Artigo de método

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

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DOI:

10.3791/60709

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5 de junho de 2020

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1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Department of Cancer Research, Oncode Institute, Hubrecht Institute-KNAW Utrecht, 3Cancer Genomics Center (CGC), 4Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and University Medical Center (UMC) Utrecht

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resumo

A tecnologia organoide, 3D in vitro de tecido em miniatura, abriu uma nova janela experimental para processos celulares que regem o desenvolvimento e a função de órgãos, bem comodoenças. A microscopia de fluorescência tem desempenhado um papel importante na caracterização de sua composição celular em detalhes e demonstrando sua semelhança com o tecido de onde se originam. Neste artigo, apresentamos um protocolo abrangente para imagens 3D de alta resolução de organoides inteiros sobre rotulagem imunofluorescente. Este método é amplamente aplicável para imagens de organoides diferentes em origem, tamanho e forma. Até agora, aplicamos o método a organoides de vias aéreas, cólon, rim e fígado derivados de tecido humano saudável, bem como organoides tumorais de mama humanos e organoides de glândulas mamárias de camundongos. Utilizamos um agente de compensação óptica, FUnGI, que permite a aquisição de organoides 3D inteiros com a oportunidade de quantificação unicelular de marcadores. Este protocolo de três dias, desde a colheita organoide até a análise de imagens, é otimizado para imagens 3D usando microscopia confocal.

Introdução

O avanço de novos métodos culturais, como a tecnologia organoide, possibilitou a cultura dos órgãos em um prato1. Organoides crescem em estruturas tridimensionais (3D) que ressemble seu tecido de origem à medida que preservam traços fenotípicos e funcionais. Os organoides são agora fundamentais para abordar questões biológicas fundamentais2, modelagem de doenças incluindo câncer3, e desenvolver estratégias de tratamento personalizadas4,,5,,6,7. Desde o primeiro protocolo de geração de organoides derivados de células-tronco adultas intestinais8,a tecnologia organoide se estendeu para incluir uma ampla gama de tecidos saudáveis e cancerígenos derivados de órgãos incluindo próstata9,cérebro10,fígado1 1,12, estômago13, peito14,15, endométrio16, glândula salivar17, paladar18, pâncreas19e rim20.

O desenvolvimento de organoides concordou com o surgimento de novas técnicas de microscopia volumosa que podem visualizar a arquitetura de todo o tecido de montagem em 3D21,22,,23,24. A imagem 3D é superior à imagem tradicional da seção de tecido 2D na visualização da complexa organização de amostras biológicas. As informações 3D provam ser essenciais para a compreensão da composição celular, forma celular, decisões de destino celular e interações célula-células de amostras biológicas intactas. Técnicas de seção óptica não destrutivas, como microscopia de escaneamento a laser confocal ou multifótons (CLSM e MLSM) e microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM), agora permitem a visualização combinada de ambos os detalhes finos, bem como a arquitetura geral do tecido, dentro de uma única amostra biológica. Essa poderosa abordagem de imagem oferece a oportunidade de estudar a complexidade estrutural que pode ser modelada com organoides25 e mapear a distribuição espacial, a identidade fenotípica e o estado celular de todas as células individuais que compõem essas estruturas 3D.

Recentemente publicamos um protocolo detalhado para imagens 3D de alta resolução de organoides fixos e limpos26. Este protocolo é especificamente projetado e otimizado para o processamento de estruturas organoides delicadas, em oposição a metodologias para grandes tecidos intactos como DISCO27,,28, CUBIC29,,30,,31e CLARITY32,33. Como tal, este método é geralmente aplicável a uma grande variedade de organoides diferentes em origem, tamanho e forma e conteúdo celular. Além disso, em comparação com outros protocolos de imagem volumosas que muitas vezes requerem tempo e esforço consideráveis, nosso protocolo é pouco exigente e pode ser concluído dentro de 3 dias. Aplicamos nosso protocolo de imagem 3D para visualizar a arquitetura e a composição celular de sistemas organoides recém-desenvolvidos derivados de vários tecidos, incluindo as vias aéreas humanas34,rim20,fígado11e organoides de câncer de mama humano15. Em combinação com o rastreamento de linhagem fluorescente multicolorida, este método também tem sido usado para revelar a biopotência das células basais nos organoides mamários do rato14.

