KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada

Summary

A prenimação é uma modificação importante nas proteínas de ligação da membrana periférica. As células de insetos podem ser manipuladas para produzir KRAS4b farnesilado e carboximetilado em quantidades que permitem medições biofísicas de interações proteína-proteína e proteína-lipídios

Abstract

A prenimação proteica é uma modificação fundamental que é responsável pela segmentação de proteínas para membranas intracelulares. Kras4b, que é mutado em 22% dos cânceres humanos, é processado por farnização e carboximetilação devido à presença de um motivo de caixa 'CAAX' no C-terminus. Um sistema de baculovírus projetado foi usado para expressar KRAS4b farnesilado e carboximetilado em células de insetos e foi descrito anteriormente. Aqui, descrevemos a purificação detalhada e prática e caracterização bioquímica da proteína. Especificamente, a afinidade e a cromatografia de troca de íons foram usadas para purificar a proteína à homogeneidade. A espectrometria de massa intacta e nativa foi utilizada para validar a modificação correta do KRAS4b e para verificar a ligação do nucleotídeo. Finalmente, a associação da membrana de KRAS4b farnesylated e carboxymethylated aos lipossomos foi medida usando a espectroscopia da ressonância do plasmon de superfície.

Introduction

As modificações pós-translacionais desempenham um papel fundamental na definição da atividade funcional das proteínas. Modificações como fosforilação e glicosilação estão bem estabelecidas. As modificações lipídicas são menos bem caracterizadas, no entanto. Estima-se que até 0,5% de todas as proteínas celulares podem ser pré-nylated¹. Prenimação é a transferência de um farnesyl de 15 carbonoou uma cadeia lipídica geranylgeranyl de 20 carbono para uma proteína aceitante contendo o motivo CAAX². Proteínas pré-lafoladas têm sido implicadas na progressão de várias doenças humanas, incluindo o envelhecimento prematuro^3,Alzheimer^4,disfunção cardíaca⁵, choroideremia⁶, e câncer⁷. Os pequenos GTPases, HRAS, NRAS e KRAS^1,laminados nucleares e as kinetochores CENP-E e F são proteínas farnesilado a condição basal. Outros pequenos GTPases, ou seja, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS são geranylgeranylated⁸, enquanto RhoB pode ser farnesylated ou geranylgeranylated⁹.

O pequeno GTPase KRAS4b funciona como um interruptor molecular, essencialmente transmitindo fator de crescimento extracelular sinalizando para vias intracelulares de transdução de sinal que estimulam o crescimento e proliferação de células, através de múltiplas interações proteína-proteína. Existem dois aspectos-chave da bioquímica KRAS4b que são essenciais para a sua atividade. Primeiro, os ciclos de proteína entre um PIB inativo e um estado vinculado ao GTP ativo pelo qual ele se envolve ativamente com efíores. Em segundo lugar, uma região de poliliina terminal C e uma cisteína farnesilado e carboximetilada direcionam a proteína para a membrana plasmática, permitindo o recrutamento e a ativação de emigrantes a jusante. MutantKRAS4b é um motorista oncogênico no câncer pancreático, colorretal e pulmonar^10,e, como tal, a intervenção terapêutica teria um enorme benefício clínico. A produção de proteína recombinante autenticamente modificada que é farnesilado e carboximetilado permitiria triagem bioquímica usando KRAS4b em combinação com substitutos de membrana, como lipossomas ou nanodiscos lipídicos^11,12.

Farnesyl transferase (FNT) catalisa a adição de pirofosfato farnério ao cisteína c-terminal no motivo CAAX em KRAS4b. Após a pré-nimação, a proteína é traficada para o retículo endoplasmático (ER), onde a enzima de conversão ras (RCE1) divide os três resíduos do terminal C. O passo final no processamento é a metilação do novo resíduo de farnesylcisteína c-terminal pela proteína da membrana er, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). A expressão de KRAS4b recombinante em E. coli resulta na produção de uma proteína não modificada. Tentativas anteriores de produzir KRAS4b processados foram limitadas devido a rendimentos insuficientes para experimentos estruturais ou de rastreamento de drogas ou não conseguiram recapitular a proteína madura nativa de corpo inteiro^13,14. O protocolo apresentado aqui utiliza um sistema de expressão de células de insetos à base de baculovírus projetado e método de purificação que gera KRAS4b altamente purificado e totalmente processado a rendimentos de 5 mg/L da cultura celular.

