Artigo de método

Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

DOI:

10.3791/60705

⸱

1 de fevereiro de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrito aqui está o uso de um método específico de amplificação de sondas para analisar os níveis de metilação de elementos LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma. A ultracentrífugação, procedimento popular para separar vesículas extracelulares do soro bovino fetal, também é demonstrado.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A amplificação de sondas específicas de metilação (MSPA) é uma técnica simples e robusta que pode ser usada para detectar diferenças relativas nos níveis de metilação de amostras de DNA. É engenhoso, requer pequenas quantidades de DNA, e leva cerca de 4-5 h de trabalho prático. Na técnica apresentada, as amostras de DNA são primeiro desnaturadas e hibridizadas para sondas que visam DNA em locais metilados ou de referência como controle. O DNA hibrilado é separado em reações paralelas, uma passando apenas por ligadura e outra passando por ligadura seguida de digestão mediada por HhaI em sequências de GCGC não metiladas. Os fragmentos de DNA resultantes são amplificados pelo PCR e separados por eletroforese capilar. Os locais de GCGC metilados não são digeridos pelo HhaI e produzem sinais de pico, enquanto os locais de GCGC não metilados são digeridos e nenhum sinal de pico é gerado. Comparar os picos normalizados de controle de versões digeridas e não digeridas de cada amostra fornece a razão de dosagem de metilação de uma amostra de DNA. Aqui, o MSPA é usado para detectar os efeitos das vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma (EVs) sobre o estado de metilação do elemento nuclear longo-1 (LINE-1) em células-tronco mesenquimicas. Line-1 s são elementos repetitivos de DNA que normalmente sofrem hipometiação no câncer e, nesta capacidade, podem servir como um biomarcador. A ultracentrifugação também é usada como um método econômico para separar vesículas extracelulares de fluidos biológicos (ou seja, ao preparar o soro bovino fetal empobrecido por EV [FBS] e isolando OsVs da mídia condicionada pela osteossarcoma [centrífuga diferencial]). Para análise de metilação, as sondas LINE-1 personalizadas são projetadas para atingir três locais de metilação na sequência de promotores line-1 e sete locais de controle. Este protocolo demonstra o uso do MSPA para análise de metilação LINE-1 e descreve a preparação do FBS empobrecido por EV por ultracentrifugação.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A metilação de DNA é uma grande modificação epigenética que ocorre em células humanas. A metilação de DNA refere-se à ligação de grupos de metila a resíduos de citosina em dinucleotídeos cpg. Tais dinucleotídeos são geralmente encontrados em aglomerados (ilhas CpG) na região de 5' genes1. Em células normais, a maioria desses dinucleotídeos existem em um estado não metilado, o que permite a transcrição do DNA. Aliás, muitos cânceres estão associados a ilhas cpg hipermetiladas e silenciamento transcrita2, especialmente em genes supressores tumorais, que por sua vez contribuem para várias marcas do câncer3.

Por outro lado, elementos nucleares longos intercalados-1 (LINE-1 s ou L1s) são elementos repetitivos e transposáveis de DNA que normalmente têm altos níveis de metilação nas ilhas CpG. A metilação da LINHA-1 previne a translocação e ajuda a manter a integridade do genoma. Em vários tipos de câncer, a LINE-1 é hipometificada, resultando em ativação e subsequente instabilidade cromossômica mediada pela retrotransposição4. A LINHA-1 é responsável por quase 17% do genoma humano5,e seu status de metilação pode servir como um indicador dos níveis globais de metilação genômica6. A hipometração global line-1 é considerada para preceder a transição das células para um fenótipo tumoral7; portanto, mantém a promessa como um marcador potencial para o início precoce do câncer.

Atualmente, existem vários métodos para análise de metilação, incluindo pirosequenciamento, PCR específico de metilação, micromatrizes e imunoprecipitação de cromatina1. O uso do sequenciamento de próxima geração também possibilitou incorporar abordagens em todo o genoma à detecção da metilação do DNA. Muitos desses métodos dependem de DNA tratado com bisulfite, no qual citosinas não metiladas são convertidas em citosinas uracil e metiladas permanecem inalteradas. No entanto, trabalhar com DNA tratado com bisulfite tem várias armadilhas, como conversões incompletas de citosinas não metiladas ao uracil, amplificação tendenciosa de sequências e erros de sequenciamento8.