Aqui, refinamos o protocolo introduzindo o agente de compensação nãotóxico FUnGI35. A limpeza FUnGI é alcançada em uma única etapa de incubação, é mais fácil de montar devido à sua viscosidade, e preserva melhor a fluorescência durante o armazenamento. Além disso, introduzimos sulfato de dodecyl de sódio (SDS) no tampão de lavagem para melhorar as manchas nucleares, bem como um método de montagem à base de silicone para fácil preparação de slides antes da microscopia. A Figura 1 fornece a visão geral gráfica do protocolo(Figura 1A) e exemplos de organoides com imagens 3D(Figura 1B-D). Em suma, os organoides são recuperados de sua matriz 3D, fixa e imunolabeled, opticamente limpa, imaged usando microscopia confocal e, em seguida, 3D renderizada com software de visualização.

Protocolo

O uso de organoides derivados de camundongos condiz com as normas regulamentares e foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Walter e Eliza Hall (WEHI). Todas as amostras organoides humanas foram recuperadas de biobancos através da Tecnologia Organoide Hubrecht (HUB, www.hub4organoids.nl). As autorizações foram obtidas pelo Comitê de Ética Médica da UMC Utrecht (METC UMCU) a pedido do HUB, a fim de garantir o cumprimento da Lei de Pesquisa Médica Holandesa envolvendo sujeitos humanos e o consentimento informado foi obtido dos doadores quando apropriado.

1. Preparação de reagentes

  1. Para preparar 4% (p/v) paraformaldeído (PFA), aqueça 400 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a pouco menos de 60 °C em um banho de água. Adicione 20 g de pó PFA e dissolva usando um agitador.
    1. Em seguida, adicione algumas gotas de 10 M NaOH. Deixe esfriar no gelo e adicione algumas gotas de 10 M HCl para ajustar o pH para 7,4. Cubra com PBS a 500 mL e aliquot (loja a -20 °C por até 2 meses).
      NOTA: Não aqueça acima de 60 °C para evitar a degradação do PFA. Tempo de preparação = 4h.
  2. Para preparar o PBS com Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), adicione 1 mL de Tween-20 a 1 L de PBS (loja a 4 °C por até 4 semanas).
    NOTA: Tempo de preparação = 10 min.
  3. Para preparar 100 mL de ácido edenediaminetetraacético de 0,5 M (EDTA), adicione 18,6 g de EDTA e 2,5 g de NaOH a 80 mL de dH2O. Ajuste o pH para 8 com 1 M NaOH e preencha a 100 mL com dH2O.
  4. Para preparar 500 mL de 1 M Tris, dissolva 60,55 g de Tris com 42 mL de concentrado (36-38%) HCl em 300 mL de dH2O. Ajuste o pH para 8 e encha para 500 mL.
  5. Para preparar o tampão de lavagem organoide (OWB), adicione 1 mL de Triton X-100, 2 mL de 10% (w/v) SDS e 2 g de albumina de soro bovino (BSA) a 1 L de PBS (loja a 4 °C até 2 semanas).
    NOTA: Tempo de preparação = 10 min.
  6. Para fazer 220 mL de FUnGI, misture 110 mL de glicerol com 20 mL de dH2O, 2,2 mL de tampão Tris (1 M, pH 8.0) e 440 μL de EDTA (0,5 M). Adicione 50 g de frutose e misture à temperatura ambiente (RT) no escuro até dissolver. Quando estiver claro, adicione 49 g de frutose e misture até dissolver. Em seguida, adicione 33,1 g de ureia e misture até dissolver (armazene a 4 °C no escuro).
    NOTA: Não aqueça como a frutose carameliza em temperaturas mais altas. FUnGI consiste em 50% (v/v) glicerol, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM de base tris, 1,1 mM EDTA, 2,5 M de frutose e 2,5 M de urea. Tempo de preparação = 1 dia.
  7. Para preparar o PBS-BSA (1% c/v), dissolva 1 g de BSA em 100 mL de PBS (loja a 4 °C até 2 semanas).
    NOTA: Tempo de preparação = 10 min.

