Gastrectomia de manga em camundongos usando clipes cirúrgicos

Resumo

A prevalência de diabetes e obesidade está aumentando continuamente em todo o mundo. Os mecanismos entre diabetes, obesidade e sua mortalidade associada e co-morbidades precisam ser mais aprofundados. Aqui, apresentamos um protocolo para gastrectomia de manga (SG) em animais como um modelo pré-clínico descomplicado da cirurgia bariátrica.

Resumo

O número de pessoas com sobrepeso e obesidade está aumentando continuamente tanto nas populações adultas quanto adolescentes. Isso coincide com o aumento do fenômeno universal do diabetes tipo 2 (T2D) e outros problemas metabólicos. A cirurgia bariátrica, como a SG, é atualmente um dos tratamentos de longo prazo mais eficazes e comumente utilizados para obesidade e T2D, mas a associação entre eles ainda não é completamente explorada. Os mecanismos subjacentes aos desfechos observados após a cirurgia bariátrica em humanos podem ser investigados com base em estudos pré-clínicos em animais. O SG reduz o peso corporal, os níveis de glicose e muitos parâmetros metabólicos, e é fácil de realizar com uma baixa incidência de complicações. O objetivo deste trabalho é fornecer um método simples e um modelo pré-clínico descomplicado de cirurgia bariátrica em animais para pesquisadores.

Introdução

A prevalência de obesidade aumentou quase três vezes em todo o mundo desde 1975. Em 2016, mais de 1,9 bilhão de adultos com mais de 18 anos estavam acima do peso e mais de 650 milhões de adultos eram obesos. A prevalência de T2D na população adulta também dobrou de 4,7% para 8,5%, com o número subindo de 108 milhões para 422 milhões de adultos entre 1980 e 2014 globalmente¹. A maioria das cirurgias bariátricas resulta em perda significativa de peso, redução da gordura corporal e melhora na tolerância à glicose, resistência à insulina e controle do diabetes². Além da perda de peso e remissão do T2D, a cirurgia bariátrica produz ainda mais vantagens para a saúde, como o controle da hipertensão arterial e a menor incidência de certos tipos de obesidade relacionada ao desenvolvimento e progressão do câncer³. A cirurgia bariátrica também induz a remissão total e parcial durável do T2D, e diminui o risco de doença cardíaca coronariana grave (ACS) de dez anos e algum grau de risco cefalorraquidcular. No entanto, os mecanismos subjacentes não são completamente compreendidos⁴.

Existem vários procedimentos para cirurgia bariátrica/metabólica. Cirurgias restritivas e gastrointestinais de bypass fornecem efeitos positivos no metabolismo⁵. Dos modelos cirúrgicos bariátricos, SG e bypass gástrico Roux-en-Y modificados têm maior sucesso e menores taxas de mortalidade e demonstram modelos de cirurgia de bypass restritivos e gastrointestinais confiáveis em camundongos⁶. Embora a cirurgia de bypass gastrointestinal proporcione mais perda de peso e uma melhora significativa da tolerância à glicose e da esteatose hepática do que o procedimento restritivo a longo prazo, o SG ainda produz um bom controle dos níveis de peso corporal e glicose e é fácil de realizar com baixa incidência de complicações⁶. A proporção de SG aumentou de 30% para 54% e a cirurgia de bypass gástrico Roux-en-Y diminuiu de 52% para 32% de 2008 a 2014⁷. Atualmente, o SG laparoscópico é o procedimento bariátrico mais comumente realizado em nível nacional dentro de centros acadêmicos nos Estados Unidos⁸. Embora tenha havido muitos relatos publicados sobre os processos fisiodicosiológicos entre cirurgia bariátrica, diabetes e obesidade, precisamos de mais experimentos em animais para explorar ainda mais mecanismos desconhecidos.

Este protocolo visa produzir um método animal para investigar os mecanismos subjacentes aos desfechos vistos após a cirurgia bariátrica em humanos. O presente estudo translacional pode fornecer insights sobre o mecanismo da obesidade e do tratamento T2D do SG.

Protocolo

Todos os procedimentos para uso de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Yang-Ming e cumpriram o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. ^8ª edição, 2011". O procedimento anestésico foi realizado de acordo com a diretriz para o controle da dor, anestesia, pré-operatório e pós-operatório para os animais experimentais da Universidade Nacional Yang Ming, ICAUC-016, 2015,^1ª edição.

