Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

Summary

Descrevemos um método de imunofluorescência e PCR quantitativo para localização e quantificação de begomovírus em tecidos de insetos. O protocolo de imunofluorescência pode ser usado para colocalizar proteínas virais e vetores. O protocolo quantitativo PCR pode ser estendido para quantificar vírus em corpos inteiros de moscas brancas e plantas infectadas por vírus.

Abstract

Begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) são transmitidos por moscas brancas do complexo Bemisia tabaci de forma persistente e circulativa. Considerando os extensos danos causados pelas begomovírus à produção em todo o mundo, é imperativo entender a interação entre begomovírus e seu vetor whitefly. Para isso, a localização e quantificação do vírus nos tecidos vetoris é crucial. Aqui, usando o vírus do cacho de folha amarela de tomate (TYLCV) como exemplo, descrevemos um protocolo detalhado para localizar begomovírus em midguts whitefly, glândulas salivares primárias e ovários por imunofluorescência. O método baseia-se no uso de anticorpos específicos contra uma proteína de casaco de vírus, anticorpos secundários rotulados com tinta de tinta e um microscópio confocal. O protocolo também pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV em midguts whitefly, glândulas salivares primárias, hemolinsina e ovários por PCR quantitativo (qPCR). Usando primers especificamente projetados para TYLCV, os protocolos de quantificação permitem a comparação da quantidade de TYLCV em diferentes tecidos da mosca branca. O protocolo descrito é potencialmente útil para a quantificação de begomovírus no corpo de uma mosca branca e de uma planta infectada pelo vírus. Esses protocolos podem ser usados para analisar a via de circulação das begomovírus no whitefly ou como um complemento a outros métodos para estudar interações whitefly-begomovírus.

Introduction

Nas últimas décadas, as begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) causaram sérios danos à produção de muitas culturas vegetais, fibras e ornamentais em todo o mundo¹. Os begomovírus são transmitidos de forma persistente pela mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que é uma espécie complexa que contém mais de 35 espécies enigmáticas^2,3. Begomovírus podem afetar direta ou indiretamente a fisiologia e o comportamento da mosca branca, como fecundidade⁴, longevidade⁴, e preferência hospede....

Protocol

1. Whitefly, Vírus, Plantas e Aquisição do Vírus

1. Moscas brancas traseiras (MEAM1) em algodão (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) em gaiolas à prova de insetos em uma estufa a 26 ± 1 °C com um ciclo claro:escuro 14:10 e 60 ± 10% umidade relativa.
2. Executar PCR convencional com base no gene oxidase citocrocito mitocondrial whitefly I para determinar a pureza da população whitefly.
   1. Colete 20 moscas brancas adultas e transfira-as individualmente para um tubo PCR contendo 30 μL de tampão de lise (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatina, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinse Ka.
   ....

Results

As moscas brancas MEAM1 do complexo B. tabaci e tylcv foram usadas como exemplo aqui para descrever os procedimentos. A visão geral dos procedimentos de imunofluorescência e quantificação viral descritos neste manuscrito é mostrada na Figura 1. A Figura 2 mostra resultados representativos da detecção de imunofluorescência da coloração TYLCV e DAPI em PSGs, midguts e ovários, indicando que o TYLCV acumulou mais nos PSGs e midguts, e menos nos ovários.

Discussion

Aqui descrevemos um protocolo para localização e quantificação de um begomovírus nos tecidos de seu vetor whitefly por imunofluorescência e qPCR. A dissecação representa o primeiro passo para localizar e quantificar o vírus em tecidos whitefly. O corpo de mosca branca tem cerca de 1 mm de comprimento, o que significa que os tecidos são extremamente pequenos, e é difícil dissecá-los. Além disso, há fortes conexões entre os tecidos. Por exemplo, os ovários estão fortemente conectados com os bacteriócitos, tornando-os difíc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldeído	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phé nylindole (DAPI)	Abcam	ab104139
Albumina de soro bovino (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Sistema de detecção de PCR em tempo real	Bio-RAD	185-5201
Microscopia confocal	Zeiss	LSM800
Dylight 549-cabra anti-rato	Earthox	E032310-02	Anticorpo secundário
monoclonal anticorpo (MAb 1C4)			Anticorpo primário
Fosfato tampolado com solução salina (PBS)	Sangon Biotech	B548119-0500
Microscópio estéreo	Zeiss	Stemi 2000-C
TB pré-mistura verde Ex Taq (Tli RNase H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR master mix
Thermocycler Thermofisher		A41182
Tissuelyzer	Shaghai jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI ciências da vida	9002-93-1
Tween 20	BBI ciências da vida	9005-64-5