2. Recuperação organoide

NOTA: As seguintes etapas aplicam-se aos organoides cultivados no extrato de membrana do porão (BME) que foram cultivados em uma placa de 24 poços com um tamanho de 100-500 μm .

  1. Aspire o meio de cultura e lave 1x com PBS gelado. Evite interromper a matriz 3D.
  2. Coloque a placa no gelo e adicione 1 mL de solução de recuperação de célulasgeladas (Tabela de Materiais) a cada poço. Incubar 30-60 min a 4 °C em um agitador horizontal (40 rpm).
    NOTA: As gotículas da matriz 3D devem ser completamente dissolvidas.
  3. Cubra uma ponta de pipeta de 1 mL com BSA mergulhando em 1% PBS-BSA e pipetando para cima e para baixo 2x. Este revestimento evitará que os organoides grudem na ponta. Para revestir o lado interno de um tubo cônico de 15 mL, encha com 5 mL de 1% PBS-BSA, inverta 2−3x e descarte o PBS-BSA.
    NOTA: Este revestimento é necessário para todos os materiais de consumo plástico até a fixação (etapa 3.3).
  4. Com uma ponta revestida, resuspenque suavemente o conteúdo do poço 5-10x e transfira os organoides para tubos revestidos de 15 mL. Organoides de diferentes poços com a mesma identidade podem ser agrupados no mesmo tubo.
  5. Adicione 1 mL de 1% pbs-BSA ao frio de cada cultura para enxaguar e coletar todos os organoides.
  6. Adicione PBS frio a 10 mL e gire para baixo por 3 min a 70 x g e 4 °C para obter uma pelota apertada sem uma camada visível de matriz 3D. Remova cuidadosamente o supernatante.

3. Fixação e bloqueio

  1. Ressuspenque cuidadosamente os organoides em 1 mL de PFA gelada usando uma ponta revestida de 1 mL.
  2. Fixar a 4 °C por 45 min. Levemente resuspenque os organoides na metade do tempo de fixação usando uma ponta de 1 mL revestida para garantir a fixação uniforme entre todos os organoides.
  3. Adicione 10 mL de PBT gelado ao tubo, misture suavemente invertendo o tubo, incubar por 10 minutos e girar a 70 x g,ambos a 4 °C.
    NOTA: A partir deste passo o revestimento de pontas geralmente não é necessário, pois a maioria dos tipos organoides não grudam na ponta após a fixação. No entanto, alguns organoides podem exigir plásticos revestidos mesmo após a fixação.
  4. Bloqueie os organoides reutilizando a pelota em OWB gelado (pelo menos 200 μL de OWB por poço) e transfira os organoides para uma placa de suspensão de 24 poços.
    NOTA: Organoides de uma grande pelota podem ser divididos sobre vários poços para realizar diferentes manchas.
  5. Incubar a 4 °C por pelo menos 15 min.

4. Imunolabeling

  1. Pipeta 200 μL de OWB em um poço vazio para servir como um poço de referência.
    NOTA: O imunolabelamento também pode ser realizado em placas de 48 ou 96 poços para reduzir o uso de anticorpos. No entanto, o usuário deve estar ciente de que tanto o desempenho de coloração quanto de lavagem podem ser reduzidos devido ao volume menor.
  2. Permita que os organoides se instalem na parte inferior da placa.
    NOTA: Isso pode ser verificado usando um estereómico e é facilitado usando um fundo escuro.
  3. Incline a placa 45° e remova o OWB deixando os organoides em 200 μL de OWB (use a referência bem para estimar 200 μL).
  4. Adicione 200 μL de OWB com anticorpos primários 2x concentrados (por exemplo, E-cadherin [1:400] e Ki67 [1:200] para resultados na Figura 1; queratina 5 [1:500], queratina 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], e Ki67 [1:200] para resultados na Figura 2) e incubam durante a noite a 4 °C enquanto balançam suavemente/tremulam (40 rpm no agitador horizontal).
  5. No dia seguinte, adicione 1 mL de OWB.
  6. Deixe os organoides se estabelecerem na parte inferior da placa por 3 minutos. Remova o OWB deixando 200 μL na placa. Adicione 1 mL de OWB e lave 2h com balanço suave/agitação.
  7. Repita o passo 4.6 mais duas vezes.
  8. Deixe os organoides se estabelecerem na parte inferior da placa por 3 minutos. Remova o OWB deixando 200 μL no poço.
  9. Adicione 200 μL de OWB com anticorpos secundários, anticorpos conjugados e corantes 2x concentrados (por exemplo, DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], fhalloidin-AF647 [1:100] para resultados na Figura 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], rabbit-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], fhalloidin-AF647 [1:100] para resultados na Figura 2; DAPI [1:1000], fhalloidin-AF647 [1:100] para resultados na Figura 3) e incubar durante a noite a 4 °C enquanto balança suavemente/treme.
  10. No dia seguinte, repita os passos 4.5-4.7.
  11. Transfira os organoides para um tubo de 1,5 mL e gire a 70 x g por 3 min.