1. Preparação animal

1. Obtenha 20 camundongos machos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade do National Laboratory Animal Center (NLAC) que pesam em torno de 16-18 gramas. Atribua aleatoriamente esses ratos ao SG ou ao grupo de operação falso com 10 ratos cada.
2. Inicie os camundongos em chow ou uma dieta rica em gordura (ver Arquivo Suplementar) antes das cirurgias bariátricas ou falsas⁹. Produzir obesidade induzida por dieta com pelo menos 2 semanas pré-operatórias do HFD.
3. Abriga os ratos no National Yang-Ming University Laboratory Animal Center sob um ciclo claro-escuro de 12:12 com início claro às 07:00 A.M. e permite a alimentação gratuita para a comida e água de roedores padrão.
4. Restringir todos os animais da comida, mas permitir acesso gratuito à água na noite anterior à cirurgia.

2. Preparação pré-operatória geral

1. Acelere os ratos por pelo menos 6 horas antes da cirurgia. Induzir anestesia em uma câmara de indução com 5% de isoflurano e oxigênio (ambos 3-4 L/min).
   1. Verifique a profundidade da anestesia garantindo que a estimulação da pitada (micro-fórceps lisos serrilhados sem cortes) da pata traseira, da pata dianteira e do ouvido não evoca nenhum reflexo motor. Administre antibióticos (25 mg/kg cefazolin) através de injeções subcutâneas antes da operação.
2. Atribua uma determinada zona de trabalho para procedimentos cirúrgicos. Limpe a área cirúrgica e pulverize a mesa cirúrgica com 75% de solução alcoólica antes de uma operação.
3. Coloque o rato no cone do nariz e mantenha a anestesia com 2% de isoflurano (2 L/min) e oxigênio (4 L/min).
4. Para gastrectomia de manga e operação falsa, depois de confirmar a profundidade adequada da anestesia por estimulação do dedo do pé, aplique o gel de olho carbomer de 0,2% nos olhos do rato para evitar olhos secos.
5. Use uma navalha elétrica para raspar o cabelo do abdômen para o esterno. Retire e limpe o cabelo restante com um creme depilatório. Coloque e fixe o mouse sobre a mesa cirúrgica em uma posição supina.
6. Desinfete a parede abdominal do camundongo com soluções de povidona-iodo alternando com 75% de álcool para 3 aplicações.

3. Gastrectomia de manga e procedimentos falsos

1. Laparotomia mediana
   1. Use uma micro-tesoura para fazer uma incisão midline de 1-1,5 cm de comprimento no abdômen superior.
2. Externalização do estômago e intestino
   1. Realize o procedimento SG com o auxílio de um microscópio ou lupa de dissecação de ampliação, conforme necessário para evitar o sangramento imprevisível e o choque hipovolêmico.
   2. Use dois micro-fórceps serrilhados lisos curvos para mover suavemente o estômago e externalizá-lo completamente.
   3. Divida cuidadosamente o ligamento gastrosplenico que liga o estômago esquerdo ao baço usando uma sonda de ponta de algodão e eletrocauteria conforme necessário, dissecando assim o fundo gástrico do baço circundante e outros órgãos internos.

4. Isolamento estomacais e clipe

NOTA: O SG para ratos foi realizado utilizando a nova técnica de aplicador de clipes como publicado anteriormente¹⁰.

1. Estique o fundus e o pilão do estômago suavemente e lateralmente com fórceps, identifique a linha média (Figura 1 e Figura 2), e aplique cuidadosamente clipes cirúrgicos em metade do lado medial da linha média do estômago a partir da junção gastroesofágica inferiormente e o polo inferior superiormente. Grampo e exclua cerca de 75-80% do estômago, criando assim toda a manga lateral do estômago(Figura 1 e Figura 2).
2. Mova o intestino para a pele nua ao lado e cubra-o com uma gaze salina-salina e realize a hidratação intraperitoneal conforme necessário para evitar desidratação e hipotermia.
3. Ressele o estômago cortado lateralmente, remova a manga excluída do estômago com microscisores e, em seguida, esterilize a borda cortada do estômago com solução povidone-iodo.
4. Sobreaia a linha de clipe com uma sutura nãoabsorbável de monofilamento 5-0 para garantir que não haja vazamento. Nó as extremidades da sutura e ancorar nos clipes em cada extremidade.
5. Devolva o estômago e o intestino para a posição adequada na cavidade abdominal e feche o abdômen com uma sutura contínua e descontínua contínua e descontínua de 5-0 para a fáscia e parede abdominal.
6. Administre analgésicos com cetoprofeno (2-5 mg/kg) e antibióticos com cefazolina (25 mg/kg) intraperitoneally após todo o procedimento.

5. Procedimento falso de SG

1. Realize um procedimento semelhante ao descrito anteriormente com uma laparotomia de linha média, e externalize o intestino e o estômago usando cobertura de gaze salina quente molhada de 37 °C por 5 minutos.
2. Devolva o estômago e o intestino aos locais apropriados desses órgãos internos.
3. Feche a parede abdominal cuidadosamente como descrito anteriormente com 2 camadas de fechamento contínuo e descontínuo para a fáscia e pele usando suturas de monofilamento lentas ou não absorvíveis. Administre analgésicos com cetoprofeno (2-5 mg/kg) e antibióticos com cefazolina (25 mg/kg) intraperitoneally após todo o procedimento.

