Artigo de método

Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

DOI:

10.3791/60698

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9 de janeiro de 2019

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1Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, 2School of Life Sciences, Bengbu Medical College

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma técnica para visualizar o comportamento do macrófago e a morte no zebrafish embrionário durante a infecção do marinum de Mycobacterium. Etapas para a preparação de bactérias, infecção dos embriões e microscopia intravital estão incluídas. Esta técnica pode ser aplicada à observação do comportamento celular e da morte em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish é um excelente organismo modelo para estudar o comportamento inato das células imunes devido à sua natureza transparente e dependência exclusivamente em seu sistema imunológico inato durante o desenvolvimento precoce. O modelo de infecção por Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)foi bem estabelecido no estudo da resposta imune do hospedeiro contra a infecção micobacteriana. Tem sido sugerido que diferentes tipos de morte de células de macrófago levará aos diversos resultados da infecção micobacteriana. Aqui descrevemos um protocolo usando microscopia intravital para observar a morte celular de macrófagos em embriões de zebrafish após a infecção por M. marinum. Linhas transgênicas de zebrafish que rotulam especificamente macrófagos e neutrófilos estão infectadas por meio de microinjeção intramuscular de M. marinum com rótulo fluorescente no meio do cérebro ou no tronco. Embriões de zebrafish infectados são posteriormente montados em baixa agarose de fusão e observados pela microscopia confocal nas dimensões X-Y-Z-T. Como a imagem ao vivo a longo prazo requer o uso de baixa potência a laser para evitar o fotobranqueamento e a fototoxicidade, um transgênico fortemente expressor é altamente recomendado. Este protocolo facilita a visualização dos processos dinâmicos in vivo, incluindo a migração de células imunes, interação de patógenos hospedeiros e morte celular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infecção micobacteriana tem sido demonstrado para causar morte de células imunes hospedeiras1. Por exemplo, uma cepa atenuada irá desencadear apoptose em macrófagos e conter a infecção. No entanto, uma cepa virulenta irá desencadear a morte de células líticas, causando disseminação bacteriana1,2. Considerando o impacto que esses diferentes tipos de morte celular têm na resposta anti-micobacteriana do hospedeiro, é necessária uma observação detalhada da morte de células de macrófago durante a infecção micobacteriana in vivo.

Os métodos convencionais para medir a morte celular são usar manchas de células mortas, como Annnexin V, TUNEL, ou acridina laranja / propidium iodeto manchando3,4,5. No entanto, esses métodos são incapazes de lançar luz sobre o processo dinâmico de morte celular in vivo. A observação da morte celular in vitro já foi facilitada por imagens vivas6. No entanto, se os resultados imitam com precisão as condições fisiológicas ainda não está claro.

Zebrafish tem sido um excelente modelo para estudar host respostas anti-mycobacterium. Tem um sistema imunológico altamente conservado semelhante ao dos seres humanos, um genoma facilmente manipulado, e os embriões iniciais são transparentes, o que permite imagens vivas7,8,9. Após a infecção por M. marinum, zebrafish adulto formam estruturas típicas de granuloma maduro, e zebrafish embrionário formam granuloma precoce como estruturas9,10. O processo dinâmico de interação célula-bactéria imune inata tem sido explorado anteriormente no modelo de infecção por marinum m. marinum 11,12. No entanto, devido à alta exigência de resolução espacial-temporal, os detalhes em torno da morte das células imunes inatas permanecem em grande parte indefinidos.

Aqui descrevemos como visualizar o processo de morte celular lítica de macrófago desencadeada pela infecção micobacteriana in vivo. Este protocolo também pode ser aplicado à visualização do comportamento celular in vivo durante o desenvolvimento e inflamação.

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Protocolo

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Zebrafish foram levantados condições padrão em conformidade com as diretrizes de laboratório animal para revisão ética do bem-estar animal (GB /T 35823-2018). Todos os experimentos com zebrafish neste estudo foram aprovados (2019-A016-01) e realizados no Centro Clínico de Saúde Pública de Xangai, Universidade de Fudan.