5. Limpeza óptica de organoides

  1. Remova o máximo possível o OWB por pipetação sem interromper os organoides.
  2. Adicione FUnGI (pelo menos 50 μL, RT) usando uma ponta de 200 μL com a extremidade cortada e resuspensa suavemente para evitar a formação de bolhas. Incubar na RT por 20 minutos.
    NOTA: A limpeza óptica por FUnGI pode causar um pequeno encolhimento tecidual. Isso não afetará a morfologia geral dos organoides monocamadas e multicamadas; no entanto, organoides monocamadas em forma esférica com grandes lúmens podem entrar em colapso. O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras podem ser armazenadas a 4 °C (por pelo menos 1 semana) ou a -20 °C (por pelo menos 6 meses).

6. Preparação de slides para imagens confocal

  1. Prepare uma seringa de 10 mL com um selante de silicone(Tabela de Materiais). Conecte uma ponta de 200 μL e corte a extremidade para permitir um fluxo suave do silicone viscoso depois de pressionar a seringa. Use a seringa para desenhar um retângulo de 1 cm x 2 cm no meio de um slide.
  2. Corte a ponta de 200 μL e transfira os organoides em FUnGI para o meio do retângulo.
  3. Coloque uma mancha de cobertura por cima. Para minimizar as bolhas de ar presas, coloque o lado esquerdo da tampa primeiro, depois baixe lentamente a mancha de cobertura da esquerda para a direita até que não haja ar preso e, em seguida, solte o deslizamento de cobertura.
    NOTA: Espaçadores que são simililares em tamanho para os organoides podem ser usados para evitar que eles sejam danificados.
  4. Aplique suavemente pressão em todas as bordas da tampa para fixá-la firmemente ao selante de silicone. O slide está pronto para a imagem.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e a amostra pode ser armazenada a 4 °C (por pelo menos 1 semana) ou -20 °C (por pelo menos 6 meses).

7. Aquisição e processamento de imagens

  1. Utilizando um microscópio de varredura a laser confocal(Tabela de Materiais),imagem o slide com uma imersão multi-imersão 25x ou imersão de óleo 40x objetivo para imagens confocal.
    1. Use as seguintes configurações de aquisição para o objetivo de 25x: quadro de modo de varredura, tamanho do quadro 1024 x 1024, tamanho voxel 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, tempo de moradia do pixel <2 μs, digitalização bidirecional, média número 1, profundidade de bit 8. Para reduzir o fotobleaching, use baixa potência a laser (<5% em geral, <10% para coloração fraca).
    2. Use o modo Z-stack para definir os limites inferior e superior e definir o tamanho da etapa Z como o ideal. Ao fotografar grandes estruturas organoides ou organoides múltiplos juntos, use o modo de revestimento com 10% de sobreposição e indique a área de interesse.
      NOTA: Com essas configurações, o tamanho dos dados de um organoide típico com um diâmetro de <300 μm é <1 GB.
  2. Para conjuntos de dados de varredura de ladrilhos, costure os arquivos de imagem no software acompanhados do microscópio(Tabela de Materiais). Na seção de processamento, selecione Costurar como o método, escolha Nova Saída em parâmetros e selecione o arquivo para costurar. Pressione Pressione Para começar a costurar.
  3. Obtenha uma representação renderizada em 3D da imagem sob a guia 3D View no software de imagem (Tabela de Materiais) e, posteriormente, otimize as propriedades de brilho, contraste e renderização 3D. Exporte instantâneos RGB dos resultados como arquivos TIFF.

