Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

Infecção micobacteriana tem sido demonstrado para causar morte de células imunes hospedeiras¹. Por exemplo, uma cepa atenuada irá desencadear apoptose em macrófagos e conter a infecção. No entanto, uma cepa virulenta irá desencadear a morte de células líticas, causando disseminação bacteriana^1,2. Considerando o impacto que esses diferentes tipos de morte celular têm na resposta anti-micobacteriana do hospedeiro, é necessária uma observação detalhada da morte de células de macrófago durante a infecção micobacteriana in vivo.

Os métodos convencionais para medir a morte celular são usar manchas de células mortas, como Annnexin V, TUNEL, ou acridina laranja / propidium iodeto manchando^3,4,5. No entanto, esses métodos são incapazes de lançar luz sobre o processo dinâmico de morte celular in vivo. A observação da morte celular in vitro já foi facilitada por imagens vivas^6. No entanto, se os resultados imitam com precisão as condições fisiológicas ainda não está claro.

Zebrafish tem sido um excelente modelo para estudar host respostas anti-mycobacterium. Tem um sistema imunológico altamente conservado semelhante ao dos seres humanos, um genoma facilmente manipulado, e os embriões iniciais são transparentes, o que permite imagens vivas^7,8,9. Após a infecção por M. marinum, zebrafish adulto formam estruturas típicas de granuloma maduro, e zebrafish embrionário formam granuloma precoce como estruturas^9,10. O processo dinâmico de interação célula-bactéria imune inata tem sido explorado anteriormente no modelo de infecção por marinum m. marinum ^11,12. No entanto, devido à alta exigência de resolução espacial-temporal, os detalhes em torno da morte das células imunes inatas permanecem em grande parte indefinidos.

Aqui descrevemos como visualizar o processo de morte celular lítica de macrófago desencadeada pela infecção micobacteriana in vivo. Este protocolo também pode ser aplicado à visualização do comportamento celular in vivo durante o desenvolvimento e inflamação.

Zebrafish foram levantados condições padrão em conformidade com as diretrizes de laboratório animal para revisão ética do bem-estar animal (GB /T 35823-2018). Todos os experimentos com zebrafish neste estudo foram aprovados (2019-A016-01) e realizados no Centro Clínico de Saúde Pública de Xangai, Universidade de Fudan.

1. M. Marinum Single Cell Inoculum Preparação (Figura 1)

1. Descongele o estoque de glicerol M. marinum fluorescente de -80 °C e inocule uma placa de ágar 7H10 com 10% (v/v) OADC, 0,25% glicerol e 50 μg/mL de higromicina. Incubar a placa a 32 °C por cerca de 10 dias.
2. Selecione uma colônia expressando fluorescência positiva e inocula3 mL de 7H9 médio com 10% OADC, 0,5% glicerol e 50 μg/mL hygromicina.
   1. Incubar a inoculação a 32 °C e 100 revoluções por minuto (rpm) por 4-6 dias até que a cultura atinja a fase logarítica (OD₆₀₀ = 0,6-1,0).
   2. Subcultura (1:100) em 30 mL de médio fresco de 7H9 com 10% OADC, 0,5% glicerol, 0,05% Tween-80 e 50 μg/mL até que o OD₆₀₀ atinja ~1,0.
      NOTA: Para a mais alta qualidade cultural, um passo de subcultura é recomendado neste momento. Em nossa experiência, adicionar o clone diretamente a um grande volume de meio levará à formação de aglomerados bacterianos.
3. Coletar células M. marinum como descrito abaixo.
   1. Centrífuga a 3.000 x g por 10 min para recolher o M. marinum como uma pelota. Descarte todos, mas 300 μL do supernatant e usá-lo para resuspender a pelota.
   2. Adicione 3 mL de 7H9 médio com 10% glicerol para resuspender ainda mais a pelota, em seguida, sonicate a suspensão em um banho de água em 100 W em 15 s ON, 15 s OFF para um total de 2 min.
      NOTA: O objetivo da sonorização é alcançar uma única célula homogeneada para o inóculo, o que evitará o bloqueio da agulha de microinjeção.
4. Transfira a suspensão bacteriana para uma seringa de 10 mL, em seguida, passar por um filtro de 5 μm para remover quaisquer grupos bacterianos.
5. Medir a densidade óptica (OD) da suspensão usando um espectrômetro e diluí-lo para OD₆₀₀ = 1.0 com 7H9 mídia contendo 10% glicerol. Divida a suspensão em alíquotas de 10 μL e guarde a -80 °C congelador para uso futuro.
6. Confirme a concentração bacteriana do inoculum (cfu/mL) por diluição em série e revestimento do estoque bacteriano em uma placa de ágar 7H10 contendo 10% (v/v) de OADC, 0,5% de glicerol e 50 μg/mL de hygromicina.