Na amplificação de sondaespecífica de metilação (MSPA), sondas compostas por duas oligonucleotídeas têm como alvo sequências de DNA contendo um local de restrição (GCGC) para a enzima de restrição sensível à metilação HhaI9. Após as sondas hibridizarem para o DNA, cada amostra é dividida em dois conjuntos. Sondas no primeiro set passam por ligação, enquanto as sondas no segundo set passam por ligação seguidas por hhaI mediada digestão em sites CGCG não metilados. Ambos os conjuntos de amostras são então amplificados pelo PCR, e os produtos são separados por eletroforese capilar. Sondas em locais não metilados são digeridas por HhaI e não são amplificadas durante o PCR, resultando em sinais de pico. Em contrapartida, as sondas em locais metilados são protegidas da digestão e, portanto, são amplificadas durante o PCR, gerando posteriormente sinais de pico10.

O MSPA tem várias vantagens em relação a métodos alternativos. Primeiro, requer uma baixa quantidade de DNA (50-100 ng) e é adequado para análise de DNA de amostras incorporadas de parafina fixafixa 10. Não requer DNA tratado com bisulfite; na verdade, é inadequado para DNA que é modificado desta forma. Muitas amostras podem ser analisadas ao mesmo tempo, e as sondas MSPA podem ser projetadas de tal forma que visam vários genes ou sequências simultaneamente. Além disso, as sondas são específicas e sensíveis para dna metilado, pois o local de restrição HhaI corresponde a uma sequência típica das ilhas CpG10.

Este estudo investigou os efeitos das vesículas extracelulares derivadas do osteossarcoma (OS) na metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimal derivadas de tecido adiposo (AT-MSCs; Figura 1). Os EVs são nanoescala, vesículas ligadas à membrana secretadas pela maioria dos tipos de células. Eles carregam proteínas, lipídios, mRNA, microRNA e moléculas adicionais das células-mãe11,12. Os EVs mediam a comunicação intercelular e desempenham papéis importantes em várias condições patosfisias13,14. Um estudo recente mostrou que os EVs derivados do câncer podem transferir o LINE-1 ativo para células receptoras15. Foi relatado anteriormente que os EVs da linha celular HOS-143B podem alterar o estado de metilação da LINHA-1 em MSCs, além de outros efeitos genéticos16.

Ao cultivar células para isolamento ev, é importante usar o soro bovino fetal esgotado por EV [FBS] no meio de crescimento, uma vez que os EVs derivados do FBS podem interferir com EVs de outras fontes e dificultar os resultados17,18. Ultracentrifugação é um dos métodos mais comuns para esgotar EVs da FBS. É um procedimento relativamente simples e econômico em comparação com alternativas como ultrafiltração e FBS19emesquetes comerciais de EV . Aqui, o protocolo também demonstra como preparar o FBS esgotado por EV por ultracentrifugação.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para as técnicas acima mencionadas, desde o isolamento de EVs de uma linha de células OS até a análise de metilação da LINHA-1 em MSCs tratados com OS-EV(Figura 1).

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Protocolo

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Distrito Hospitalar de Helsinque e Uusimaa (aprovação ética d. 217/13/03/2015).

1. Preparação de FBS empobrecido por EV por ultracentrifugação

  1. Pegue os tubos de centrífuga (ultra)centrífugas e coloque-os em baldes de ultracentrífugas. Para garantir que a ultracentrífuga corra de forma suave e segura, equilibre os baldes dentro de 10 mg um do outro.
  2. Carregue os baldes em um rotor balançando (tipo SW28, fator K 246). Coloque o rotor na ultracentrífuga e corra a 100.000 x g por 19 h a 4 °C.
  3. Colete cuidadosamente a camada superior de cor clara do supernatant (aproximadamente nove décimos) e transfira para um tubo de 50 mL. Não perturbe ou pipeta a pelota marrom escura, pois contém EVs da FBS.
  4. Passe o supernatant através de um filtro de 0,22 μm em um novo tubo de 50 mL.
  5. Adicione o FBS esterilizado pelo filtro e empobrecido por EV à mídia de cultura celular quando crescem células para isolamento EV.