Resultados

Os organoides de imagem em 3D permitem a visualização da arquitetura, da composição celular, bem como dos processos intracelulares em grande detalhe. A técnica apresentada é pouco exigente e pode, presumivelmente, ser aplicada a uma ampla gama de sistemas organoides derivados de vários órgãos ou espécies hospedeiras.

A força da imagem 3D em comparação com a imagem 2D é ilustrada por imagens de organoides de glândulas mamárias de camundongos que foram gerados usando métodos recém-publicados14. A camada central desses organoides consiste em células luminosas K8/K18 positivas em forma de colunaar e a camada externa contém células basais K5-postivas alongadas(Figura 2A),que recapitulam a morfologia da glândula mamária in vivo. Esta organização polarizada é desafiadora de apreciar a partir de uma seção óptica 2D desse mesmo organoide (Figura 2B, painel médio). Outro exemplo de uma estrutura complexa que é impossível de interpretar sem informações 3D é a rede de canaliculi MRP2 positivo que facilitam a coleta do fluido biliar de organoides hepáticos humanos11 (Figura 2B). Isso exemplifica como nosso método permite a visualização de características estruturais essenciais dos organoides. Além disso, a qualidade e resolução obtidas permitem segmentação semiautomá-automatizada e análise de imagem. Assim, o número total de células e a presença de marcadores podem ser quantificados em subtipos celulares específicos em organoides inteiros. Ilustramos isso segmentando os núcleos de um organoide inteiro contendo 140 células, das quais 3 células apresentam alta positividade para o marcador de ciclo celular Ki67(Figura 2C). O canal DAPI é selecionado como canal de origem, e os segmentos são gerados com base em uma etapa de limiar de intensidade e um diâmetro de esfera de 10 μm. Objetos de toque são divididos por região crescendo a partir de pontos de sementes. Por fim, um filtro de tamanho de 10 voxels é aplicado para remover pequenos segmentos induzidos por ruído. Para cada segmento que representa um núcleo, a intensidade média do canal Ki67 é então exportada para plotagem.

Recentemente desenvolvemos o agente de compensação óptica FUnGI35,que agora integramos neste protocolo para refinar a transparência dos organoides. FUnGI é fácil de usar, pois a limpeza é prontamente alcançada por um único passo de incubação após a coloração imunofluorescente. Uma vantagem adicional do agente é a sua viscosidade, o que facilita o manuseio da amostra durante a montagem do slide. Amostras fluorescentes em FUnGI preservam sua fluorescência mesmo quando armazenadas por vários meses a -20 °C. Demonstramos que o FUnGI supera o não descoberto e a frutose-glicerol na qualidade do sinal fluorescente profundamente no organoide (Figura 3A,B), e que os organoides eliminados pelo FunGI têm intensidade de fluorescência aumentada em geral em comparação com organoides não descobertos(Figura 3C).

Em resumo, descrevemos uma técnica de imagem 3D não exigente e reprodutível para a aquisição de dados volumosos de organoides imunolabelados. Este protocolo pode ser facilmente usado para imaginar uma variedade de organoides, incluindo os de origem humana e camundongos, a partir de modelos saudáveis e de doenças. A preparação simples da amostra pode ser adaptada para facilitar microscópios fluorescentes confocal, multifótons e folha de luz para obter a resolução celular para resolução subcelular de organoides inteiros.