2. Preparação do embrião do zebrafish

1. Um dia antes da desova, montou casais de reprodução de zebrafish na câmara de reprodução.
   NOTA: Adicione apenas um par para cada câmara de reprodução.
2. Coletar embriões na manhã seguinte dentro de 1 h pós-fertilização (hpf). Lave cuidadosamente os embriões com água destilada e transfira até 100 embriões para uma placa de Petri de 100 mm contendo 30 mL de médio E3. Incubar a 28,5 °C.
3. Após as 12h, observe um microscópio e descarte ovos não fertilizados ou danificados.
4. Aos 24 hpf, mude o meio-e3 médio fresco com N-feniltiotia (PTU, 0,2 nM concentração final) para evitar o desenvolvimento de pigmento. Incubar os embriões a 28,5 °C até que os embriões estejam prontos para microinjeção.

3. Infecção via microinjeção bacteriana

1. Prepare agulhas de injeção microcapilar de vidro borosilicato, como descrito anteriormente na referência^13.
2. Zebrafish embriões de montagem para a infecção
   1. Microondas 100 mL de 1% (w/v) e 100 mL de 0,5% (w/v) baixa agarose de fusão em um meio de E3 autolavado até que a agarose é completamente derretido. Divida em tubos de alíquota de 1 mL e guarde a 4 °C para uso futuro.
   2. Antes de usar, aqueça a agarose em um bloco de aquecimento de 95 °C até que esteja completamente derretido. Manter a agarose em forma líquida, colocando-o em um bloco de aquecimento de 45 °C (Figura 2).
   3. Montagem de infecção intramuscular na região do tronco
      1. Crie a camada de agarose inferior derramando 0,5 mL de 1% (w/v) agarose uniformemente em um slide de vidro. Coloque em uma caixa de gelo ou superfície fria por 3 min para solidificar.
      2. Anestesie os embriões de zebrafish (48-72 hpf) em água de ovo com tricaina (200 μg/mL) e PTU por 5 minutos antes da montagem. Coloque até 60 embriões de zebrafish na camada de agarose inferior e coloque-os cuidadosamente em duas linhas (Figura 2B).
      3. Retire qualquer água restante na camada de agarose inferior com papel de seda antes de adicionar 0,3 mL de 0,5% (w/v) agarose para criar a camada superior. Certifique-se de que os embriões estão completamente embutidos na agarose. Devolva o slide de vidro para a caixa de gelo novamente para solidificar a agarose e evitar a desidratação.
      4. Mantenha a camada superior de agarose húmida cobrindo a superfície com água extra do ovo E3.
   4. Montagem para a infecção do midbrain
      1. Cubra o sulco de um único slide de microscopia de vidro concavidade com 1% (w/v) agarose, e depois transfira os embriões tricainos-anestesiados 4-6 para a agarose.
      2. Posicione a cabeça de cada embrião para cima cuidadosamente com uma agulha de 10 G(Figura 2C).
      3. Uma vez que as posições de todos os embriões são fixas, transfira o slide de vidro para uma caixa de gelo ou superfície fria para deixar a agarose solidificar.
         NOTA: Evite a diluição da agarose de baixo derretimento minimizando o volume de transferência de água do ovo com os embriões.
3. Preparação de bactérias para a infecção
   1. Adicione 1 μL de vermelho fenol filtrado estéril (10x) a um alíquota de 10 μL de estoque bacteriano (feito no passo 1) e misture vórtice brevemente.
      NOTA: A concentração final pode ser ajustada usando PBS estéril.
   2. Sonicate a preparação usando 100 W em 10 s ON, 10 s OFF para 1 min para quebrar todos os grupos que podem ter formado¹⁴.
4. Infecção via microinjeção
   1. Ajuste o microinjetor e o micromanipulator à posição e ao ajuste apropriados para a microinjeção como relatado previamente^13.
   2. Transfira 3 μL da preparação bacteriana usando um micro carregador na agulha preparada (veja a etapa 3.1). Pipeta lenta e cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar.
   3. Para a infecção da região do tronco, injetar 100 cfu na região do tronco(Figura 3A). Evite injetar bactérias no notochord.
      NOTA: O cfu para injeção é estimado pela fórmula cfu = concentração de estoque bacteriano x fator de diluição x volume de gotículas de injeção. O cfu real é confirmado por revestimento de uma gota de inóculo bacteriano em uma placa de ágar 7H10 contendo 10% (v/ v) de OADC, 0,5% de glicerol, e 50 μg/mL de hygromicina.
   4. Para a infecção no meio do cérebro, injetar cerca de 500 cfu na região do midbrain(Figura 3B).
   5. Após a microinjeção, cuidadosamente lavar os embriões zebrafish em água de ovo fresco com uma pipeta de plástico.
      NOTA: Monte embriões no prato de fundo de vidro o mais rapidamente possível para cobrir a observação da resposta de células imunes inatas muito cedo.

