Artigo de método

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

DOI:

10.3791/60727

⸱

16 de maio de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Resumo

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Anticorpos monoclonais são drogas multifuncionais de alta afinidade que trabalham por mecanismos independentes variáveis para eliminar células cancerígenas. Ao longo das últimas décadas, o campo de conjugados anticorpos, anticorpos bisespecíficos, receptores de antígeno quimérico (CAR) e imunoterapia contra o câncer emergiu como a área mais promissora de investigações básicas e terapêuticas. Com numerosos testes em humanos bem-sucedidos visando receptores de ponto de verificação imunológicos e células CAR-T em leucemia e melanoma em um ritmo inovador, são tempos altamente emocionantes para terapêuticas oncológicas derivadas de variações da engenharia de anticorpos. Lamentavelmente, um número significativamente grande de anticorpos e terapêutica baseada em CAR também se mostrou decepcionante em testes em humanos de cânceres sólidos devido à limitada disponibilidade de células de efeito imunológico no leito tumoral. É importante ressaltar que a distribuição inespecífica de anticorpos terapêuticos em tecidos diferentes dos tumores também contribui para a falta de eficácia clínica, toxicidade associada e falha clínica. Como a tradução fiel de estudos pré-clínicos em trilhas clínicas humanas são altamente confiadas na eficácia e estudos de segurança do xenoenxerto de tumores de camundongos, aqui destacamos um método para testar o tumor e a distribuição geral de tecidos de anticorpos terapêuticos. Isso é conseguido rotulando o anticorpo purificado proteína-A com corante fluorescente infravermelho próximo seguido de imagem viva de camundongos portadores de tumores.

Introdução

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A FDA aprovou o primeiro anticorpo monoclonal direcionado ao CD3 (OKT3, Muromonab) em 19861,2. Desde então, nos próximos vinte anos, houve uma rápida explosão no campo da engenharia de anticorpos devido ao sucesso esmagador de anticorpos contra inibidores de ponto de verificação imunológico3. Além da ativação indireta do sistema imunológico, os anticorpos estão sendo destinados a sinalizar diretamente as células cancerígenas para engajar precisamente as células efeitológicas, desencadear a citotoxicidade através do agonista do receptor da morte, bloquear a sinalização de sobrevivência d....

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo o manejo de animais e os estudos de xenoenxertos tumorais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) aqui na Universidade da Virgínia e de acordo com as normas regulamentares pertinentes

1. Expressão e purificação de anticorpos

  1. Manutenção de células CHO
    1. Cultivar células CHO em FreeStyle CHO Media complementada com suplemento de 1x glutamina disponível comercialmente a 37 °C tremendo a 130 rpm com 5% de CO2 usando frascos de Erlenmeyer longos, vidro ou descartáveis.
      NOTA: É altamente recomendável usar um frasco perplexo com tampa....

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Resultados

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Na metodologia descrita, primeiro clonamos anticorpos voltados para o receptor de folato alfa-1 (FOLR1) chamado farletuzumab, e um anticorpo bispecífico chamado BaCa consistindo de farletuzumabe e lexatumumab, juntamente com anticorpos de controle como abagovomab (sequências fornecidas no Arquivo Suplementar 1). Detalhes dos domínios de variável pesada (VH) e luz variável (VL) em clones de DNA (pVH, pVL) são mostrados na Figura 1A. Para confirmar os clones positivos, realiza.......

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Discussão

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A entrega específica do tecido seletivo e tumoral de agente terapêutico anticâncer é a chave para medir a eficácia e a segurança de uma determinada terapia-alvo13. Aqui descrevemos uma abordagem rápida e eficiente para investigar a distribuição detalhada de tecidos e tumores de anticorpos clínicos, farletuzumabe e um anticorpo BaCa não clínico. A abordagem descrita é aplicável a qualquer anticorpo recém-gerado e pode ser usada juntamente com um anticorpo clinicamente eficaz (com qualidades desejad.......

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Somos gratos ao Centro de Câncer da Universidade da Virgínia, ao Centro de Análise Biomolecular, ao Centro Avançado de Microscopia e ao Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S é um investigador de carreira em início de carreira da Academia de Câncer de Ovário (OCA-DoD). Este trabalho foi apoiado pela subvenção do NCI/NIH (R01CA233752) para J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) prêmio de financiamento nível-1 para J. T-S (BC17097) e prêmio de financiamento do Programa de Pesquisa do Câncer de Ovário (OCRP) dos EUA (OC180412) para J. T-S

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
FreeStyle CHO mediaGibco Life TechnologiesCat # 12651-014
Anti-Anti (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
Agente AntiaglomeranteGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
Seringa de Insulina BDBioSciencesCat #329420
Paquímetro IVIS SpectrumPerkinElmerCat #124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640CorningCat # 10-040-CV
Cy5 conjugado Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kitInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe ColumnGE HealthcareCat # 11-0034-93
InfusãoTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
Isoflurano, USPCovetrusCat # 11695-6777-2
Pomada Lubrificante para os OlhosRefresh Lacri-LubeCat #4089
MatrigelCorningCat # 354234
Reagente de transfecção PEIThermo FisherCat # BMS1003A
de diálise Slide-A-LyzerThermo ScientificCat # 66333
Steritop Vacuum FiltrosMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Tripsina-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
Modelos Experimentais: Linhagens celulares
Humano: OVCAR-3 Coleção deCultura Tipo AmericanoATCC HTB-161
Humano: Células CHO-KEstável transformado em nosso laboratórioATCC CCL-61
Mouse: 4T1Gentil presente do Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38Gentil presente da Dra. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBCAutenticado por perfil
Mouse: MC38 hFOLR1Gerado em nosso laboratório (Este artigo)
Modelos experimentais: Animal
Camundongos: atímico Nude Foxn1nu/Foxn1+EnvigoMúltiplas Ordens
Camundongos: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson LaboratoryPedidos Múltiplos
STR

Referências

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  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 1....

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Etiquetas

Therapeutic AntibodyAntibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionTissue DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

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