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Figura 1: Visão geral esquemática do protocolo de imagem 3D de alta resolução. Organoides são recuperados de sua matriz 3D. A fixação e o bloqueio são realizados antes do imunolabelamento com anticorpos e corantes. A limpeza óptica é obtida em uma única etapa usando o agente de compensação FUnGI. A renderização 3D das imagens pode ser realizada usando software de imagem. (A) Visão geral esquemática do procedimento. (B) Limpei imagem confocal 3D de um imunolaterado organoide colonico humano para F-actin e E-cadherin (E-cad) (objetivo de óleo 25x). Barra de escala = 40 μm. (C) Limpa imagem confocal de montagem total 3D. Barra de escala = 20 μm. (D) Seção óptica ampliada de um imunolaterado organoide colonico humano para F-actin, E-cadherin (E-cad) e Ki67 (objetivo de óleo de 25x). Barra de escala = 5 μm. Este número foi modificado a partir de Dekkers et al.26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens volumosas visualizam arquitetura 3D complexa. Imagens confocal representando conjuntos de dados 3D de montagem total (painel esquerdo), seções ópticas 2D (painel médio) e áreas 3D de uma região ampliada (painel direito). (A) Um organoide derivado de uma única célula basal da glândula mamária do rato ilustrando a organização 3D de células basais mamárias alongadas que circundam células luminais ou rotuladas para K8/18, K5 e F-actin (limpeza de frutose-glicerol; objetivo de óleo de 25x). As barras de escala representam 55 μm (painel esquerdo) e 40 μm (painéis médios e direito). (B) Um organoide hepático fetal humano com uma complexa rede 3D de canaliculi MRP2 positivo, rotulado para DAPI, MRP2 e F-actin (limpeza de frutose-glicerol; objetivo do óleo de 40x). As barras de escala representam 25 μm (painel esquerdo) e 8 μm (painéis médios e direito). (C) Imagem de montagem total 3D confocal de um organoide hepático fetal humano rotulado com DAPI e Ki67 (painel esquerdo) e uma imagem segmentada no canal DAPI usando software de imagem (painel médio). Barra de escala = 15 μm. Gráfico plotado representando a intensidade média ki67 em todas as células (segmentadas de DAPI) de todo o organoide (140 células) (painel direito). Este número foi modificado a partir de Dekkers et al.26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Limpeza óptica de organoides com FUnGI. (A) Imagens representativas de organoides colonicos humanos rotulados com F-actin (verde) e DAPI (cinza) e imageados sem clareira, limpos com frutose-glicerol ou limpos com FUnGI (objetivo de óleo 25x). Painel esquerdo: renderização 3D do organoide. Painel direito: seção óptica do organoide a 150 μm de profundidade. Para a condição "sem compensação", o brilho da imagem teve que ser aumentado em comparação com as condições "frutose-glicerol" e "FUnGI" para visualizar o organoide. Barra de escala = 50 μm. (B) Ajuste de regressão não linear mostrando a diminuição da intensidade do DAPI com o aumento da profundidade Z para diferentes métodos de compensação óptica. Os valores representam intensidades de células individuais detectadas pela segmentação da DAPI e são normalizados à intensidade média do DAPI dos primeiros 50 μm do organoide. Para evitar subestimar a atenuação causada por células mais brilhantes nas bordas mais profundas e estruturas brotantes, apenas as regiões centrais dos organoides foram analisadas. (C) Três organoides por condição de tamanho e profundidade semelhantes em relação ao deslizamento foram imagens usando configurações de microscópio idênticas. Os conjuntos de dados 3D completos foram segmentados em célula única segmentada no sinal DAPI para comparação. Gráfico de barras mostrando a intensidade média do DAPI com diferentes métodos de compensação em conjuntos de dados segmentados completos. Os dados são descritos como ± médias os valores são intensidades de >3800 células individuais detectadas pela segmentação DAPI. = p < 0,0001, teste de Kruskal-Wallis com teste de comparação múltipla pós-hoc de Dunn de duas laterais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para imagens 3D de organoides intactos com resolução unicelular. Para executar com sucesso este protocolo, algumas medidas críticas devem ser tomadas. Nesta seção destacamos essas etapas e fornecemos solução de problemas.

