Method Article

Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um método de imunofluorescência e PCR quantitativo para localização e quantificação de begomovírus em tecidos de insetos. O protocolo de imunofluorescência pode ser usado para colocalizar proteínas virais e vetores. O protocolo quantitativo PCR pode ser estendido para quantificar vírus em corpos inteiros de moscas brancas e plantas infectadas por vírus.

Abstract

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Begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) são transmitidos por moscas brancas do complexo Bemisia tabaci de forma persistente e circulativa. Considerando os extensos danos causados pelas begomovírus à produção em todo o mundo, é imperativo entender a interação entre begomovírus e seu vetor whitefly. Para isso, a localização e quantificação do vírus nos tecidos vetoris é crucial. Aqui, usando o vírus do cacho de folha amarela de tomate (TYLCV) como exemplo, descrevemos um protocolo detalhado para localizar begomovírus em midguts whitefly, glândulas salivares primárias e ovários por imunofluorescência. O método baseia-se no uso de anticorpos específicos contra uma proteína de casaco de vírus, anticorpos secundários rotulados com tinta de tinta e um microscópio confocal. O protocolo também pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV em midguts whitefly, glândulas salivares primárias, hemolinsina e ovários por PCR quantitativo (qPCR). Usando primers especificamente projetados para TYLCV, os protocolos de quantificação permitem a comparação da quantidade de TYLCV em diferentes tecidos da mosca branca. O protocolo descrito é potencialmente útil para a quantificação de begomovírus no corpo de uma mosca branca e de uma planta infectada pelo vírus. Esses protocolos podem ser usados para analisar a via de circulação das begomovírus no whitefly ou como um complemento a outros métodos para estudar interações whitefly-begomovírus.

Introduction

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Nas últimas décadas, as begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) causaram sérios danos à produção de muitas culturas vegetais, fibras e ornamentais em todo o mundo1. Os begomovírus são transmitidos de forma persistente pela mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que é uma espécie complexa que contém mais de 35 espécies enigmáticas2,3. Begomovírus podem afetar direta ou indiretamente a fisiologia e o comportamento da mosca branca, como fecundidade4, longevidade4, e preferência hospedeira5,6. Além disso, a eficiência de transmissão de uma determinada espécie/cepa de begomovírus varia para diferentes espécies enigmáticas whitefly mesmo as mesmas condições experimentais7,8,9,10,indicando que há uma interação complexa entre begomovírus e moscas brancas. Para entender melhor os mecanismos subjacentes às interações whitefly-begomovírus, localização e quantificação do vírus em tecidos whitefly são essenciais.

O vírus do enrolamento da folha amarela de tomate (TYLCV) é um begomovírus que foi relatado pela primeira vez em Israel, mas hoje causa sérios danos à produção de tomate em todo o mundo11,12. Devido à sua importância econômica, é uma das begomovírus mais bem estudadas13. Como outros begomovírus monopartitanos, TYLCV é um vírus de DNA circular de uma única cadeia com um tamanho de genoma de cerca de 2.800 nucleotídeos14. Enquanto ainda estão em debate, várias linhas de evidências apoiam a replicação do TYLCV em moscas brancas15,16,17. Além disso, a interação de partículas TYLCV e proteínas whitefly foi relatada6,18,19,20. Para a transmissão do vírus, moscas brancas adquirem TYLCV alimentando-se de plantas infectadas pelo vírus, virões passam pelo canal de alimentos para chegar ao esôfago, penetrar na parede do intestino para alcançar o hemolinsina e, em seguida, translocalizar-se nas glândulas salivares primárias (PSGs). Finalmente, as viriões são espumeded com saliva ao longo do ducto salivar em phloem vegetal21. Além disso, vários estudos mostram que o TYLCV é capaz de ser transmitido transovarialmente de moscas brancas femininas para seus filhos22,23. Em outras palavras, para alcançar a transmissão produtiva, o vírus tem que superar barreiras celulares dentro da mosca branca para translocalizar de um tecido para outro. Durante o cruzamento dessas barreiras, é provável que ocorram interações entre whitefly e proteínas do vírus, provavelmente determinando a eficiência com que os vírus são transmitidos.