2. Isolamento de EVs derivados de osteossarcoma

  1. As células OS da placa (linha celular HOS-143B) em um frasco T-175 com rpmi 1640 médio, complementados com FBS 10% normal e 1% antibióticos (100 u/mL penicilina, 0,1 mg/mL estreptomicina). Coloque o frasco em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Quando o frasco é de 70% a 80% de confluente, lave as células com salino tampão de fosfato (PBS) e as crie na mídia contendo FBS 10% EV-esgotado (a partir de agora referido como mídia esgotada por EV).
    NOTA: 1 x 106 células HOS-143B emplacadas em um frasco T175 atinge 70% de confluência após aproximadamente 60 h.
  3. Durante as próximas 48 h, colete mídia condicionada das células osteossarcoma após cada 24 h e adicione mídia fresca EV esgotada.
  4. Centrífuga a mídia condicionada em 2500 x g por 20 min a 4 °C para remover células e detritos celulares. Transfira o supernatante para um novo tubo, deixando cerca de 2 mL de mídia na parte inferior.
    NOTA: Se não prosseguir diretamente com o isolamento ev nesta fase, o supernatante pode ser armazenado em -80 oC.
  5. Despeje o supernatant em tubos de ultracentrífuga e equilibre-os como antes. Centrífuga os tubos a 100.000 x g por 2 h a 4 °C.
  6. Descarte cuidadosamente o supernatante, deixando cerca de 1 mL na parte inferior. Adicione cerca de 20 mL de PBS (0,1 μm filtrado) ao tubo e pipeta suavemente para lavar e resuspender a pelota EV.
  7. Balance os tubos e realize outra rodada de ultracentrifugação com as mesmas configurações.
  8. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota EV em 200 μL de PBS por tubulação suave. Armazene os EVs em tubos de baixa ligação.
    NOTA: Os EVs podem ser usados imediatamente ou então armazenados em -80 °C até que sejam necessários.

3. Caracterização de OS-EVs

NOTA: Os EVs purificados podem ser caracterizados por manchas ocidentais (WB), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM)16.

  1. Executar o WB de acordo com o protocolo padrão16 com os marcadores EV CD63, TSG101 e Hsp70, e com calnexina como um controle negativo para indicar pureza da amostra EV20.
  2. Para nta, primeiro diluir a amostra EV em 0,1 μm filtrado PBS dulbecco para obter (idealmente) 30-100 partículas por quadro.
    1. Pegue cerca de 500 μL da amostra em uma seringa de 1 mL e carregue-a na porta de entrada do instrumento NTA. Verifique se há partículas suficientes por quadro, para medidas precisas.
    2. Abra o software NTA e grave cinco vídeos de 60 anos de duração, usando o nível da câmera 13 em temperatura ambiente. Durante a análise, use limiar de detecção = 5 e ganho = 10.
  3. Analisar amostras de EV por TEM descritas anteriormente21.

4. Cultura AT-MSC

NOTA: O tecido adiposo humano para isolamento de células-tronco mesenquimicas foi fornecido como aspirador de lipoaspiração (Departamento de Cirurgia Plástica, Laser Tilkka Ltd., Finlândia). O consentimento informado escrito foi retirado dos doadores lipoaspiradores, que estavam passando por procedimentos de lipoaspiração eletiva.

  1. Isolar at-MSCs de aspiradores de lipoaspiração usando métodos padrão de isolamento mecânico e enzimático22.
    NOTA: MSCs de outras fontes (incluindo linhas de celular comerciais) também podem ser usados.
  2. Células culturais na mídia DMEM/F-12 suplementadas com 10% de FBS e 1% de antibióticos.

5. Tratamento de MSCs com OS-EVs

  1. Placa 15.000 AT-MSCs por poço em uma placa de 24 poços.
  2. Depois das 24 h, remova a mídia antiga, lave células com PBS e mude para mídia esgotada de EV.
  3. Trate as células com OS-EVs (com concentração de partículas de 1 x 106 EVs por célula) no dia 1 (24 h após a adesão celular), dia 3 (48 h após o dia 1) e dia 5 (96 h após o dia 1).
    1. Pare o tratamento OS-EV para amostras de ponto de ponto (TP) 0 no dia 1, amostras de TP 3 no dia 3 e amostras de TP 7 no dia 7 (48 h após o dia 5).
      NOTA: Outros horários, conforme os planos experimentais, também podem ser seguidos.
  4. Extrair DNA dos MSCs usando um método apropriado. Inclua amostras de controle positivas e negativas para a análise dos dados.