4. Imagem viva da infecção

1. Montagem dos peixes para a imagem latente viva
   1. Transfira até 10 embriões tricainos-anestesiados para o meio de um prato de 35 mm de fundo de vidro. Descarte o meio E3 extra.
   2. Cubra o prato com 1% de baixo ponto de fusão agarose e orientar os embriões zebrafish cuidadosamente usando uma agulha de 10 G. Incubar o prato de fundo de vidro no gelo por 10 s para solidificar a agarose.
      NOTA: Para injeção no meio do cérebro, os embriões devem ser montados na agarose com a cabeça direcionada para cima(Figura 4A). Para a infecção intramuscular da região do tronco, os embriões devem ser montados lateralmente na agarose(Figura 4B).
   3. Uma vez solidificado completamente, cubra a agarose com uma camada de água de ovo (mais 1 x tricaine e PTU).
2. Microscopia confocal de lapso de tempo de alta resolução de três cores
   NOTA: Os seguintes passos são operados em uma microscopia confocal equipada com uma lente objetiva UV de óleo 63.0x 1.40.
   1. Defina a temperatura da câmara ambiental para 28,5 °C. Coloque um pouco de papel de seda molhado dentro da câmara para fornecer umidade e evitar a evaporação da água do ovo(Figura Suplementar 1).
   2. Coloque o prato de 35 mm de fundo de vidro com o peixe-zebra na câmara ambiental.
   3. Abra o software confocal e inicialmente inicialmente o palco. Mude para o objetivo UV de óleo 63,0 x 1,40 e localize o peixe-zebra usando o canal de campo brilhante com um filtro de contraste de interferência diferencial (DIC).
   4. Abra o 405 Diode, Argon (20% de potência) e DPSS 561 nm laser. Configure as configurações apropriadas de potência e espectro a laser.
      NOTA: A seguir estão as configurações de espectro para Cerulean (excitação = 405 nm; emissão = ~456-499 nm), eGFP (excitação = 488 nm; emissão = ~500-550 nm), DsRed2 (excitação = 561 nm; emissão = ~575-645 nm) (Figura Suplementar 2B).
   5. Escolha o modo de aquisição "XYZ" "Sequential Scan" e defina formato de imagens para "512 x 512 pixels" (Figura Suplementar 2A).
   6. Mude para "Modo de Dados ao Vivo". Alvo a posição do primeiro zebrafish e marcar o "Begin" e "End" Z posição. Repita este processo para cada um dos embriões restantes. A "Pausa" pode ser adicionado no final do programa(Figura Suplementar 2C).
   7. Defina o loop e o ciclo do programa.
   8. Guarde o arquivo.

5. Irradiação UV de célula única para induzir apoptose e imagens vivas

1. Peixeda da montagem como descrito na etapa 4.1.
2. Imagem na região do cérebro médio de 3 dias após a fertilização (dpf) macrófago específico Transgênico Tg (mfap4-eGFP) embrião¹⁵
3. Selecione a região de interesse de um único macrófago e varredura fluorescente rotulados a 400 Hz de velocidade e 6% de potência laser UV para 50 s.
   NOTA: A velocidade e o tempo da exploração devem ser aperfeiçoados baseado no microscópio individual. O tempo de digitalização deve ser otimizado para causar o extenso dano ao DNA que posteriormente causará apoptose celular alvo, mas não fotobrander toda a célula.
4. Repita o degrau acima para irradiar mais células-alvo.
5. Realize imagens de lapso de tempo da região do midbrain, conforme descrito na seção 4.