1. M. Marinum Single Cell Inoculum Preparação (Figura 1)

  1. Descongele o estoque de glicerol M. marinum fluorescente de -80 °C e inocule uma placa de ágar 7H10 com 10% (v/v) OADC, 0,25% glicerol e 50 μg/mL de higromicina. Incubar a placa a 32 °C por cerca de 10 dias.
  2. Selecione uma colônia expressando fluorescência positiva e inocula3 mL de 7H9 médio com 10% OADC, 0,5% glicerol e 50 μg/mL hygromicina.
    1. Incubar a inoculação a 32 °C e 100 revoluções por minuto (rpm) por 4-6 dias até que a cultura atinja a fase logarítica (OD600 = 0,6-1,0).
    2. Subcultura (1:100) em 30 mL de médio fresco de 7H9 com 10% OADC, 0,5% glicerol, 0,05% Tween-80 e 50 μg/mL até que o OD600 atinja ~1,0.
      NOTA: Para a mais alta qualidade cultural, um passo de subcultura é recomendado neste momento. Em nossa experiência, adicionar o clone diretamente a um grande volume de meio levará à formação de aglomerados bacterianos.
  3. Coletar células M. marinum como descrito abaixo.
    1. Centrífuga a 3.000 x g por 10 min para recolher o M. marinum como uma pelota. Descarte todos, mas 300 μL do supernatant e usá-lo para resuspender a pelota.
    2. Adicione 3 mL de 7H9 médio com 10% glicerol para resuspender ainda mais a pelota, em seguida, sonicate a suspensão em um banho de água em 100 W em 15 s ON, 15 s OFF para um total de 2 min.
      NOTA: O objetivo da sonorização é alcançar uma única célula homogeneada para o inóculo, o que evitará o bloqueio da agulha de microinjeção.
  4. Transfira a suspensão bacteriana para uma seringa de 10 mL, em seguida, passar por um filtro de 5 μm para remover quaisquer grupos bacterianos.
  5. Medir a densidade óptica (OD) da suspensão usando um espectrômetro e diluí-lo para OD600 = 1.0 com 7H9 mídia contendo 10% glicerol. Divida a suspensão em alíquotas de 10 μL e guarde a -80 °C congelador para uso futuro.
  6. Confirme a concentração bacteriana do inoculum (cfu/mL) por diluição em série e revestimento do estoque bacteriano em uma placa de ágar 7H10 contendo 10% (v/v) de OADC, 0,5% de glicerol e 50 μg/mL de hygromicina.

2. Preparação do embrião do zebrafish

  1. Um dia antes da desova, montou casais de reprodução de zebrafish na câmara de reprodução.
    NOTA: Adicione apenas um par para cada câmara de reprodução.
  2. Coletar embriões na manhã seguinte dentro de 1 h pós-fertilização (hpf). Lave cuidadosamente os embriões com água destilada e transfira até 100 embriões para uma placa de Petri de 100 mm contendo 30 mL de médio E3. Incubar a 28,5 °C.
  3. Após as 12h, observe um microscópio e descarte ovos não fertilizados ou danificados.
  4. Aos 24 hpf, mude o meio-e3 médio fresco com N-feniltiotia (PTU, 0,2 nM concentração final) para evitar o desenvolvimento de pigmento. Incubar os embriões a 28,5 °C até que os embriões estejam prontos para microinjeção.