6. Ensaio de metilação LINE-1

  1. Projete os primers de sonda LINE-1 personalizados, como feito anteriormente por Pavicic et al.23. Para sondas de metilação, selecione três sequências contendo o local de restrição HhaI dentro da região promotora da LINHA-1. Para sondas de controle, selecione sete sequências sem o site de restrição HhaI do resto da sequência LINE-1.
    NOTA: A sequência LINE-1 está disponível no banco de dados GenBank24 (L1.2, adesão nº. AH005269.2). Use as instruções do fabricante mspa para projetar as sondas25.
  2. Diluir 70 ng de amostra de DNA em tampão TE para um volume de 5 μL.
  3. Realizar as etapas subsequentes de termociclismo e PCR, como mencionado na Tabela 1. Aqueça as amostras por 10 min a 98 °C e esfrie até 25 °C.
  4. Adicione 3 μL de mistura de hibridização de sonda a cada amostra e execute o termociclor para permitir que as sondas hibridizem ao DNA.
  5. À temperatura ambiente (RT), adicione 13 μL de mistura pós-hibridização a cada amostra. Transfira 10 μL para um segundo tubo.
  6. Coloque os dois conjuntos de tubos no termociclo e incuba a 48 °C por pelo menos 1 min.
    1. Enquanto as amostras estão em 48 °C, adicione 10 μL da mistura de ligação ao primeiro conjunto de tubos (série não digerida) e 10 μL da mistura de ligação-digestão ao segundo conjunto de tubos (série digerida). Execute o próximo programa de termociclo.
  7. Gire os tubos e, simultaneamente, coloque o termociclo a 72 °C.
  8. Adicione 5 μL de mistura de polimerase em cada tubo e coloque os tubos no termcycler. Execute o programa PCR.
  9. Enquanto o programa PCR estiver em execução, prepare uma solução de 1 mL formamide contendo 2,5 μL de padrão de tamanho. Pipette 10 μL desta solução para cada poço de uma placa óptica 96 poço (com código de barras).
  10. Após o PCR, diluir as amostras não digeridas e digeridas para 1:100 e 1:200, respectivamente, em água ultrapura. Adicione 2 μL do produto PCR diluído à placa de poço 96. Centrífuga a placa a 200 x g para 15-20 s para remover bolhas de ar.
  11. Realizar a análise fragmentada de amostras por eletroforese capilar.
    NOTA: A placa deve ser armazenada a 4 °C no escuro até a análise.

7. Análise de dados de fragmentos

  1. Abrir a eletroforese capilar resulta em um software de análise de eletropherograma.
    1. Na coluna Painel, para uma das amostras, escolha a MLPA no menu. Clique no cabeçalho painel e pressione ctrl+D para aplicar MLPA a todas as amostras.
    2. Da mesma forma, defina o método de análise para o padrão microsatélite para todas as amostras.
    3. Selecione todas as amostras e clique no botão de reprodução Verde para analisar as amostras conforme as configurações escolhidas.
    4. Selecione todas as amostras e clique no botão Gráfico para visualizar os picos da sonda.
    5. Amplie na região de pico para maior resolução dos picos individuais da sonda. Certifique-se de que todos os 10 picos correspondentes às sondas da mistura de sondaline-1 sejam rotulados. Descarte picos adicionais (<95 bp e >160 bp).
    6. Na guia Genótipos, exporte os resultados no formato de valores separados da comma (CSV).
  2. Abra o arquivo CSV em um software de análise de dados e classifique os dados em colunas.
    1. Rotular os três picos do local de metilação com base em seus tamanhos aproximados (L1-1m a 153 bp, L1-2m a 119 bp, L1-3m a 133 bp). Os sete picos restantes correspondem às sondas de controle.
      NOTA: Aqui, são utilizados valores dos picos de sonda L1-2m, que têm um tamanho de 117 bp, uma vez que essa região tem sido usada na maioria dos ensaios de metilação LINE-123.
    2. Para cada amostra (não digerida e digerida), calcule a área de pico de soma de todos os sete picos de controle. Divida a área de pico de cada sonda LINE-1 por esta soma.
    3. Para cada amostra de DNA, divida o valor da amostra digerida pelo da amostra não digerida para obter a relação dose de metilação (DM)usando a seguinte equação:
      figure-protocol-1
      Onde: DM é a relação dose de metilação, Ax é a área abaixo do pico x (por exemplo, pico L1-2m), e Actrl é a área de pico de soma de todas as sete sondas de controle.

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Resultados

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O principal objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos epigenéticos dos OS-EVs em MSCs. Os OS-EVs foram isolados das células HOS-143B usando o método diferencial padrão de centrífuga. A expressão dos marcadores EV típicos CD63, Hsp70 e TSG101 por manchas ocidentais confirmou a presença de OS-EVs. (Figura 2A). Ausência de sinal de calnexina indicou pureza do isolado OS-EV. Observou-se indicação adicional de pureza com TEM, com vesículas intactas de vários tamanhos presentes...