6. Processamento de imagem

1. Perform"Maximum Projection"para as imagens adquiridas.
2. Encontre e marque a posição e o tempo xy das células-alvo a visão deProjeção Máxima.
3. Volte para a visão padrão para encontrar e marcar a posição Z das células-alvo.
4. Lave a imagem de camada única das células-alvo.
5. Exportar o canal de sobreposição e campo brilhante como vídeos em formato AVI.
6. Crop a área de interesse do canal de sobreposição e campo brilhante em ImageJ.
7. Combine os dois vídeos na última etapa verticalmente e salve como um vídeo de formato AVI no ImageJ.

A infecção por micobactéria pode desencadear diferentes respostas do hospedeiro com base nas rotas da infecção. Neste protocolo, os embriões de zebrafish são infectados por microinjeção intramuscular de bactérias fluorescentemente rotuladas no meio do cérebro ou tronco (Figura 3)e observadas por imagens confocais ao vivo. Infecção através destas duas rotas irá restringir localmente a infecção causando recrutamento de células imunes inatas e subsequente morte celular.

Visualizar os detalhes da morte inata de células imunes é um desafio. A morte das células líticas ocorre em uma janela de tempo muito curta e requer microscopia de alta resolução para observar. Além disso, a alta motilidade das células imunes inatas permite-lhes migrar para fora da área de observação. Neste protocolo, resolvemos esse problema observando múltiplos embriões em paralelo. Uma matriz de embriões do zebrafish pode ser montada em uma única corrediça do microscópio de vidro para a infecção, e até 10 embriões podem ser montados no mesmo prato inferior de vidro de 35 milímetros para a imagem latente viva (figura 4). Aproveitando um modelo de dados ao vivo de microscopia confocal, mais de um embrião pode ser observado simultaneamente. Isso aumenta a eficiência da imagem ao vivo e aumenta consideravelmente a probabilidade de capturar todo o processo de morte de células líticas.

O sistema imunológico inato é a primeira linha de defesa contra a infecção micobacteriana, e dois componentes-chave são o macrófago e o neutrófilo. Aqui utilizamos Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) e Tg (mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) para distinguir os macrófagos e os neutrófilos em vivo16,17,18. Um macrófago fortemente ingurgitado com bactérias tornou-se redondo e exibiu motilidade reduzida, com eventual inchaço citoplasmamico, ruptura da membrana celular e disseminação rápida do conteúdo citoplasmico. Estes eventos são típicas alterações morfológicas da morte de células líticas como relatado anteriormente (Figura 5A)16. A irradiação UV tem sido usada para acionar células para se submeter a apoptose em zebrafish20,21. Consistente com essa noção, os macrófagos irradiados uv mostraram fenótipos típicos de células apoptóticas, como encolhimento celular, fragmentação nuclear e condensação de cromatina (Figura 5B)22,23. Combinado com o uso de Cerulean-fluorescente M. marinum19, três cores live imaging da interação entre macrófago, neutrófilo e M. marinum foi alcançado in vivo. Também observamos que os macrófagos podem ativamente phagocitose e disseminar M. marinum (Figura Suplementar 3A). No entanto, os neutrófilos tinham capacidade fagocítica limitada e rapidamente foram submetidos à morte de células líticas sem o engorgement bacteriano óbvio(Figura Suplementar 3B). Neutrófilos poderiam ser desencadeados pela fagocitose de apenas alguns mortos M. marinum que não expressam fluorescência ceúlea, ou simplesmente por fagocitose de detritos celulares mortos limitados.