Imunofluorescência é uma técnica comumente utilizada para análise de distribuição de proteínas. A especificidade dos anticorpos ligados ao seu antígeno forma a base da imunofluorescência. Devido à importância econômica do TYLCV, anticorpos monoclonais contra a proteína do casaco TYLCV foram desenvolvidos, oferecendo uma maneira altamente sensível de localizar o vírus24. O PCR Quantitativo (qPCR) permite quantificação sensível e específica de ácidos nucleicos. Esta técnica é mais frequentemente baseada no uso de sonda de hidrolise (por exemplo, TaqMan) ou corante fluorescente (por exemplo, SYBR Green). Para qPCR à base de sondas de hidrólise, são necessárias sondas específicas, o que consequentemente aumenta o custo. QPCR fluorescente baseado em corante é mais simples e econômico, porque as sondas de hibridização específicas de amplicon rotuladas não são necessárias25. Até agora, vários estudos têm usado imunofluorescência e qPCR, juntamente com outros métodos para investigar as complexas interações begomovírus-whitefly. Por exemplo, Pan et al. realizaram análise spcr e imunofluorescência do vírus em tecidos whitefly e descobriram que a diferença na capacidade de transmitir o vírus de tiro encaracolado (TbCSV) entre as espécies whitefly AsiaII 1 e Oriente Médio Asia Minor 1 (MEAM1) foi devido ao vírus ser capaz de atravessar eficientemente a parede midgut da AsiaII1, mas não MEAM18. Da mesma forma, enquanto moscas brancas do Mediterrâneo (MED) podem transmitir facilmente TYLCV, eles não conseguem transmitir o vírus chinês de folha amarela de tomate (TYLCCNV). A transmissão seletiva foi investigada por meio da imunofluorescência de detecção de vírus nos PSGs, o que mostrou que o TYLCCNV não cruza facilmente os PSGs de moscas brancas MED26. A colocalização da imunofluorescência do TYLCV CP e a proteína do marcador de autofagia ATG8-II em midguts whitefly mostra que a autofagia desempenha um papel crítico na repressão da infecção de TYLCV no whitefly27.

Aqui, usando o TYLCV como exemplo, descrevemos um protocolo para a localização de begomovírus em midguts, PSGs e ovários de mosca-branca por uma técnica de imunofluorescência. A técnica inclui dissecação, fixação e incubação com anticorpos secundários de rótulos primários e de tinta. Sinais de fluorescência mostrando a localização de proteínas virais nos tecidos whitefly podem então ser detectados um microscópio confocal. Mais importante, este protocolo pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV usando qPCR à base de verde da SYBR em midguts whitefly, PSGs, hemolymph e ovários, que podem ser usados para comparar a quantidade de vírus em diferentes amostras de tecido whitefly.

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Protocol

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1. Whitefly, Vírus, Plantas e Aquisição do Vírus