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Discussão

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Este estudo ilustra como o MSPA pode ser usado para detectar e quantificar o estado de metilação de um elemento genético específico. Line-1 era o foco aqui, mas as sondas podem ser projetadas para atingir uma gama de genes e sequências. Além disso, há uma lista crescente de mixes de sondas disponíveis para diferentes aplicações. MSPA é uma técnica simples e robusta para análise de metilação de DNA que não requer conversão bisulfite10. O procedimento completo da preparação da amostra até a análise ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pelo financiamento do projeto da Universidade de Helsinque (WBS490302, WBS73714112) Financiamento do Hospital Estadual da Universidade de Helsinque para pesquisa em saúde de nível universitário (Y1014SUL05, TYH22016130), Fundação Médica Finlandesa-Norueguesa e Selma e Fundo Maja-Lisa Selander (Fundação Minerva). Agradecemos a Walter Pavicic por fornecer o protocolo MSPA modificado e pelo suporte técnico relacionado. Somos gratos a Teemu Masalin (Universidade de Helsinque) por nos ajudar na produção de vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 1 mLTerumoSS+01T1para placa NTA
de 24 poçosCorning3524MSC cultura de células
3730xl Analisador de DNAApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
Tubo de centrífuga de 50 mLCorning430829
Beckman Optima LE-80K UltracentrífugaBeckman
BlueStar Prestained Protein MarkerNippon GeneticsMWP03WB: marcador de proteína
Calnexina (clone C5C9)Cell Signaling Technology2679WB, diluição 1:800
CD63 (clone H5C6)BD Biosciences556019WB, diluição 1:1000
Centrífuga 5702R Eppendorf5703000010Para meios e células condicionadas
Centrífuga 5810Eppendorf5810000010Para girar a placa de 96 poços
Tubo de centrífuga (polialômero, 14x95 mm)Beckman331374Ultracentrifugação
DMEM/F-12 + GlutaMAX médioGibco, Life Technologies31331-028Para cultura AT-MSC
Soro bovino fetalGibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ tamanho padrãoAplicado Biosystems, Life Technologies4322682para eletroforese capilar
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification Kit SigmaWGA2-10RXNpara controle negativo MSPA
Hi-Di formamidaApplied Biosystems, Life Technologies4311320para eletroforese capilar
HOS-143B linha celularATCCCRL-8303
Hsp70 (clone 5G10)BD Biosciences554243WB, diluição 1:1000
IRDye 800CW Goat anti-mouseLi-Cor926-32210WB:
secundário IRDye 800CW Goat anti-rabbitLi-Cor926-32211WB:
primers secundários de mistura de sonda LINE-1IDTSequências na Tabela 1
MicroAmp Placa de reação óptica de 96 poços com código de barrasApplied Biosystems, Life Technologies4306737também requer filme de vedação
Micro BCA Protein Assay kitThermoFisher Scientific23235medir a concentração de proteína
MiniProtean TGX 10% géisBio-Rad456-1034WB: eletroforese em gel
NanoSight LM14CMalvern Instrumentspara
NTA Membrana de nitrocelulose 0.2 µ mBio-Rad1620112WB: transferência de proteínas
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50para extração de DNA
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB: bloqueio, anticorpos
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Penicilina-estreptomicinaGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntibióticos para meio de cultura
Tubo LoBind de proteína, 0,5 mLEppendorf22431064Para armazenar Evs
REVERT Kit de Solução de Lavagem e Mancha de Proteína TotalLi-Cor926-11015WB: coloração total de proteína
Linha celular RKOATCCCRL-2577para controle positivo MSPA
Meio RPMI 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Para cultura de células HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzimaMRC-HollandSMR50
SALSA MLPA kit de reagentesMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 sonda-mixMRC-HollandP300-100R
Rotor oscilante SW-28Beckman Coulter342207Ultracentrifugação
Filtro de seringa, 0.22 µ mJet BiofilFPE-204-030filtragem estéril FBS
Tecnai 12FEI Empresaequipada com Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., EUA); para TEM
TBS, 1X comprimidosMedicago09-7500-100WB: tampão
Trans-Blot TurboBio-RadWB: transferência
TermocicladorThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021para tripsinização de células
TSG101 (clone 4A10)SigmaSAB2702167WB, diluição 1:500
TCA0096

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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