A caracterização cuidadosa da proteína é essencial validar a qualidade das proteínas recombinantes antes de embarcar em biologia estrutural ou estudos de triagem de medicamentos. Dois parâmetros-chave do KRAS4b totalmente processado são a validação da modificação prenimita correta e a disponibilidade do C-terminus (FMe) farnesylatelado e carboximetilado para interação com substitutos de membrana ou lipídios. A espectrometria de massa de ionização de eletrospray (ESI-MS) do KRAS4b-FMe foi usada para medir o peso molecular e confirmar a presença das modificações de farnése e carboximetil. A espectrometria de massa nativa, onde as amostras são pulverizadas com solventes não desativação, foi usada para demonstrar que kras4b-fme também estava vinculado ao seu cofator do PIB. Finalmente, a espectroscopia de ressonância plasmon superficial foi usada para medir a ligação direta do KRAS4b-FMe com lipossomas imobilizados.

Protocol

1. Purificação de proteínas

1. Prepare buffers A-H, como visto na Tabela 1.

Solução tampão	Agente tampão (todos os 20 mM)	pH P H	NaCl (mM) NaCl (mM)	imidazol (mM) imidazol (mM)	MgCl 2 MgCl2	TCEP TCEP
Um	HEPES HEPES	7.3	300	-	5	1
B	HEPES HEPES	7.3	300	35	5	1
C	HEPES HEPES	7.3	300	500	5	1
D	MES MES	6.0	200	-	5	1
E E	MES MES	6.0	-	-	5	1
F	MES MES	6.0	100	-	5	1
G	MES MES	6.0	1000	-	5	1
H	HEPES HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Prepare os materiais de purificação (ver Tabela de Materiais):coquetel inibidor de protease sem EDTA ou outros quelantes; coluna de cromatografia de afinidade metálica imobilizada (IMAC); coluna de cromatografia de troca de cation (CEX); filtro de seringa de 0,45 μm; 2 M imidazol (pH = 7,5); ultracentrífuga capaz de 100.000 x g; centrífuga de bancada de alta velocidade capaz de 4.000 x g; Unidades de filtro centrífuga (10 KDa NMWL); espectrômetro capaz de ler a 280 nm; His6-tobacco etch virus (TEV) protease; e instrumentação cromatográfica capaz de misturar duas soluções tampão, aplicando soluções para colunas, criando eluções de gradiente da coluna e coletando frações de colunas.
3. Descongelar células de ~ 2 L da cultura de células de insetos anteriormente armazenados a -80 °C ou usar células recém-colhidas. Veja Gillette et al. 2019¹⁵ para obter detalhes sobre os protocolos de expressão e linha de insetos Tni.FNL. Suspenda cuidadosamente as células com 200 mL de Buffer A com inibidor de protease 1:200 v/v adicionado sem introduzir ar ou criar espuma.
   NOTA: Passo 1.3 e etapas subsequentes (exceto como observado) devem ser realizadas à temperatura ambiente (~ 22 °C). É importante que a amostra seja homogênea para permitir lise completa na próxima etapa.
4. Pelota de célulade lyse em um microfluidizer a 7.000 psi por dois passes ou em um sistema de lyse equivalente. Métodos alternativos de lyse não foram explorados.
5. Esclarecer a lysates da pilha do inseto é problemático devido à presença dos compostos que obstruem filtros. Assim, a ultracentrífugação (100.000 x g por 30 min a 4 °C) é muito importante. Um resíduo lipídico branco na superfície do supernatant deve ser evitado e pode ser removido ou reduzido usando cotonetes de algodão. Filtre o supernatant decantado através de um filtro de 0,45 μm PES. Use a amostra clarificada imediatamente ou guarde a -80 °C.
   NOTA: Os resíduos bloqueiam filtros rapidamente e muitos filtros podem ser necessários. A falha reduzir a quantidade deste material conduzirá à pressão traseira elevada da coluna em etapas subseqüentes.