O primeiro passo crítico é a remoção da matriz 3D. A maioria dos organoides são propagados in vitro com o uso de matrizes que imitam o ambiente extracelular in vivo para melhorar a formação de estruturas 3D bem polarizadas. Fixação e posterior coloração dentro da matriz 3D é possível, mas pode ser desvantajoso para a penetração de anticorpos ou pode gerar sinal de fundo alto (dados não mostrados). A remoção eficiente das matrizes pode ser influenciada pelo tipo de matriz, pela quantidade e tamanho dos organoides e pela cultura prolongada. Portanto, a otimização pode ser necessária para diferentes condições culturais. Para organoides cultivados em Matrigel ou BME, um passo de 30-60 min na solução de recuperação de células geladas é suficiente para dissolver a matriz sem danificar os organoides. Além disso, a remoção da matriz 3D de suporte pode resultar em perda de estruturas nativas e interrupção de contatos organoides com outros tipos de células, por exemplo, quando organoides são co-cultivados com fibroblastos ou células imunes. Além disso, a fixação organoide ideal é crucial na preservação da arquitetura tecidual 3D, antigenicidade proteica e minimização da autofluorescência. Fixação por 45 min com 4% de PFA a 4 °C é normalmente suficiente para rotulagem de uma ampla gama de organoides e antígenos. No entanto, um passo de fixação mais longo, até 4h, é tipicamente mais apropriado para organoides que expressam proteínas fluorescentes de repórteres, mas exigirá otimização para diferentes fluoroforos. Os tempos de fixação inferiores a 20 min são insuficientes para rotular adequadamente f-actin usando sondas de faloideína. Outra questão comum é a perda de organoides durante o protocolo. Por isso, é importante (i) revestir cuidadosamente pontas e tubos com 1% de BSA-PBS como descrito ao manusear organoides nãofixados para evitar que grudem em plásticos, (ii) usar placas de baixa adesão ou suspensão para evitar que a amostra grude na placa, e (iii) permitir tempo suficiente para os organoides se instalarem na parte inferior da placa antes de remover cuidadosamente os buffers. Pipetting viscoso FUnGI pode introduzir bolhas. O manuseio da amostra desmatada na RT diminui a viscosidade e melhora a facilidade de uso, minimizando assim a perda de organoides. Embora a maioria dos organoides sejam fáceis de manusear, organoides císticos com lúmen aumentado têm uma alta tendência ao colapso ao fixar com 4% de PFA ou quando liberados com FUnGI. Esse efeito pode ser reduzido, mas não completamente evitado, usando um fixador diferente (por exemplo, formalina ou PFA-glutaraldeído). No entanto, isso poderia potencialmente impactar a autofluorescência, a penetração de anticorpos e a disponibilidade de epítopes. Quando organoides císticos aparecem dobrados após a clareira, é aconselhável pular a etapa de compensação e a imagem por microscopia multifótons, que é menos dificultada pela dispersão de luz. Por fim, a obtenção de toda a estrutura 3D de organoides pode ser desafiadora e requer distância mínima entre o deslizamento de cobertura e o organoide. Além disso, quando os organoides têm espaço para mover em seu agente de montagem, isso pode resultar em mudanças X e Y durante o registro de dados em profundidade Z. O uso de menos selante de silicone durante a preparação do slide pode resolver a montagem subótima entre o deslizamento de tampas e o slide do microscópio. No entanto, muito pouco silicone pode levar à compressão organoide e perda de sua estrutura 3D inerente. FUnGI melhora o manuseio para montagem de slides e estabilidade de organoides durante a imagem, devido à sua maior viscosidade.

Embora este protocolo possa ser usado para uma ampla gama de aplicações para estudar em conteúdo celular profundo e arquitetura 3D de organoides intactos, certas limitações devem ser consideradas. Essa metodologia é bastante de baixa produtividade e demorada. De fato, os usuários devem ter em mente que a imagem de grandes organoides intactos em 3D requer tanto a aquisição de ladrilhos quanto a aquisição de amostras em Z, levando a tempos de aquisição prolongados. Imagens mais rápidas poderiam ser obtidas usando ativos de microscópio, incluindo scanner de disco ressonante ou giratório, ou pela tecnologia de microscópio de folha de luz26. Outra consideração é que os marcadores podem ser expressos heterogeneamente entre organoides diferentes da mesma amostra. Portanto, múltiplos organoides devem ser adquiridos para melhor capturar essa heterogeneidade organoide na cultura. Por fim, embora o procedimento completo de laboratório molhado seja simples, o pós-processamento de dados requer habilidades em software de análise de imagem para visualização e quantificação 3D, bem como estatísticas para mineração de todas as informações presentes no conjunto de dados.

