Este protocolo descreve uma técnica para visualizar o comportamento do macrófago e a morte no zebrafish embrionário durante a infecção do marinum de Mycobacterium. Etapas para a preparação de bactérias, infecção dos embriões e microscopia intravital estão incluídas. Esta técnica pode ser aplicada à observação do comportamento celular e da morte em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.
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Artigo de método
Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital
Neste artigo
Resumo
Resumo
Zebrafish é um excelente organismo modelo para estudar o comportamento inato das células imunes devido à sua natureza transparente e dependência exclusivamente em seu sistema imunológico inato durante o desenvolvimento precoce. O modelo de infecção por Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)foi bem estabelecido no estudo da resposta imune do hospedeiro contra a infecção micobacteriana. Tem sido sugerido que diferentes tipos de morte de células de macrófago levará aos diversos resultados da infecção micobacteriana. Aqui descrevemos um protocolo usando microscopia intravital para observar a morte celular de macrófagos em embriões de zebrafish após a infecção por M. marinum. Linhas transgênicas de zebrafish que rotulam especificamente macrófagos e neutrófilos estão infectadas por meio de microinjeção intramuscular de M. marinum com rótulo fluorescente no meio do cérebro ou no tronco. Embriões de zebrafish infectados são posteriormente montados em baixa agarose de fusão e observados pela microscopia confocal nas dimensões X-Y-Z-T. Como a imagem ao vivo a longo prazo requer o uso de baixa potência a laser para evitar o fotobranqueamento e a fototoxicidade, um transgênico fortemente expressor é altamente recomendado. Este protocolo facilita a visualização dos processos dinâmicos in vivo, incluindo a migração de células imunes, interação de patógenos hospedeiros e morte celular.
Introdução
Infecção micobacteriana tem sido demonstrado para causar morte de células imunes hospedeiras1. Por exemplo, uma cepa atenuada irá desencadear apoptose em macrófagos e conter a infecção. No entanto, uma cepa virulenta irá desencadear a morte de células líticas, causando disseminação bacteriana1,2. Considerando o impacto que esses diferentes tipos de morte celular têm na resposta anti-micobacteriana do hospedeiro, é necessária uma observação detalhada da morte de células de macrófago durante a infecção micobacteriana in vivo.
Os métodos convencionais para medir....
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Protocolo
Zebrafish foram levantados condições padrão em conformidade com as diretrizes de laboratório animal para revisão ética do bem-estar animal (GB /T 35823-2018). Todos os experimentos com zebrafish neste estudo foram aprovados (2019-A016-01) e realizados no Centro Clínico de Saúde Pública de Xangai, Universidade de Fudan.
1. M. Marinum Single Cell Inoculum Preparação (Figura 1)
- Descongele o estoque de glicerol M. marinum fluorescente de -80 °C e inocule uma placa de ágar 7H10 com 10% (v/v) OADC, 0,25% glicerol e 50 μg/mL de higromicina. Incubar a placa a 32 °C por cerca de 10 dias. ....
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Resultados
A infecção por micobactéria pode desencadear diferentes respostas do hospedeiro com base nas rotas da infecção. Neste protocolo, os embriões de zebrafish são infectados por microinjeção intramuscular de bactérias fluorescentemente rotuladas no meio do cérebro ou tronco (Figura 3)e observadas por imagens confocais ao vivo. Infecção através destas duas rotas irá restringir localmente a infecção causando recrutamento de células imunes inatas e subsequente morte celular.
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Discussão
Este protocolo descreve a visualização da morte do macrófago durante a infecção mycobacterial. Com base em fatores como a integridade da membrana celular, a morte celular impulsionada por infecção pode ser dividida em apoptose e morte de células líticas24,25. A morte das células líticas é mais estressante para o organismo do que a apoptose, pois desencadeia uma forte resposta inflamatória 24,25. A observa.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Zilong Wen por compartilhar cepas de zebrafish, Dr. Stefan Oehlers e Dr. David Tobin por compartilhar recursos relacionados a M. marinum, Yuepeng Ele para assistência na preparação de figuras. Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), pelo Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) e Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| Seringa de 10 mL | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| ácido 3-aminobenzóico | Sigma | E10521 | |
| 5 μ m filtro | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μ l/ml higromicina | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| Um prato com fundo de vidro de 35 mm | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Microscópio Confocal | Leica | TCS SP5 II | |
| Câmara Ambiental | Controle | temperatura Pecon 37-2 microcarregador digital | |
| Eppendorf | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Lâmina de microscópio de vidro | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glicerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubadora | Keelrein | PH-140 (A) | |
| < em> M.marinum< / em> | ATCC BAA-535 | ||
| Agulha de microinjeção | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjetor | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulador | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerúleo | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Vermelho de fenol | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Lâmina de microscópio de vidro de concavidade única | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Espectrofotômetro (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburgo | |
| Microscópio Estéreo | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG; lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
Referências
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathw....
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Reimpressões e permissões