6. Determinar o volume do lysate clarificado e ajustar a amostra para 35 mM imidazole pela adição de 2 M imidazole. Carregue a amostra em 3 mL/min em uma coluna IMAC de 20 mL (coluna HisPrep FF 16/10) pré-equilibrada no Buffer B para três volumes de coluna (Currículos).
7. Embora a proteína alvo seja tipicamente quantitativamente adsorda para a coluna, é melhor coletar o fluxo de coluna para análise posterior. Lave a coluna até que o Abs₂₈₀ atinja uma linha de base constante (<100 milliabsorbance units [mAU]) com Buffer B em 3 mL/min para 20 mL (1 CV), em seguida, para ~ 3 CV em 4 mL/min para o restante da etapa de lavagem. Normalmente, 60-80 mL de Buffer B é necessário para alcançar a absorção de linha de base.
8. Elute a proteína com um gradiente de 400 mL (20 CV) do Buffer B ao Buffer C ao coletar 8 frações do mL. Normalmente, as proteelas alvo de proteína na primeira metade do gradiente (Figura 1A;nem todas as frações posteriores são mostradas).
9. Analise frações de proteína usando manchas SDS-PAGE/Coomassie. As frações máximas da associação e diállita a associação durante a noite de encontro a 2 L do tampão D em 4 °C.
   NOTA: O baixo pH é fundamental para garantir a ligação à proteína na próxima etapa. No entanto, a mudança de pH durante esta diálise ocorre lentamente, e este é um passo conveniente para a incubação durante a noite. Não foram investigadas estratégias alternativas de troca de buffer (por exemplo, maior concentração tampão para acelerar a alteração do pH). A proteína começará a precipitar lentamente ao longo do tempo em menor pH e menores concentrações de sal e uma pequena quantidade de precipitação é normal durante esta etapa. Devido a isso, evitamos trocar o buffer para o NaCl de 100 mM necessário para a ligação para a próxima coluna durante a diálise. Em vez disso, uma concentração de NaCl de 200 mM é usada para diálise e a proteína é diluída a 100 mM (veja abaixo) imediatamente antes da aplicação da coluna. Nós não investigamos se esta precipitação é específica para KRAS4b, mas a proteína que precipitar foi confirmada como KRAS4b-FMe. Por esta razão, sugerimos o uso da maior concentração de NaCl no buffer de diálise para qualquer proteína de interesse como precaução até que a estabilidade da proteína alvo no buffer de ligação possa ser determinada.
10. Retire a amostra da diálise e centrífuga a 4.000 x g por 10 min para remover qualquer precipitação. A amostra final dinada e clarificada neste momento ainda é muitas vezes nebulosa, mas pode ser aplicada sem processamento adicional na coluna CEX subsequente.
11. Prepare uma coluna de troca de cation de 20 mL (ver Tabela de Materiais)lavando com três currículos de Buffer G, em seguida, com três currículos de Buffer F.
    NOTA: Embora não tenhamos avaliado meticulosamente outras resinas, vários colegas encontraram má resolução com resinas que não seja sp sepharose resina de alto desempenho.
12. Diluir 20 mL da amostra dilacerada a uma concentração final de NaCl de 100 mM adicionando 20 mL de Buffer E e aplique a amostra diluída na coluna de troca de cation.
13. Continue a carregar a coluna adicionando amostras recém-diluídas preparadas como descrito acima para o tubo de carga como a diluição anterior está se aproximando do final da carga.
    NOTA: Diluir toda a amostra de uma só vez a 100 mM NaCl resultou em perda significativa de proteína alvo devido à precipitação.
14. Lave a coluna para a linha de base Abs₂₈₀ com Buffer F. Isso normalmente requer 3 CV. A proteína é eluted da coluna durante um gradiente de 400 mL (20 CV) de Buffer F para 65% Buffer G, coletado em frações de 6 mL(Figura 1B).