Na última década, o campo da imagem de volume avançou muito, devido tanto ao desenvolvimento de uma ampla gama de agentes de compensação óptica e melhorias nas tecnologias de microscopia e computacional27,,30,,31. Enquanto no passado a maioria dos estudos se concentrou em imagens de grande volume de órgãos ou tumores associados, mais recentemente foram desenvolvidos métodos para tecidos menores e mais frágeis, incluindo estruturas organoides,36,,37,,38. Recentemente publicamos um método simples e rápido para imagem de organoides de montagem integral de várias origens, tamanho e forma no nível de célula única para renderização 3D subsequente e análise de imagem26,que apresentamos aqui com algumas melhorias (por exemplo, FUnGI, montagem de silicone) e acompanhado por um protocolo de vídeo. Este método é superior à imagem convencional baseada em seção 2D na decifração de morfologia celular complexa e arquitetura tecidual(Figura 2) e fácil de implementar em laboratórios com um microscópio confocal. Com pequenas adaptações ao protocolo, as amostras podem ser compatíveis com confocal de super resolução, multifótons, bem como imagens de folha de luz, o que torna este protocolo amplamente aplicável e fornece aos usuários uma poderosa ferramenta para compreender melhor a complexidade multidimensional que pode ser modelada com organoides.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Somos muito gratos pelo apoio técnico do Centro Princesa Máxima de Oncologia Pediátrica e do Instituto Hubrecht e Zeiss pelo apoio e colaborações por imagem. Todas as imagens foram realizadas no centro de imagens Princesa Máxima. Este trabalho contou com o apoio financeiro do Centro Princesa Máxima de Oncologia Pediátrica. A JFD foi apoiada por uma Marie Curie Global Fellowship e uma bolsa VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). A ACR foi apoiada por uma subvenção inicial do Conselho Europeu (ERC).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga com trava de segurança de 1,5 mlEppendorfEP0030 120.094
Tubos de centrífuga com trava segura de 2 mlEppendorfEP0030 120.094
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichA3059
Solução de recuperação de célulasCorning354253
Microscópio confocalZeissLSM880
Software para microscópio confocal ZENZeissZEN preto/azul
Tubos cônicos 15 mlGreiner Bio-One5618-8271
Tampa de vidro #1.5 24x60mmMenzel-GlazerG418-15
Tampa de vidro #1.5 48x60mmProSciTechG425-4860
DAPIThermoFisherD3571diluição 1:1000
Dissecção EstereomicroscópioLeicaM205 FA
Fita adesiva dupla face 12,7 mm 6,35 mScotch 3M
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441x
EDTAInvitrogen15576-028
Focus ClearCelExplorerFC-101
FrutoseSigma AldrichF0127
GlicerolBoom76050771.0500
Pipetas de transferência graduadaSamco222-15
Agitador horizontalVWR444-2900
Ácido clorídrico (HCl)Ajax Firechem.265.2.5L-PL10M solução de estoque, software Imaris corrosivo
Bitplane
Lâminas de microscópio SuperfrostThermoFisher10143352borda retificada, 90 graus 26 mm ~ 76 mm
ParaformaldeídoSigma AldrichP6148-500g
Faloidina perigosa Alexa Fluor 647ThermoFisherA22287diluição 1:100-200
E-caderinaThermoFisher13-1900diluição 1:400
Ki-67BD BiosciencesB56diluição 1:200
Queratina 5BioLegend905501diluição 1:500
Queratina 8/18DSHB (Universidade de Iowa)diluição 1:200
MRP2Abcamab3373diluição 1:50
Rato Secundário IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21208diluição 1:500
Camundongo Secundário IgG (H+L) Alexa Fluor 555ThermoFisherA-31570diluição 1:500
Coelho Secundário IgG (H+L) Alexa Fluor 555ThermoFisherA-31572diluição 1:500
Selante de SiliconeGriffonS-200
Dodecil Sulfato de SódioThermoFisher28312
Pellets de hidróxido de sódio (NaOH)Merck Millipore56753010 M solução estoque,
corrosivo Placas de cultura de células em suspensãoGreiner Bio-One66210224 poços
TrisFisher Scientific11486631
Triton X-100Sigma AldrichT8532Perigoso
Tween-20Sigma AldrichP1379
UltraPure Low Melting Point (LMP) AgaroseThermoFisher16520050
UreiaSigma Aldrich51456
Estação de TrabalhoDell

Referências

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