A prenimação é uma modificação importante nas proteínas de ligação da membrana periférica. As células de insetos podem ser manipuladas para produzir KRAS4b farnesilado e carboximetilado em quantidades que permitem medições biofísicas de interações proteína-proteína e proteína-lipídios
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Artigo de método
KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada
Neste artigo
Resumo
Resumo
A prenimação proteica é uma modificação fundamental que é responsável pela segmentação de proteínas para membranas intracelulares. Kras4b, que é mutado em 22% dos cânceres humanos, é processado por farnização e carboximetilação devido à presença de um motivo de caixa 'CAAX' no C-terminus. Um sistema de baculovírus projetado foi usado para expressar KRAS4b farnesilado e carboximetilado em células de insetos e foi descrito anteriormente. Aqui, descrevemos a purificação detalhada e prática e caracterização bioquímica da proteína. Especificamente, a afinidade e a cromatografia de troca de íons foram usadas para purificar a proteína à homogeneidade. A espectrometria de massa intacta e nativa foi utilizada para validar a modificação correta do KRAS4b e para verificar a ligação do nucleotídeo. Finalmente, a associação da membrana de KRAS4b farnesylated e carboxymethylated aos lipossomos foi medida usando a espectroscopia da ressonância do plasmon de superfície.
Introdução
As modificações pós-translacionais desempenham um papel fundamental na definição da atividade funcional das proteínas. Modificações como fosforilação e glicosilação estão bem estabelecidas. As modificações lipídicas são menos bem caracterizadas, no entanto. Estima-se que até 0,5% de todas as proteínas celulares podem ser pré-nylated1. Prenimação é a transferência de um farnesyl de 15 carbonoou uma cadeia lipídica geranylgeranyl de 20 carbono para uma proteína aceitante contendo o motivo CAAX2. Proteínas pré-lafoladas têm sido implicadas na progressão de várias doenças humanas, incluindo o envelhecimento prematuro
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Protocolo
1. Purificação de proteínas
- Prepare buffers A-H, como visto na Tabela 1.
| Solução tampão | Agente tampão (todos os 20 mM) | pH P H | NaCl (mM) NaCl (mM) | imidazol (mM) imidazol (mM) | MgCl 2 MgCl2 | TCEP TCEP |
| Um | HEPES HEPES | 7.3 | 300 | -<.... |
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Resultados
Uma das maiores variáveis do protocolo é a quantidade de proteína alvo expressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo foi desenvolvido usando um isolado de uma linha celular Trichoplusia ni, Tni-FNL17,adaptado para o crescimento da suspensão e desmamado do soro. Dada a ampla gama de resultados relatados em todas as várias linhas de células insetos com o sistema de expressão de baculovírus, é aconselhável que tni-FNL ser usado, pelo menos inicialmente, para produzido KRAS4b-FMe.
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Discussão
Conforme observado na seção resultados representativos, o passo mais crítico durante a purificação é o manuseio da amostra durante o tempo em que está em sal inferior. Limitar o tempo em que a amostra é exposta a menos de 200 mM NaCl ajudará a reduzir a precipitação e aumentar o rendimento da amostra. A interpretação dos resultados do CEX pode ser difícil se o perfil não corresponder às expectativas (ver Figura 2). Até que o protocolo se torne rotina, é aconselhável que as frações de elução .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Reconhecemos o apoio à clonagem e expressão de Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew no Laboratório de Expressão de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este projeto foi financiado no todo ou em parte com fundos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, o Contrato Nº. HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem menciona nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implicam endosso do Governo dos EUA
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos Safe-Lock de 1,8 mL, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Frascos de Amostrador Automático de Inserção Intertravada | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | comprar como estoques líquidos em clorofórmio | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS) | AVANTI LIPÍDIOS POLARES | 840034 | comprar como estoques líquidos em clorofórmio |
| 5427R Centrífuga | Eppendorf | ||
| Acetonitrila, HPLC Grau | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Acetato de amônio | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Gás argônio | Airgas | ARUP | |
| Placa de ensaio 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Coluna de Cromatografia de Troca Catiônica (CEX) | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Thermo Scientific | |||
| Ácido Fórmico | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | grau de reagente ou melhor |
| Frascos Gilson 7x14 mm Tubos | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Frascos de rosca de parafuso de vidro com forros | de espuma PTFEEspecialidades Científicas | B69302 | |
| Centrífuga de alta velocidade/bancada | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capaz de até 4.000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purificado de acordo com Raran-Kurussi et al. (2017) Remoção de Tags de Afinidade com Protease TEV. In: Burgess-Brown N. (eds) Expressão gênica heteróloga em E.coli. Métodos em Biologia Molecular, vol 1586. Humana Press, Nova York, NY |
| Coluna de Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC) | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| Abastecimento de Água Interno, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistividade de 18 MΩ | |
| Conjunto de extrusora de lipídios | AVANTI POLAR LIPIDS | ||
| Nitrogênio líquido | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluídico Microfluídico | |||
| MabPac RP UHPLC Coluna, 4 um, 3,0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Coluna, 5 um, 300 Å, 2,1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| Software MagTran | Thermo Scientific | ||
| Metanol, Grau HPLC | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| Sistema de Cromatografia NGC | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Sistema de Cromatografia |
| Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA ou outros quelantes | Cápsulas de borracha Millipore Sigma | P8849 | |
| tipo 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Série S Sensor Chip L1 | GE Healthcare 29104993 | ||
| Espectrofotômetro | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace a 280nm |
| Ultra-15 Unidades de Filtro Centrífugo, 10K NMWL | Millipore Sigma UFC901008 | Membrana PES | |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtros de Centrífuga | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrífuga | Beckman Coulter | Optima - L80K | capaz de 100.000 xg |
| Vanquish UHPLC (Bomba, Coluna Hearter e Sistema LC) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Água, Grau HPLC | Sigma-Aldrich | 270733-1L | Pode usar fonte de água interna (veja abaixo) |
| Seringa Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtro | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | software proteômico |
Referências
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.
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Reimpressões e permissões