15. Continue lavando a coluna para um CV adicional de 1,5 (65% Buffer G) uma vez que o gradiente seja concluído. Escolha frações positivas com base na análise de manchas azuis SDS-PAGE/Coomassie e inspeção do traço UV do cromatograma.
    NOTA: O traço UV normalmente contém cinco picos. Começando em concentrações mais baixas do sal, o pico inicial é geralmente unprocessed e/ou proteína proteolizada. O segundo e terceiro picos são uma mistura de duas formas de proteína processada: o segundo pico é principalmente um intermediário farnesylated (FARN), enquanto o terceiro é principalmente a proteína de interesse FMe totalmente processada. Os picos quatro e cinco representam proteínas de fusão His6-MBP-KRAS4b (toda a proteína está neste formato neste momento, como não ocorreu nenhuma digestão tev). Estes não são N-acetillated no N-terminus e são farnesylated (pico quatro) e farnesylated e carboxymethylated (pico cinco) no C-terminus. Como pico dois e pico quatro irá produzir proteínas idênticas após a remoção de etiquetas (ou seja, KRAS4b-FARN) estes podem ser agrupados nesta fase, se desejar. Da mesma forma, o pico três e o pico cinco podem ser combinados para produzir um único lote de KRAS4b-FMe (Figura 1B, Figura 2). No entanto, é aconselhável que este agrupamento só seja feito quando a natureza da proteína nos picos separados tiver sido confirmada.
16. Dime a proteína agrupada no passo 1.15 com protease His6-TEV (~200 μg de protease/mL de amostra.
    NOTA: Nós fazemos His6-TEV protease usando o plasmídeo e protocolos disponíveis a partir de Addgene(https://www.addgene.org/92414). Diálise o tev digerir contra buffer a (10 kDa MWCO diálise tubulação com um mínimo de 40 mL de buffer a por mL de amostra) para 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, durante a noite em 4 °C.
17. Após a digestão e diálise, carregue a proteína diretamente para uma coluna IMAC de 20 mL equilibrada com Buffer A a 3 mL/min.
    NOTA: Coletar 7 frações mL durante toda esta cromatografia, porque a proteína alvo tem uma baixa afinidade com a coluna, mas pode não ser totalmente ligada à resina. Lave a coluna a 3 mL/min com buffer A para um total de 3 currículos ou até que uma absorção de linha de base seja alcançada.
18. A proteína alvo é eluted com um gradiente cv 5 de Buffer C de 0%-10%, coletando 7 frações mL. Como precaução, proteínas vinculadas adicionais podem ser eluted com 100% Buffer C. Frações positivas são identificadas após análise por SDS-PAGE(Figura 1C). Normalmente, a proteína alvo elutes em uma baixa concentração de imidazol (ou seja, no gradiente Buffer C de 0%-10%, mas às vezes elutes no fluxo através ou lavagem de coluna.
19. Diálise o pool final contra Buffer H. Determinar a concentração de proteína por espectrofotometria em 280 nm.
    NOTA: Certifique-se de explicar a presença do nucleotídeo ao determinar o coeficiente de extinção para usar para este cálculo.
20. A proteína pode ser concentrada a ~2-5 mg/mL usando uma unidade centrífuga do filtro (10 K NMWL) sem perda significativa da proteína. Filtro com um filtro de seringa de 0,22 μM. Medir a absorção da solução em A₂₈₀ para calcular a concentração final de proteínas(Figura 1D). Snap congela alíquotas em nitrogênio líquido e armazena amostras congeladas a -80 °C.
    NOTA: A proteína purificada está vinculada ao PIB. KRAS4b-FMe pode ser trocado em GppNHp usando protocolos previamente publicados^16.

