Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.
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Artigo de método
Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação do perfil global das topologias da cadeia de ubiquidades dentro de um proteome é de interesse para responder a uma ampla gama de perguntas biológicas. O protocolo aqui delineado aproveita a modificação di-glicina (-GG) deixada após a digestão tripptic da ubiquitina incorporada em uma cadeia. Ao quantificar esses peptídeos característicos da topologia, a abundância relativa de cada topologia da cadeia de ubiquitina pode ser determinada. As etapas necessárias para quantificar esses peptídeos por um experimento paralelo de monitoramento de reação são relatadas levando em consideração a estabilização das cadeias de ubiquitina. A preparação de controles pesados, lise celular e digestão são descritas juntamente com a configuração adequada do espectrômetro de massa e o fluxo de trabalho de análise de dados. Um exemplo de dados com perturbações na topologia da ubiquitina é apresentado, acompanhado de exemplos de como a otimização do protocolo pode afetar os resultados. Seguindo as etapas traçadas, o usuário poderá realizar uma avaliação global do cenário de topologia da ubiquitina dentro de seu contexto biológico.
Introdução
A regulação estreita da função proteica e da estabilidade é de suma importância, pois são os principais impulsionadores do controle fenotípico da biologia. A função de uma proteína é construída a partir de dois componentes: sua sequência intrínseca de polipeptídeos e quaisquer modificações pós-transicionais (PTMs). Vários PTMs químicos foram identificados, incluindo glicosilação, fosforilação, acetilação e metilação1. Em 1975, Goldstein et al.2 identificaram uma pequena proteína e a chamaram de ubiquitina devido à sua natureza onipresente. A ubiquitina foi considerada importante na degradação da proteína
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Protocolo
1. Preparação de um padrão de peptídeo pesado
- Dependendo do fornecedor e da qualidade dos peptídeos pesados comprados, os peptídeos pesados precisarão ser diluídos. Este protocolo utilizou as sequências de peptídeos relatadas na Tabela 1, com o aminoácido terminal C modificado para lisina (13C615N2-lysine) ou Arginina (13C615N4-arginina).
- Misture os peptídeos pesados, diluindo a mistura com 50% de acetonitrila (ACN) para criar uma mistura de peptídeos com cada peptídeo a 10 μM.
- Crie alíquotas da mistura de peptídeos e armazene a -80 °C.....
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Resultados
Para demonstrar o uso de uma análise da cadeia de ubiquitina pela PRM, foram selecionadas três linhas celulares: uma linha celular de melanoma de camundongos B16, e as duas linhas celulares humanas comuns A549 (células epitriliais basoeliares adenocarcinômicas) e HeLa (células cancerígenas cervicais). Essas culturas cresceram para a fase média em mídia adequada antes de serem tratadas com 0, 10 ou 100 mM MG-132 por 4h antes da colheita. MG-132 é um inibidor proteasome que previne a degradação de proteínas conjugadas pela.......
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Discussão
A análise do estado de oniquitina dentro de um proteome é de crescente importância para uma ampla variedade de questões biológicas. A descrição do estado de ubiquiinação de uma amostra deve focar não apenas no perfil das proteínas que estão sendoubiquitinadas, mas também na topologia de tal ubiquiinação. A avaliação dessa topologia por MS direcionada, como descrito aqui, tem um papel em uma ampla gama de investigações biológicas.
Deve-se entender que o protocolo aqui descrito fornece um perfil.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Céline Jeanty por sua ajuda na criação de pelotas celulares com tratamento da MG-132, conforme descrito nos resultados representativos e Elise Mommaerts por sua provisão de pelotas E. coli utilizadas no protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetonitrila (ACN) | Merck | 100029 | |
| Bicarbonato de amônio (ABC) | Centrífuga Fluka | 9830 | |
| Beckman | Coulter | Microfuge 16 | |
| Cloroacetamida (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Ácido fórmico (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Peptídeos Pesados | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Coluna | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Espectrômetro de Massa | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-etilmaleimida (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Cadeia de Controle Positivo K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Cadeia de Controle Positivo K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Cadeia de Controle Positivo M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Hidróxido de Sódio (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson Sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Tripsina | Promega | V1511A | |
| Ureia | Sigma | 51456 | |
| Waters μ Placas de eluição C18 Águas | 186002318 |
Referências
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
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Reimpressões e permissões