  1. Moscas brancas traseiras (MEAM1) em algodão (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) em gaiolas à prova de insetos em uma estufa a 26 ± 1 °C com um ciclo claro:escuro 14:10 e 60 ± 10% umidade relativa.
  2. Executar PCR convencional com base no gene oxidase citocrocito mitocondrial whitefly I para determinar a pureza da população whitefly.
    1. Colete 20 moscas brancas adultas e transfira-as individualmente para um tubo PCR contendo 30 μL de tampão de lise (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatina, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinse Ka.
    2. Adicione 5-7 contas de cerâmica (2 mm de diâmetro) em cada tubo PCR e triture as amostras para realizar a lise tecidual.
    3. Incubatodas as amostras a 65 °C por 1h seguidas de 10 min a 100 °C, e depois centrífugas brevemente. Use este supernatante como modelo para amplificação PCR.
      NOTA: O tempo de incubação a 65 °C pode ser aumentado se necessário.
    4. Prepare a reação do PCR da seguinte forma: 1 U de polímero de DNA Taq, 2 μL de tampão de 10x (com Mg2+), 1,6 μL de mistura dNTP (2,5 mM), 0,5 μL de cada primer (10 μM cada), 2 μL de hidrotecal de mosca branca supernatante, e dupla água destilada para um volume total de 20 μL por reação. A sequência do primer dianteiro é 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' e a sequência de primer reverso é 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      NOTA: Um controle negativo onde o DNA é substituído por água livre de nucae um controle positivo com DNA whitefly MEAM1 previamente verificado deve ser incluído.
    5. Executar PCR utilizando os seguintes parâmetros de ciclismo: desnaturação inicial a 95 °C por 3 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 95 °C para 30 s, annealing a 50-55 °C para 30 s, e extensão a 72 °C para 1 min, seguido por 72 °C para 10 min.
    6. Digerir o produto amplificado com restrição enzima Taq I. Para isso, prepare a mistura de digestão com 0,1 μL (1 U) de enzima,1 μL de 10x Tampão Taq I, 1 μL de BSA, 5 μL de produto amplificado e água destilada dupla para um volume total de 10 μL. Incubar a 65 °C por 1h em um termociclo.
    7. Realizar eletroforese de gel de agarose das amostras carregando 5-7 μL de cada produto digerido e uma escada de DNA (100-2.000 bp) nos poços de um gel de agarose de 1%. Em seguida, observe os tamanhos da banda de DNA através de coloração em gel-vermelho em uma máquina de documentação de gel usando luz UV. Compare os tamanhos da banda dos produtos digeridos ao controle positivo para determinar a pureza da população whitefly.
  3. Agroinocular o clone infeccioso do TYLCV (número de adesão do GenBank AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) em 3-4 verdadeiras plantas de tomate em etapa de folha (Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
    1. Inoculado 10 mL de Luria-Bertani (LB) médio contendo kanamicina (50 μg/mL) e rifampicina (50 μg/mL) com uma única colônia. Incuba-se a 28 °C com tremor a 200 rpm até que o OD600 atinja ~1,5.
    2. Colher agrobactérias por centrífuga a 4.000 x g por 10 min. Descarte o supernatante.
    3. Resuspender pelotas em 10 mL de tampão de infiltração, consistindo de acetosyringonona de 200 μM, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido sulfonico de etano (MES) e 10 mM MgCl2. Incubar à temperatura ambiente (RT) por 1-2 h.
    4. Infiltrar-se 2-3 folhas de planta usando a mistura a partir do passo 1.3.3 com uma seringa sem agulha de 1 mL. Mantenha as plantas em uma estufa a 26 ± 1 °C.
  4. Cerca de um mês depois, realize uma inspeção visual e escolha plantas mostrando folha de cacho amarela e sintomas de acrobacias.
  5. Transfira adultos brancos não viruliferous para plantas de tomate infectadas pelo TYLCV por 48 h para aquisição de vírus.

2. Dissecção e Coleção de Midguts, Glândulas Salivares Primárias (PSG), Ovários e Hemolífado de Moscas Brancas Femininas

  1. Colete moscas brancas usando aspiração, e depois coloque-os no gelo para colocá-los em coma. Adicione 1x pbs (soro-tampão tampão tampão tampão tampão tampão tampão) em um slide de microscópio e, em seguida, coloque moscas brancas no buffer 1x PBS para dissecação um microscópio estéreo.
    1. Para a dissecção do intestino médio, quebre o abdômen da mosca branca e retire o intestino médio usando uma fina agulha de acupuntura (0,25 mm de diâmetro). Transfira o intestino médio para limpar, 1x PBS.
    2. Para a dissecação do PSG, quebre o corpo da mosca branca no tórax perto da cabeça do lado dorsal. Em seguida, insira uma agulha no tórax para consertar a mosca branca, e use outra agulha para sacudir a mosca branca até que as duas glândulas salivares sejam separadas do corpo. Em seguida, transfira os PSGs para limpar, 1x PBS.
    3. Para a dissecção do ovário, quebre completamente o abdômen da mosca branca, e use uma agulha para separar os ovários de outros tecidos. Em seguida, remova o excesso de tecidos encaneando.
    4. Para a coleção hemolímph, adicione 10 μL de 1x tampão PBS em um slide de microscópio e, em seguida, coloque uma mosca branca no buffer. Para obter o hemolímph, esfregue suavemente um buraco no abdômen usando uma fina agulha de acupuntura, e pressione ligeiramente o abdômen para liberar o hemolymph para fora no tampão. Colete 8 μL do líquido como a amostra de hemolinsina.