2. Preparação da amostra para a análise de massa intata e a análise de massa nativa

1. Preparação da amostra para a análise de massa intata
   1. Descongele a amostra de proteína no gelo antes da análise. Para análise de massa intacta, diluir a proteína para 0,1 mg/mL em 20 mM amônio bicarbonato (pH = ~ 8,4). Para análise de massa nativa, diluir a proteína a uma concentração de 0,1 mg/mL em 50 mM acetato de amônio (pH = ~ 7,5). Vortex cada amostra para 5-10 s, em seguida, centrífuga em 12.500 x g para 1 min para pelota qualquer material sólido na solução. Retire 10-20 μL de cada supernatant e transfira para um frasco de autosampler de vidro. Tampa cada frasco firmemente para impedir a contaminação ou a evaporação.
      NOTA: Para análise de massa intacta ou análise de massa nativa, a amostra pode ser dessaled antes da análise usando um filtro de membrana de celulose 10 kDa MWCO para buffer-troca no buffer de diluição final.
2. Preparação da espectroscopia de massa estendida (EMR) para análise de massa
   NOTA: Antes de executar qualquer análise sobre o espectrômetro de massa, certifique-se de que ele foi recentemente calibrado. Além disso, use sempre luvas e outros equipamentos de proteção individual, conforme necessário, para evitar quaisquer produtos químicos nocivos e para evitar contaminar amostras e solventes. A calibração é feita usando uma solução de calibração obtida comercialmente e uma solução de iodeto de césio 2 mg/mL preparada internamente.
   1. Abra o software de análise e carregue o arquivo do método de instrumento apropriado. Para análise de massa intacta das proteínas KRAS4b, os parâmetros iniciais adequados são os seguintes: modo positivo de detecção; três microsscans, resolução = 70.000; Meta aGC = 3e^6; tempo máximo de integração = 200 ms; e uma faixa de digitalização = 70-1.800 relação massa-carga (m/z). Para análise de massa nativa das proteínas KRAS4b, parâmetros iniciais adequados são os seguintes: modo positivo de detecção; 10 microsscanos, resolução = 17.500; dissociação induzida por colisão na fonte (CID) = 20 eV; Meta aGC = 3e^6; energia da colisão (CE) = 20; tempo máximo de integração = 200 ms; e uma faixa de digitalização = 500-10.000 m/z.
3. Preparação de solventes cromatográficos e coluna
   1. Prepare os solventes necessários para a análise de massa intacta. Solvente A é água com 0,1% de ácido fórmico. Solvente B é 80% acetônio e 0,1% ácido fórmico na água.
   2. Prepare os solventes necessários para a análise de massa nativa. Solvente A é de 0,1 M acetato de amônio em água e solvente B é água.
   3. Depois que os solventes apropriados são preparados, remoção do sistema de modo que a tubulação esteja enchida com os solventes apropriados e todas as bolhas de ar sejam removidas das linhas.
   4. Instale a coluna apropriada (uma coluna de fase invertida para análise de massa intacta e uma coluna de exclusão de tamanho para análise de massa nativa). Para análise de massa intacta, a taxa de fluxo é de 0,5 mL/min, e a temperatura da coluna (usando um aquecedor de coluna) é de 50 °C. Equilibre a coluna por 15-20 min. Para análise de massa nativa, a taxa de fluxo é de 0,25 mL/min.