3. Infecção via microinjeção bacteriana

  1. Prepare agulhas de injeção microcapilar de vidro borosilicato, como descrito anteriormente na referência13.
  2. Zebrafish embriões de montagem para a infecção
    1. Microondas 100 mL de 1% (w/v) e 100 mL de 0,5% (w/v) baixa agarose de fusão em um meio de E3 autolavado até que a agarose é completamente derretido. Divida em tubos de alíquota de 1 mL e guarde a 4 °C para uso futuro.
    2. Antes de usar, aqueça a agarose em um bloco de aquecimento de 95 °C até que esteja completamente derretido. Manter a agarose em forma líquida, colocando-o em um bloco de aquecimento de 45 °C (Figura 2).
    3. Montagem de infecção intramuscular na região do tronco
      1. Crie a camada de agarose inferior derramando 0,5 mL de 1% (w/v) agarose uniformemente em um slide de vidro. Coloque em uma caixa de gelo ou superfície fria por 3 min para solidificar.
      2. Anestesie os embriões de zebrafish (48-72 hpf) em água de ovo com tricaina (200 μg/mL) e PTU por 5 minutos antes da montagem. Coloque até 60 embriões de zebrafish na camada de agarose inferior e coloque-os cuidadosamente em duas linhas (Figura 2B).
      3. Retire qualquer água restante na camada de agarose inferior com papel de seda antes de adicionar 0,3 mL de 0,5% (w/v) agarose para criar a camada superior. Certifique-se de que os embriões estão completamente embutidos na agarose. Devolva o slide de vidro para a caixa de gelo novamente para solidificar a agarose e evitar a desidratação.
      4. Mantenha a camada superior de agarose húmida cobrindo a superfície com água extra do ovo E3.
    4. Montagem para a infecção do midbrain
      1. Cubra o sulco de um único slide de microscopia de vidro concavidade com 1% (w/v) agarose, e depois transfira os embriões tricainos-anestesiados 4-6 para a agarose.
      2. Posicione a cabeça de cada embrião para cima cuidadosamente com uma agulha de 10 G(Figura 2C).
      3. Uma vez que as posições de todos os embriões são fixas, transfira o slide de vidro para uma caixa de gelo ou superfície fria para deixar a agarose solidificar.
        NOTA: Evite a diluição da agarose de baixo derretimento minimizando o volume de transferência de água do ovo com os embriões.
  3. Preparação de bactérias para a infecção
    1. Adicione 1 μL de vermelho fenol filtrado estéril (10x) a um alíquota de 10 μL de estoque bacteriano (feito no passo 1) e misture vórtice brevemente.
      NOTA: A concentração final pode ser ajustada usando PBS estéril.
    2. Sonicate a preparação usando 100 W em 10 s ON, 10 s OFF para 1 min para quebrar todos os grupos que podem ter formado14.
  4. Infecção via microinjeção
    1. Ajuste o microinjetor e o micromanipulator à posição e ao ajuste apropriados para a microinjeção como relatado previamente13.
    2. Transfira 3 μL da preparação bacteriana usando um micro carregador na agulha preparada (veja a etapa 3.1). Pipeta lenta e cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar.
    3. Para a infecção da região do tronco, injetar 100 cfu na região do tronco(Figura 3A). Evite injetar bactérias no notochord.
      NOTA: O cfu para injeção é estimado pela fórmula cfu = concentração de estoque bacteriano x fator de diluição x volume de gotículas de injeção. O cfu real é confirmado por revestimento de uma gota de inóculo bacteriano em uma placa de ágar 7H10 contendo 10% (v/ v) de OADC, 0,5% de glicerol, e 50 μg/mL de hygromicina.
    4. Para a infecção no meio do cérebro, injetar cerca de 500 cfu na região do midbrain(Figura 3B).
    5. Após a microinjeção, cuidadosamente lavar os embriões zebrafish em água de ovo fresco com uma pipeta de plástico.
      NOTA: Monte embriões no prato de fundo de vidro o mais rapidamente possível para cobrir a observação da resposta de células imunes inatas muito cedo.

4. Imagem viva da infecção

  1. Montagem dos peixes para a imagem latente viva
    1. Transfira até 10 embriões tricainos-anestesiados para o meio de um prato de 35 mm de fundo de vidro. Descarte o meio E3 extra.
    2. Cubra o prato com 1% de baixo ponto de fusão agarose e orientar os embriões zebrafish cuidadosamente usando uma agulha de 10 G. Incubar o prato de fundo de vidro no gelo por 10 s para solidificar a agarose.
      NOTA: Para injeção no meio do cérebro, os embriões devem ser montados na agarose com a cabeça direcionada para cima(Figura 4A). Para a infecção intramuscular da região do tronco, os embriões devem ser montados lateralmente na agarose(Figura 4B).
    3. Uma vez solidificado completamente, cubra a agarose com uma camada de água de ovo (mais 1 x tricaine e PTU).
  2. Microscopia confocal de lapso de tempo de alta resolução de três cores
    NOTA: Os seguintes passos são operados em uma microscopia confocal equipada com uma lente objetiva UV de óleo 63.0x 1.40.
    1. Defina a temperatura da câmara ambiental para 28,5 °C. Coloque um pouco de papel de seda molhado dentro da câmara para fornecer umidade e evitar a evaporação da água do ovo(Figura Suplementar 1).
    2. Coloque o prato de 35 mm de fundo de vidro com o peixe-zebra na câmara ambiental.
    3. Abra o software confocal e inicialmente inicialmente o palco. Mude para o objetivo UV de óleo 63,0 x 1,40 e localize o peixe-zebra usando o canal de campo brilhante com um filtro de contraste de interferência diferencial (DIC).
    4. Abra o 405 Diode, Argon (20% de potência) e DPSS 561 nm laser. Configure as configurações apropriadas de potência e espectro a laser.
      NOTA: A seguir estão as configurações de espectro para Cerulean (excitação = 405 nm; emissão = ~456-499 nm), eGFP (excitação = 488 nm; emissão = ~500-550 nm), DsRed2 (excitação = 561 nm; emissão = ~575-645 nm) (Figura Suplementar 2B).
    5. Escolha o modo de aquisição "XYZ" "Sequential Scan" e defina formato de imagens para "512 x 512 pixels" (Figura Suplementar 2A).
    6. Mude para "Modo de Dados ao Vivo". Alvo a posição do primeiro zebrafish e marcar o "Begin" e "End" Z posição. Repita este processo para cada um dos embriões restantes. A "Pausa" pode ser adicionado no final do programa(Figura Suplementar 2C).
    7. Defina o loop e o ciclo do programa.
    8. Guarde o arquivo.