3. Localização de TYLCV em Whitefly Midgut, Glândulas Salivares Primárias e Ovários por Imunofluorescência

NOTA: O procedimento para localização do TYLCV nas meias é apresentado como exemplo. O método pode ser usado para PSGs e ovários.

  1. Disseque os midguts no tampão TBS (10 mM Tris-HCl, cloreto de sódio de 150 mM, pH = 7,5) conforme descrito na etapa 2.2.1. Colete 15-20 midguts whitefly, transfira-os para uma placa de petri de vidro (3,5 cm de diâmetro) e, em seguida, remova o excesso de tampão TBS.
  2. Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído para fixar as entranhas por 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, remova a solução fixa. Pipette lentamente para lavar os intestinos 3x em TBS por 2 min cada.
  3. Incubar os midguts em 1 mL de 0,5% Triton X-100 por 30 min para permeabilizar. Em seguida, remova a solução de permeabilização e lave os midguts 3x com TBST (1x TBS com 0,05% Tween 20) conforme descrito na etapa 3.2.
  4. Adicione 1 mL de 1% de BSA (albuminde soro bovino preparado em TBST) para bloquear os midguts. Execute a etapa de bloqueio na RT por 2 h e, em seguida, remova a solução de bloqueio e lave os midguts 3x no TBST.
  5. Diluir os anticorpos primários (MAb 1C4 contra proteína de casaco TYLCV) às 1:400 com TBST24 e adicionar a solução na placa de Petri para imergir as midguts. Incubar a 4 °C durante a noite no escuro. Descarte a solução primária de anticorpos e lave 3x no TBST.
  6. Diluir os anticorpos secundários (anti-mouse) às 1:400 com TBST e adicionar a solução na placa de Petri para imergir os intestinos médios. Incubar o prato por 2 h no RT no escuro. Descarte a solução secundária de anticorpos e lave as tripas 3x no TBST.
  7. Transfira os midguts para um deslizamento claro do microscópio. Aspirado o máximo de TBST do slide possível. Adicione 1 gota de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihidrocloreto) para manchar o núcleo e, em seguida, coloque o deslizamento de cobertura e vedação com esmalte. Examine um microscópio confocal.