      NOTA: Sempre monitore a coluna de pressão para trás para garantir que ela não se elevou acima do limite superior, o que poderia indicar uma linha entupida ou que a matriz da coluna está comprometida. Substitua a coluna, se necessário.
4. Análise de amostras
   1. Coloque a amostra de proteína preparada no frasco de autosampler de vidro no rack de frasco apropriado no autosampler de sistemas LC. Crie uma lista de amostras no programa de software com o método de instrumento adequado para a análise desejada. Depois que a lista de amostras estiver concluída, clique no botão Play para iniciar a análise.
   2. Injete 1-2 μL de amostra por análise, com água em branco antes e depois de cada amostra, para garantir que não haja transporte.
      NOTA: A análise de massa intacta é muito diferente da análise de massa nativa e requer configurações de método de instrumentomuito diferentes. Isso ocorre porque com a análise de massa intacta, a proteína é "relaxada" na presença de um solvente orgânico e, portanto, é capaz de aceitar mais encargos. É mais fácil desconvolute e resolver a distribuição isotópica dos estados da carga. A análise de massa nativa fornece uma distribuição de carga estreita dos íons proteicos, e com base na proteína, requer diferentes configurações de energia de tensão e colisão.
5. Análise de dados e desconvolução de proteína
   1. Exportar o espectro da amostra para o software onde ele pode ser transformado para o espectro descomplicado que irá exibir a massa intacta (ou massa nativa) da proteína. A massa intacta terá uma distribuição de pico isotópico devido à alta abundância de picos espectrais carregados. A massa nativa terá tipicamente muito poucos picos devido à baixa abundância dos picos espectrais carregados(figura 3D).
   2. Expandir a escala da relação da massa-à-carga (m/z) do d máximo para confirmar que a massa medida é consistente com a massa prevista. Ocasionalmente, devido à adição de cargas à proteína, pode haver uma ligeira variação entre o peso molecular esperado (MW) e o MW observado. Além disso, como acontece com muitas análises de espectrometria de massa, adutores como o sódio podem contribuir para o aparecimento de picos adicionais nos dados, mesmo com amostras cuidadosamente dessalgadas. Picos abundantes mais baixos com um m/z que é menor do que o esperado às vezes são observados. Isto é provavelmente devido a uma perda neutra, que é a perda de um grupo funcional devido ao processo de ionização.
      NOTA: Como esperado, haverá diferenças entre a massa intacta e os picos de massa nativa. A exposição de massa intata mostrará o MW esperado da proteína. Ele não terá o MW extra do nucleotídeo anexado ou outras modificações. No entanto, o pico de massa nativa mostrará a proteína com qualquer nucleotídeo adicionado.