5. Irradiação UV de célula única para induzir apoptose e imagens vivas

  1. Peixeda da montagem como descrito na etapa 4.1.
  2. Imagem na região do cérebro médio de 3 dias após a fertilização (dpf) macrófago específico Transgênico Tg (mfap4-eGFP) embrião15
  3. Selecione a região de interesse de um único macrófago e varredura fluorescente rotulados a 400 Hz de velocidade e 6% de potência laser UV para 50 s.
    NOTA: A velocidade e o tempo da exploração devem ser aperfeiçoados baseado no microscópio individual. O tempo de digitalização deve ser otimizado para causar o extenso dano ao DNA que posteriormente causará apoptose celular alvo, mas não fotobrander toda a célula.
  4. Repita o degrau acima para irradiar mais células-alvo.
  5. Realize imagens de lapso de tempo da região do midbrain, conforme descrito na seção 4.

6. Processamento de imagem

  1. Perform"Maximum Projection"para as imagens adquiridas.
  2. Encontre e marque a posição e o tempo xy das células-alvo a visão deProjeção Máxima.
  3. Volte para a visão padrão para encontrar e marcar a posição Z das células-alvo.
  4. Lave a imagem de camada única das células-alvo.
  5. Exportar o canal de sobreposição e campo brilhante como vídeos em formato AVI.
  6. Crop a área de interesse do canal de sobreposição e campo brilhante em ImageJ.
  7. Combine os dois vídeos na última etapa verticalmente e salve como um vídeo de formato AVI no ImageJ.

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Resultados

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A infecção por micobactéria pode desencadear diferentes respostas do hospedeiro com base nas rotas da infecção. Neste protocolo, os embriões de zebrafish são infectados por microinjeção intramuscular de bactérias fluorescentemente rotuladas no meio do cérebro ou tronco (Figura 3)e observadas por imagens confocais ao vivo. Infecção através destas duas rotas irá restringir localmente a infecção causando recrutamento de células imunes inatas e subsequente morte celular.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve a visualização da morte do macrófago durante a infecção mycobacterial. Com base em fatores como a integridade da membrana celular, a morte celular impulsionada por infecção pode ser dividida em apoptose e morte de células líticas24,25. A morte das células líticas é mais estressante para o organismo do que a apoptose, pois desencadeia uma forte resposta inflamatória 24,25. A observa...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Zilong Wen por compartilhar cepas de zebrafish, Dr. Stefan Oehlers e Dr. David Tobin por compartilhar recursos relacionados a M. marinum, Yuepeng Ele para assistência na preparação de figuras. Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), pelo Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) e Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tween-80SigmaP1379
Seringa de 10 mLSolarbioYA0552
10% OADCBD211886
ácido 3-aminobenzóicoSigmaE10521
5 μ m filtroMille XSLSV025LS
50 μ l/ml higromicinaSangon BiotechA600230
7H10BD262710
7H9BD262310
Um prato com fundo de vidro de 35 mmIn Vitro ScientificD35-10-0-N
AgaroseSangon BiotechA60015
Microscópio ConfocalLeicaTCS SP5 II
Câmara AmbientalControletemperatura Pecon 37-2 microcarregador digital
EppendorfEppendorfNo.5242956003
Lâmina de microscópio de vidroBioland Scientific LLC7105P
GlicerolSangon BiotechA100854
IncubadoraKeelreinPH-140 (A)
< em> M.marinum< / em>ATCC BAA-535
Agulha de microinjeçãoWorld Precision InstrumentsIB100F-4
MicroinjetorEppendorfFemtojet
MicromanipuladorNARISHIGEMN-151
msp12:cerúleoRef.: PMID 25470057; 27760340
Vermelho de fenolSigmaP3532
PTUSigmaP7629
Lâmina de microscópio de vidro de concavidade únicaSail Brand7103
SonicatorSCICNTZJY92-IIDN
Espectrofotômetro (OD600)Eppendorf AG22331 Hamburgo
Microscópio EstéreoOLYMPUSSZX10
Tg(mfap4:eGFP)Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2)Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG; lyz:eGFP)Ref.: PMID 27424497; 17477879
de

Referências

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