4. Quantificação de TYLCV em Whitefly Midgut, Glândulas Salivares Primárias, Hemolymph e Ovários com qPCR

  1. Dissecem os midguts, PSGs, hemolymph e ovários em 1x PBS como descrito acima.
  2. Extrair o DNA dos intestinos médios, PSGs, hemolímph e ovários.
    1. Após a dissecação, lave os midguts, PSGs e ovários em tampão pbs limpo 2-3x.
    2. Colete 20 midguts ou 20 PSGs em 5 μL de 1x PBS e transfira-os para uma solução de lise de 25 μL. Transfira cada ovário em 5 μL de 1x PBS e depois transfira para solução de lise de 25 μL individualmente.
    3. Moer midguts, PSGs e amostras de ovários conforme descrito na etapa 1.2.2.
    4. Colete 8 μL de hemolímph com 1x PBS em um tubo PCR e, em seguida, adicione 10 μL de solução de lise. Homogeneizar.
  3. Extrair DNA de todas as amostras descritas em 1.2.3.
  4. Prepare duas misturas de mestreqpcr separadas (18 μL cada) para TYLCV e o controle interno ( geneβ-actin) da seguinte forma: 10 μL de mistura Verde SYBR, 0,8 μL de cada primer (10 μM cada) e 6,4 μL de água destilada dupla por reação. Para TYLCV, a sequência de primer para frente é 5′-GAAGCGACCAGGCGATAA-3′ e a sequência de primer reverso é 5′-GGAACATCAGGGCTCTTCGATA-3′. Para β-actin,a sequência de primer dianteiro é 5′-TCTTCCAGCCCCCCCCTCTTG-3′ e a sequência de primer reverso é 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′.
  5. Dispense 18 μL do mix mestre em frascos de tubos de tira qPCR ou uma placa de poço 96. Em seguida, adicione 2 μL das amostras de DNA em cada frasco. Realize todas as reações com pelo menos três réplicas técnicas e três réplicas biológicas.
    NOTA: Passo 4.5 deve ser realizado no gelo.
  6. Feche os tubos qPCR ou veda as 96 placas de poço com selo adesivo da placa.
  7. Centrífuga para coletar o líquido na parte inferior dos tubos qPCR ou placa de poço 96.
  8. Coloque os tubos ou placa na ciclovia térmica em tempo real e execute qPCR.
    1. Realize o qPCR utilizando os seguintes parâmetros de ciclismo: 95 °C para 30 s, seguido por 40 ciclos de 95 °C para 5 s e 60 °C para 34 s para analing e alongamento da primer, 1 ciclo de 95 °C para 15 s, terminando com uma etapa curva de fusão de 60 °C a 95 °C com um incremento de 0,5 °C por 15 s.
    2. Escolha a SYBR como o tinésico fluoroforre e desconhecido como tipo de amostra.
  9. Exportar os dados quantitativos para um formato de planilha e analisar a quantidade relativa de DNA viral pelo método 2-ΔΔCT 28.

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Results

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As moscas brancas MEAM1 do complexo B. tabaci e tylcv foram usadas como exemplo aqui para descrever os procedimentos. A visão geral dos procedimentos de imunofluorescência e quantificação viral descritos neste manuscrito é mostrada na Figura 1. A Figura 2 mostra resultados representativos da detecção de imunofluorescência da coloração TYLCV e DAPI em PSGs, midguts e ovários, indicando que o TYLCV acumulou mais nos PSGs e midguts, e menos nos ovários.

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Discussion

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Aqui descrevemos um protocolo para localização e quantificação de um begomovírus nos tecidos de seu vetor whitefly por imunofluorescência e qPCR. A dissecação representa o primeiro passo para localizar e quantificar o vírus em tecidos whitefly. O corpo de mosca branca tem cerca de 1 mm de comprimento, o que significa que os tecidos são extremamente pequenos, e é difícil dissecá-los. Além disso, há fortes conexões entre os tecidos. Por exemplo, os ovários estão fortemente conectados com os bacteriócitos, tornando-os difíc...

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo National Key Research and Development Program (Número de subvenção: 2017YFD0200600), o fundo destinado ao Sistema de Pesquisa agropecuária da China (número de subvenção: CARS-23-D07) e pela Fundação Bill & Melinda Gates (ID de Investimento OPP1149777777 ). Agradecemos ao Prof. Jian-Xiang Wu por fornecer anticorpos TYLCV CP.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldeídoMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)Abcamab104139
Albumina de soro bovino (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Sistema de detecção de PCR em tempo realBio-RAD185-5201
Microscopia confocalZeissLSM800
Dylight 549-cabra anti-ratoEarthoxE032310-02Anticorpo secundário
monoclonal anticorpo (MAb 1C4)Anticorpo primário
Fosfato tampolado com solução salina (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Microscópio estéreoZeissStemi 2000-C
TB pré-mistura verde Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
Thermocycler ThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI ciências da vida9002-93-1
Tween 20BBI ciências da vida9005-64-5

References

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