6. Atendimento geral pós-operatório

1. Pare isoflurane e continue com um fluxo de ar de 3-5 L/min até que o mouse esteja totalmente acordado.
2. Continue observando o rato enquanto ele recupera a mobilidade e começa a andar ao redor da gaiola.
3. Coloque o mouse em uma incubadora independente de 30 °C por 5 dias. Certifique-se de que há apenas um rato por gaiola para evitar que os ratos se feram.
4. Retorne ao acesso gratuito a um alimento diet gel (dieta de gel de alta gordura: 10% banha, 10% açúcar líquido, 57% água) por 3 dias após a cirurgia e reintroduza a dieta anterior atribuída 3 dias após a cirurgia.
5. Injete subcutâneamente ou intraperitonealmente cetoprofeno (2-5 mg/kg) e cefazolina (25 mg/kg) por 1 dia após a operação.
6. Avalie o peso corporal do camundongo semanalmente durante todo o período de estudo. Forneça cetoprofeno (2-5 mg/kg) por injeção intraperitoneal para controle da dor uma vez por dia, conforme necessário, se o animal estiver em perigo após a operação.
   NOTA: Aqui, a taxa de sobrevivência do SG foi de 90% após o período de aprendizagem.

7. Avaliação do parâmetro metabólico

1. Camundongos rápidos por 6h, e pegue amostras de sangue de linha de base (0 min). Obtenha todas as amostras de sangue da ponta da veia da cauda de camundongos em movimento livre^11,12.
2. Entregar 1 mg/g de 50% dextrose por injeção intraperitoneal para o teste de tolerância à glicose.
3. Meça a glicemia das pontas das veias traseiras de camundongos em movimento livre em 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min após a administração da glicose em amostras duplicadas usando glucometers e tiras de teste.
4. Mantenha toda a amostra de sangue (n = 10 para cada grupo) em temperatura ambiente com coagulação por 30 minutos.
5. Centrifugar a amostra de sangue a 3.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
6. Transfira o plasma para tubos separados sem perturbar coágulos sanguíneos e armazene a -80 °C.
7. Estude as amostras de plasma no final do estudo usando kits de ELISA de camundongos comerciais para hemoglobina A1c (HBA1c), glicose, colesterol e insulina de acordo com as diretrizes do fabricante.

Resultados

Os resultados da operação são mostrados na Figura 3 e Figura 4. A taxa de sobrevivência do estudo foi de 90%. Um rato morreu no grupo falso por causa da fraqueza e outro rato morreu no grupo SG no terceiro dia após a operação por razões desconhecidas. Os resultados obtidos na perda de peso (Figura 3A) após a operação (na semana 3) em camundongos alimentados com HFD foram bastante semelhantes aos observados em humanos, com uma perda ...

Discussão

A maioria dos estudos prospectivos de coorte confirmaram que o aumento do índice de massa corporal está relacionado ao aumento da mortalidade. A obesidade está associada a maior risco de diabetes, doenças cardiovasculares (DCV) e morte em ambos os sexos. Os processos patológicos específicos estabeleceram uma ligação entre diabetes, obesidade e mortalidade¹⁴. As revisões sistemáticas indicam os benefícios da cirurgia bariátrica na redução de fatores de risco para DCV com evidência de regressão de h...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,9% de solução salina normal	China Chemical & Farmacêutica Co., Ltd.
Sutura de monofilamento 5-0	Shineteh Inc. Taiwan		Ethicon
Alm	Shineteh Inc. Taiwan	ST-A072PK	UNIK
Animal	Anesthesia Step Technology	0712VAP11076	Matrx
Barraqer-Troutman fórceps	Shineteh Inc. Taiwan	ST-N309 (H-4410)	UNIK
cefazolina	Taiwan empresa farmacêutica veterana
Dieta Chow	Dietas de pesquisa Tiras de
glicose e glicosímetro	BeneCheck	BKM13-1
Kit BeneCheck HbA1c	Nível	OKEH00661
Sistema de hematologia	Fuji	FUJI DRI-CHEM 4000i	Europa
Dieta rica em gordura	Dietas de pesquisa	1810724	LabDiet
Iris Fórceps	Shineteh Inc. Taiwan	ST-1210	UNIK
Tesoura de Íris	Shineteh Inc. Taiwan	ST-S011	UNIK
Isoflurano	Panion & BF biotech INC	8547	Panion & BF
Ketoprofen	Sigma	22071154	Sigma-Aldrich
Microscópio estereofônico	MicroTech	SZ-5T	MicroTech
Clipe cirúrgico (M)	Echicon Inc., Somerville, NJ		Tamanho M,
gel Vidisic	Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH