Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

Luis Gomez-Castillo; Kurumi Watanabe; Huayi Jiang; Shoukai Kang; Liangcai Gu

doi:10.3791/60738

Method Article

Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

Luis Gomez-Castillo*¹ , Kurumi Watanabe*¹ , Huayi Jiang*¹ , Shoukai Kang¹ , Liangcai Gu¹

¹Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.

Abstract

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Eventos de imersão de proteínas que ocorrem apenas na presença de um ligand de molécula pequena permitem o desenvolvimento de biossensores de pequenas moléculas para a dissecação e manipulação de vias biológicas. Atualmente, apenas um número limitado de sistemas de dimerização quimicamente induzida (CID) existe e engenharia de novos com sensibilidade desejada e seletividade para ligantes específicos de pequenas moléculas continua a ser um desafio no campo da engenharia de proteínas. Nós aqui descrevemos um método de triagem de alta produtividade, combin binders-enabled seleição de CID (COMBINES-CID), para a engenharia de novo de sistemas CID aplicável a uma grande variedade de ligantes. Este método usa a seleção em duas etapas de uma biblioteca de nanobody combinatória exibida por fago para obter 1) "pastas de âncora" que primeiro se ligam a um ligand de interesse e, em seguida, 2) "pastas de imersão" que só se ligam a complexos de ligand de pasta de ancoragem. Para selecionar pastas de âncora, uma biblioteca combinatória de mais de 10⁹ nanobodies randomizados de complementaridade (CDR) é rastreada com um ligande biotinylated e os hits são validados com o ligand não rotulado pela interferometria de camada biológica (BLI). Para obter pastas de imersão, a biblioteca nanobody é rastreada com complexos de ligand escora como alvos para triagem positiva e as pastas de âncora sem limites para triagem negativa. Combines-CID é amplamente aplicável para selecionar pastas CID com outras imunoglobulina, não imunoglobulina, ou andaimes computacionalmente concebidos para criar biossensores para a detecção in vitro e in vivo de drogas, metabólitos, moléculas de sinalização, etc.

Introduction

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Os sistemas CID, nos quais duas proteínas se dinamizarapenas na presença de um ligand de molécula pequena (Figura 1),oferecem ferramentas versáteis para dissecar e manipular vias metabólicas, sinalização e outras vias biológicas^1. Eles demonstraram o potencial na atuação biológica, como a ativação de células T controladas por drogas² e a apoptose^3,^4,para melhorar a segurança e eficácia da terapia de células T adotivas. Além disso, eles fornecem uma nova metodologia para a detecção in vivo ou in vitro de alvos de pequenas moléculas. P....

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Protocol

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1. Construção da biblioteca

Use uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatório sintético com uma diversidade de ~1.23-7.14 x 10⁹, como descrito anteriormente¹⁹. Embora este protocolo não inclua a construção de bibliotecas, ele pode ser aplicado a outras bibliotecas de pasta combinatória.

2. Biotinylation do alvo ou do ligand do ligand

Biotinylate o ligand selecionado, por exemplo, CBD e tetrahidrocanabinol (THC)¹⁹, através de várias estratégias de síntese química, dependendo dos locais de biotinylação adequados de um alvo.

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Results

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Descrevemos a seleção in vitro em duas etapas e a validação de pastas de âncora e imersão, selecionando a biblioteca de nanobody combinatória com uma diversidade superior a 10⁹ usando cbd como alvo. Avaliar o enriquecimento da biopanning do phage durante os círculos sucessivos da seleção para ligações da escora e do dimerization é importante. Resultados típicos de enriquecimento após 4-6 rodadas de seleção, como mostrado na Figura 5 são uma boa indicação de que há uma alta proporç.......

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Discussion

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É fundamental escolher as concentrações corretas de bibliotecas de fagos de entrada para diferentes rodadas de biopanning. Nós normalmente começou a partir de uma biblioteca de entrada de ~ 10¹²-10¹³ partículas de fago com uma diversidade >10⁹, permitindo ~ 100-1.000 cópias de cada clone fago para ser apresentado no ensaio pull-down. Se a concentração de fagos em um ensaio vinculativo for muito alta ou baixa, a probabilidade de ligação inespecífica ou perda de clones positivos aumentará. .......

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Disclosures

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Uma patente provisória relacionada a este trabalho foi arquivada pela Universidade de Washington.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Inovação da Universidade de Washington (para a L.G.), uma doação dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (1R35GM128918 para a L.G.), e um fundo de startups da Universidade de Washington (para l.G.). H.J. foi apoiado por uma bolsa de graduação da Washington Research Foundation. K.W. foi apoiado por uma bolsa de graduação do Instituto de Design de Proteínas da Universidade de Washington.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Solução de substrato ELISA Ultra TMB de 1 etapa	Thermo Fisher Scientific	34029
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-2
Amicon Ultra-15 Unidade de filtro centrífugo (corte de 3 kDa)	Millipore	UFC900324
Ampicilina	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25
Kit de ensaio de proteína Bio-Rad II	Bio-Rad
Kit de reação padrão de biotina-proteína ligase BirA	Avidity	BirA500
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Caseína	Sigma-Aldrich	C7078-1KG
CM13 Helper phage	Antibody Design Labs	PH020L
D-(+)-Glucose monohidratado	Alfa Aesar	A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	11205D
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
	EDTA Thermo Fisher Scientific	BP120-1
Fast DNA Ladder	New England Biolabs	N3238S
FastDigest BglI	Thermo Fisher Scientific	FD0074
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28989335
HiPrep 26/10 Coluna de Dessalinização	GE Healthcare	17508701
HisTrap-FF-1ml	GE Healthcare	11000458
Imidazol	Alfa Aesar	161-0718
IPTG	Thermo Fisher Scientific	34060
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	BP906-5
M13 Anticorpo de Proteína de Revestimento Principal	Santa Cruz Biotechnology	sc-53004
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Espectrofotômetros	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Nunc 96-Well Polipropileno DeepWell Placas de armazenamento	Thermo Fisher Scientific	260251
Nunc MaxiSorp	Thermo Fisher Scientific	44-2404-21
Octeto RED96	ForteBio N	/ A
pADL-23c Phagemid Vector	Antibody Design Labs	PD0111
PEG-6000	Sigma-Aldrich	81260-1KG
Platina SuperFi DNA Polimerase	Kit	de PCR Invitrogen 12351010
PureLink	Thermo Fisher Scientific	K310001
QIAprep Spin M13 Kit	Qiagen	27704
Meio de recuperação	Lucigen	80026-1
SpectraMax Plus 384	Dispositivos moleculares	N / A
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389-1KG
Super estreptavidina (SSA) Biossensores	ForteBio	18-5057
Superdex 75 aumento 10/300 GL Coluna	GE Healthcare	28-9909-44
T4 DNA Ligase	Thermo Fisher Scientific	15224-025
TG1 Células eletrocompetentes	Lucigen	60502-1
Trietilamina	Sigma-Aldrich	471283-100mL
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Triptona	Thermo Fisher Scientific	BP9726-5
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	BP337-500
Extrato de Levedura	Thermo Fisher Scientific	BP1422-2
Zeba Coluna de Dessalinização por Rotação	Thermo Fisher Scientific	89882

5000002 de purificação

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.

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