Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.
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Artigo de método
Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas de ligação de RNA e RNA (RBPs) controlam múltiplos processos biológicos. O arranjo espacial e temporal das RNAs e das RBPs fundamenta a delicada regulação desses processos. Uma estratégia chamada CLIP-seq (cross-linking e imunoprecipitação) foi desenvolvida para capturar interações proteicas endógenas-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação. Apesar do amplo uso do método CLIP-seq convencional no estudo RBP, o método CLIP é limitado pela disponibilidade de anticorpos de alta qualidade, potenciais contaminantes dos RBPs copurificados, exigência de manipulação de isótopos e perda potencial de informações durante um procedimento experimental tedioso. Aqui descrevemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq usando a purificação de tag flag-biotin tandem. Através da purificação tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todas as proteínas interativas de ligação de RNA são removidas. Assim, as RNAs interagindo indiretamente mediadas por esses RBPs copurificados também são reduzidas. Nosso método FbioCLIP-seq permite a detecção eficiente de RNAs vinculados à proteína direta sem procedimentos de transferência de SDS-PAGE e de transferência de membrana de forma livre de isótopos e sem proteínas.
Introdução
As RNAs e as proteínas de ligação de RNA (RBPs) controlam diversos processos celulares, incluindo emenda, tradução, biogênese ribossa, regulação epigenética e transição do destino celular1,2,3,4,5,6. Os mecanismos delicados desses processos dependem do arranjo espacial e temporal único das RNAs e RBPs. Portanto, um passo importante para entender a regulação do RNA no nível molecular é revelar as informações posicionais sobre os locais de vinculação de RBPs.
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Protocolo
1. Construção de linha celular
- Clone o gene de interesse em um bitão vetorial piggybac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA de interesse]-(Resistente à hisgromicina) plasmídeo que carrega um epítope FLAG-biotina13,21 para expressar uma tag FLAG-biotin fundida RBP(FBRBP).
- Cotransfecte o FBRBP expressando vetor com o vetor pBase em uma linha celular expressando a enzima BirA22.
NOTA: Neste estudo, o gene FBRBP foi transfectado em células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) carregando um vetor de expressão BirA integrado2....
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Resultados
A representação esquemática do procedimento FbioCLIP-seq é mostrada na Figura 1. Em comparação com a purificação de afinidade mediada por FLAG ou exptavidina, a purificação de tandem FLAG-biotin removeu quase todas as proteínas copurificadas, evitando a contaminação de interações proteicas indiretas-RNA(Figura 2). Os resultados representativos para FbioCLIP-seq para LIN28 e WDR43 são retratados na Figura 3 e
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Discussão
Aqui introduzimos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq, aproveitando o sistema de marcação dupla FLAG-biotin para realizar a purificação tandem de complexos de proteína-RNA. O sistema de marcação dupla FLAG-biotina tem se mostrado poderoso na identificação de interações proteína-proteína-DNA13,21. Aqui demonstramos a alta especificidade e conveniência desse sistema na identificação das RNAs interagindo com proteínas. Através da purificaçã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O apoio ao subsídio é do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630095) e do Centro de Ciências da Vida da Universidade de Tsinghua.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptídeo | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | O buffer CIP Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | está no mesmo pacote. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Kit de purificação de gel | QIAGEN | 28704 | |
| Glicogênio | Ambion | AM9510 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Coquetel inibidor de protease | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 Alta Fidelidade 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| trancriptase reversa ( SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| reagente de isolamento de RNA (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| Inibidor de RNase | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Desoxicolato de sódio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | O tampão PNK está no mesmo pacote. |
| Ligaduras de RNA T4 | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase tampão e BSA estão no mesmo pacote. |
| T4 RNA ligase2, tampão truncado | NEB | M0242S | T4 RNA ligase e 50% PEG estão no mesmo pacote. |
| Tripsina-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Ureia | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC meio de cultura | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| por LIF | ; diluição de 10.000 vezes | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Mistura de nucleosídeos (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicilina-Estreptomicina (1%) | Gibco | 15140122 | |
| strong | |||
| forte QIAGEN | 28704 |
Referências
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin....
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Reimpressões e permissões