Figura 1: Diagrama esquemático da preparação de bactérias unicelulares. Os estoques de M. marinum cerulean-fluorescente de célula única foram gerados após o processo descrito. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Diagrama de montagem de embriões de zebrafish para microinjeção. (A)Diagrama esquemático do processo de montagem. (B)Os embriões do zebrafish foram montados lateralmente para a infecção da região do tronco. (C)Os embriões do zebrafish foram montados com suas cabeças dirigidas para cima para a infecção do midbrain. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Posicionamento para microinjeção. (A)A seta vermelha indica o local da injeção para a infecção da região do tronco. (B)A seta vermelha indica o local da injeção para a infecção no meio do cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Montagem de embriões zebrafish para imagens ao vivo. (A)Para a infecção do midbrain, os embriões do zebrafish foram montados com suas cabeças dirigidas para baixo. (B)Para a infecção da região do tronco, os embriões do zebrafish foram montados lateralmente com o local da injeção perto da parte inferior do prato inferior de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Alterações morfológicas típicas na infecção por M. marinum induziram a morte de células líticas de macrófago e apoptose de macrófago induzida por UV. (A)Imagens de lapso de tempo de um macrófago (Mac) submetidos a morte de células líticas, uma vez que é fortemente ingurgitada com M. marinum. O midbrain do 3 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) zebrafish embrião é infectado por Cerulean-fluorescente M. marinum (~ 500 cfu) via microinjeção. As imagens para o canal de sobreposição (painel superior) e o canal DIC (painel inferior) são fornecidas. T 00:00 é 5 h 20 min pós infecção. Linhas tracejadas brancas = contorno da membrana celular; linhas pretas tracejadas = citoplasma inchaço; setas pretas = membrana celular rompida; linhas vermelhas tracejadas = rapidamente perdeu o conteúdo citoplasmico. (B) Imagens de lapso de tempo de macrófago irradiado UV. Uma célula GFP+ na região do cérebro médio de 3 dpf Tg (mfap4:eGFP) é irradiada por UV e seguida de imagens de lapso de tempo. Linhas tracejadas brancas = contorno da membrana celular; setas pretas = fragmentação nuclear e condensação de cromatina. Barra de escala = 15 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura suplementar 1: Câmara ambiental criada para imagens ao vivo. (A)Definir o controlador digital para manter a temperatura em 28,5 °C. (B)Definir lenços umedecidos dentro da câmara para fornecer umidade e evitar a evaporação da água do ovo. (C)Feche a capa da câmara e aguarde pelo menos 30 min para a estabilização da temperatura antes de começar a imagem ao vivo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura suplementar 2: Configuração de painel confocal para imagens ao vivo. (A)Representação da configuração do painel de aquisição. (B) Representação de configurações de energia a laser e espectro. (C)Representação de vários trabalhos e configuração de loop no modo de dados ao vivo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura suplementar 3: Macrófagos disseminam infecção e neutrófilos sofrem morte de células líticas após a infecção por M. marinum. (A) Macrófago disseminando M. marinum no porta-malas de um 2 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) zebrafish embrião infectado por Cerulean-fluorescente M. marinum (~ 100 cfu). (B) Neutrophil (Neu) submetidos a morte de células líticas sem m. marinum óbvio carregado na região do tronco de 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) zebrafish embrião infectado por Cerulean-fluorescente M. marinum (~ 100 cfu) via microinjeção. A cor verde é atribuída ao LRLG e a cor vermelha é atribuída ao eGFP para melhor visualização do processo de morte de células líticas. Flechas em ciano indicam células-alvo. Setas em vermelho apontam para as células que estão prestes a liberar o conteúdo do citoplasma no próximo quadro. Flechas em ponto verde para as células mortas que acabaram de perder seu conteúdo de citoplasma. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Vídeo 1: Um macrófago fortemente carregado com M. marinum sofre morte de células líticas, relacionada à Figura 5A. Imagens de lapso de tempo (objetivo 63x) para 9 min e 18 s em 3 quadros por segundo (fps) da região do midbrain de um 3 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) zebrafish embrião infectado com Cerulean-fluorescente M. marinum. Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Vídeo 2: Um macrófago sofre apoptose após a irradiação UV, relacionada à Figura 5B. Imagens de lapso de tempo (objetivo 63x) de 74 min a 6 fps da região do midbrain de um embrião de zebrafish 3 dpf Tg (mfap4:eGFP). Uma célula GFP+ na região do cérebro médio dos embriões é irradiada por UV e seguida por imagens de lapso de tempo. Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Vídeo 3: Um macrófago divulga M. marinum,relacionado à Figura Suplementar 3A. Imagens de lapso de tempo (objetivo 63x) de 24 min a 3 fps da região do tronco de 2 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) zebrafish embrião infectado com Cerulean-fluorescente M. marinum. Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Vídeo 4: Um neutrófilo sofre morte de células líticas sem o óbvio m. marinum engorgement, relacionado à Figura Suplementar 3B. Imagens de lapso de tempo (63x objetivo) de 7 min 30 s em 3 fps da região do tronco de 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) zebrafish embrião infectado com Cerulean-fluorescente M. marinum. Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Os autores não têm nada a divulgar.