3. Validação de KRAS4b-FMe ligando-se a lipossomas

1. Preparação de lipossomos de membrana
   1. Prepare um buffer composto por 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl e 1 mM TCEP.
   2. Os materiais de preparação para lipossoma incluem 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) e 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serina (POPS) estoques em clorofórmio; um extruder lipídico conjunto com um suporte e bloco de aquecimento; gás argônio e nitrogênio líquido; um banho ultrassônico; frascos de fio de parafuso de vidro com forros de espuma PTFE; e um leitor de placa capaz de detecção de dispersão de luz dinâmica.
   3. Descongelar estoques lipofóridos em clorofórmio à temperatura ambiente por 30 min. Prepare-se 1 mL de 5 mM 70:30 POPC: lipossomos POPS por alíquota de 106 μL de 25 mM POPC (estoque) e 118 μL de 10 mM POPS (estoque) em um frasco de vidro.
      NOTA: Não avulte lipídios com uma ponta de plástico, porque o clorofórmio poderia dissolver certas pontas de plástico.
   4. Lipídios secos um fluxo constante de gás argônio. Gire lentamente o frasco de vidro ao aplicar o gás do argônio para dar forma a uma camada fina de película seca.
   5. Coloque amostras um lyofilizer vácuo durante a noite para remover o excesso de clorofórmio.
   6. Reconstitua os lipídios adicionando 1 mL de buffer ao filme seco e vórtice as misturas por 5 min. Hidrate as misturas lipídicas balançando por 1 h a 25 °C.
      NOTA: A amostra será muito turva após a adição do buffer para a camada de filme seco de lipídios.
   7. Realize cinco ciclos de congelamento/degelo alternando a colocação do frasco de amostra entre uma água gelada (4 °C ou inferior) e um banho de água morna (25 °C ou superior).
   8. Coloque o frasco de amostra no banho ultrassônico e sonore a amostra por cerca de 0,5 h ou até que a amostra se torne semitransparente.
   9. Extrudir as amostras usando o conjunto de extruder lipídico. Monte o kit de extrusão, como mostrado nas instruções do fabricante. Extrude as amostras usando 0,1 μm de papel filtro. Carregue as amostras em uma seringa de vidro e anexe-as a uma extremidade do aparelho de extrusão. Adicione uma seringa vazia do outro lado do aparelho de extrusão. Empurre para frente e para trás 10-20x até que suas amostras se tornem totalmente transparentes.
   10. Gire as amostras finais para 30 min em 20.000 x g para remover quaisquer grandes agregados.
   11. Use dispersão de luz dinâmica (DLS) para determinar o tamanho e a homogeneidade dos lipossomos (opcional). Coloque 30 μL dos lipossomas em um leitor de placa de 384 poços. Gire a placa a 1.000 x g por 30 min. Coloque a placa em um leitor de placa e colete 10 medições de dispersão de luz.
2. Caracterizando KRAS4b-FMe que liga aos lipossomos através da ressonância do plasmon de superfície (SPR)
   1. Montar os materiais necessários: um instrumento SPR; chip de sensor L1; Tubos de frasco de 7 x 14 mm; e CHAPS.
   2. Prepare um buffer contendo 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Prepare uma série de diluição 2:1 de KRAS4b-FMe de 60 μM-0,06 μM em um volume total de 200 μL (10 titrations total). Transfira as amostras diluídas finais em tubos de frasco (ver Tabela de Materiais),coloque os tubos de frasco em um rack e insira as amostras no instrumento SPR.
   3. Insira o chip de sensor L1 no instrumento SPR. Anexar o buffer e prime o sistema com buffer por 7 min.
   4. Configure um método automatizado da seguinte forma:
      1. Definir a temperatura do instrumento para 25 °C.
      2. Ative o chip de sensor L1 enxaguando-o com duas injeções de 1 minuto de 20 mM CHAPS dissolvidas em água a 30 μL/min taxa de fluxo.
      3. Realize ciclos de start-up de dez injeções de 1 minuto de tampão de corrida para hidratar a superfície do chip.
         1. Deposite os lipossomos no chip de sensor L1 injetando os lipossomas na célula de fluxo (FC)-2 do chip L1 com 2 injeções de min a 5 μL/min. Aponte para um nível de captura de pelo menos ~3.000 unidades de resposta (RUs).
            NOTA: Aumentar o tempo de injeção até atingir o nível de captura adequado.
      4. Injete três ciclos de reserva sobre fc-1 e FC-2 com injeções de 1 min a 30 μL/min.
         1. Injete as várias titrations kras4b-FMe das mais baixas à mais alta série de concentração. Injete as proteínas usando injeções de 1 min para a fase de associação e 2 injeções de min para a fase de dissociação em 30 μL/min taxa de fluxo sobre ambos os FCs.
         2. Regenerar o chip de sensor L1 enxaguando-o com duas injeções de 1 minuto de 20 mM CHAPS a 30 μL/min.
   5. Ajuste os dados usando o software de avaliação SPR usando um modelo de ligação de um único site para obter afinidades de ligação aparentes (veja a seção discussão para uma explicação da montagem de dados).

Results

Uma das maiores variáveis do protocolo é a quantidade de proteína alvo expressa (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo foi desenvolvido usando um isolado de uma linha celular Trichoplusia ni, Tni-FNL^17,adaptado para o crescimento da suspensão e desmamado do soro. Dada a ampla gama de resultados relatados em todas as várias linhas de células insetos com o sistema de expressão de baculovírus, é aconselhável que tni-FNL ser usado, pelo menos inicialmente, para produzido KRAS4b-FMe.

