora apenas alguns anticorpos tenham sido elevados para proteínas meioticas de zebrafish, tivemos sucesso usando os seguintes anticorpos levantados para proteín.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Trent Newman e Masuda Sharifi por comentários sobre o manuscrito e An Nguyen por ajudarem a otimizar métodos para espalhar e manchar cromossomos de meiocitos de zebrafish. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM079115 concedido à S.M.B.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga de 1,5 mL Várias | marcas comerciais disponíveis | ||
| Suporte para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Várias marcas comerciais disponíveis | ||
| 16% de formaldeído, sem metanol | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Várias marcas comerciais disponíveis | ||
| 24 x 50 mm lamínulas de vidro | Corning | 2980-245 | |
| de | |||
| centrífuga cónicos de 50 mL | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Várias | marcas comerciais disponíveis | Utilizado para fazer lamínulas de plástico. | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare uma solução estoque de 100 mg / ml em água destilada estéril. |
| Filtro de Células, 100 µ m | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M cabra anti-frango IgY (H+L), | Biotium | 203775-500uL | Uso a 1:1000 |
| Frango anti-zfSycp1 | Gerado pelo laboratório Burgess | N/A | Uso a 1:100 |
| Colagenase de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Frasco Coplin | Vários marcas comerciais disponíveis | ||
| DNase I, grau II do pâncreas bovino | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps Fine | Science Tools | 11252-30 | São necessários dois para dissecar os testículos. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamida | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Anticorpo secundário anti-frango IgY (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use a 1:1000 |
| Anticorpo secundário IgY (H+L) anticorpo secundário IgY anti-frango de cabra, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use a 1:1000 |
| Cabra anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Não funciona em nossas mãos |
| Cabra anti-coelho IgG (H+L) anticorpo secundário de adsorção cruzada, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use a 1:1000 |
| Cabra anti-coelho IgG (H+L) anticorpo secundário de admissão cruzada, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use a 1:1000 |
| Soro | de cabraSigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Sal de heparina sódica | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Câmara de umidade | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Forno de hibridização | VWR International | 230401V (Modelo 5420) | |
| Incubadora Agitador | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Usado para a câmara |
| de umidade KH2PO4 | Microscópio Fisher Scientific | P285-500 | |
| Várias marcas comerciais disponíveis | Qualquer microscópio padrão capaz de pelo menos ~1.65X de ampliação é suficiente. | ||
| Lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Não funciona em nossas mãos |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Não funciona em nossas mãos |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Não funciona em nossas mãos |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solução | Microscopia Eletrônica Sciences | 74257 | |
| Pipetas de transferência de plástico | Várias marcas comerciais disponíveis | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare conforme o fabricante' s instruções. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare de acordo com as instruções do fabricante. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant com DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use a 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use a 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use em 1:300 |
| Citrato de Sódio | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Tesoura, ângulo de 30°, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Também pode usar qualquer tesoura pequena. |
| Kit Sylgard | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare de acordo com as instruções do fabricante. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilua em água destilada estéril para fazer uma solução de trabalho a 20%. Armazene em temperatura ambiente. O Triton X-100 forma um precipitado quando diluído em água; O precipitado se dissolve durante a noite. |
| Tripsina | Worthington | Bioquímica LS003708 | |
| Inibidor de tripsina da clara de ovo de galinha | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Diluir em água destilada estéril para fazer uma solução de trabalho a 20%. Armazene em temperatura ambiente. |
| Tesoura de Mola Vannas - 4 mm (micro tesoura) | Ferramentas de Ciência Fina | 15018-10 |
Referências
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs dur....
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Reimpressões e permissões