Discussion

Conforme observado na seção resultados representativos, o passo mais crítico durante a purificação é o manuseio da amostra durante o tempo em que está em sal inferior. Limitar o tempo em que a amostra é exposta a menos de 200 mM NaCl ajudará a reduzir a precipitação e aumentar o rendimento da amostra. A interpretação dos resultados do CEX pode ser difícil se o perfil não corresponder às expectativas (ver Figura 2). Até que o protocolo se torne rotina, é aconselhável que as frações de elução ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos Safe-Lock de 1,8 mL, Natural	Eppendorf	22363204
11 mm Cl SS Frascos de Amostrador Automático de Inserção Intertravada	Thermo Scientific	30211SS-1232
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC)	AVANTI POLAR LIPIDS		comprar como estoques líquidos em clorofórmio
1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS)	AVANTI LIPÍDIOS POLARES	840034	comprar como estoques líquidos em clorofórmio
5427R Centrífuga	Eppendorf
Acetonitrila, HPLC Grau	Fisher Chemical	A998-1 1L
Acetato de amônio	Sigma-Aldrich	09689-250g
Gás argônio	Airgas	ARUP
Placa de ensaio 384	CORNING	3544
Biacore T200 Instrument	GE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/S	Thermo Scientific	C4011-54B
Branson Ultrasonic Bath	Thermo Fisher	15-336-1000
Coluna de Cromatografia de Troca Catiônica (CEX)	GE Healthcare Life Sciences	29018183	HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPS	Sigma	C3023
Dyna Pro Plate Reader	Wyatt Technologies
	Thermo Scientific
Ácido Fórmico	Sigma-Aldrich	F0507-500Ml	grau de reagente ou melhor
Frascos Gilson 7x14 mm Tubos	GE Healthcare	BR-1002-12
Frascos de rosca de parafuso de vidro com forros	de espuma PTFEEspecialidades Científicas	B69302
Centrífuga de alta velocidade/bancada	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	capaz de até 4.000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease	Addgene	92414	Purificado de acordo com Raran-Kurussi et al. (2017) Remoção de Tags de Afinidade com Protease TEV. In: Burgess-Brown N. (eds) Expressão gênica heteróloga em E.coli. Métodos em Biologia Molecular, vol 1586. Humana Press, Nova York, NY
Coluna de Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC)	GE Healthcare Life Sciences	28-9365-51	HisPrep FF 16/10
Abastecimento de Água Interno, Arium Advance	Sartorius Stedim		Resistividade de 18 MΩ
Conjunto de extrusora de lipídios	AVANTI POLAR LIPIDS
Nitrogênio líquido	Airgas	NI-DEWAR
M110-EH microfluídico Microfluídico
MabPac RP UHPLC Coluna, 4 um, 3,0 x 50 mm	Thermo Scientific	088645
MabPac SEC-1 Coluna, 5 um, 300 Å, 2,1 x 150 mm	Thermo Scientific	088790
Software MagTran	Thermo Scientific
Metanol, Grau HPLC	VWR Chemicals	BDH20864.400
Sistema de Cromatografia NGC	BioRad	78880002	NGC QuestTM 100 Sistema de Cromatografia
Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA ou outros quelantes	Cápsulas de borracha Millipore Sigma	P8849
tipo 3	GE Healthcare	BR-1005-02
Série S Sensor Chip L1	GE Healthcare 29104993
Espectrofotômetro	Thermo Fischer Scientific	13-400-519	Absorbace a 280nm
Ultra-15 Unidades de Filtro Centrífugo, 10K NMWL	Millipore Sigma UFC901008		Membrana PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtros de Centrífuga	Amicon	UFC501024
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima - L80K	capaz de 100.000 xg
Vanquish UHPLC (Bomba, Coluna Hearter e Sistema LC)	Thermo Scientific
Vortex Genie 2	Fisher	12-812
Água, Grau HPLC	Sigma-Aldrich	270733-1L	Pode usar fonte de água interna (veja abaixo)
Seringa Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtro	GE Healthcare - Whatman	6994-2504
Xcalibur QualBrowser	Thermo Scientific		software proteômico