Quantificação dos níveis de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça

Summary

Este trabalho descreve um protocolo para quantificar os níveis de etanol em um embrião de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça de métodos de exposição adequados ao processamento de embriões e análise de etanol.

Abstract

Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem um contínuo altamente variável de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol, incluindo dismorfiologias faciais e prejuízos neurológicos. Com uma patologia complexa, a FASD afeta aproximadamente 1 em cada 100 crianças nascidas nos Estados Unidos a cada ano. Devido à natureza altamente variável da FASD, os modelos animais têm se mostrado críticos em nossa compreensão mecanicista atual de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Um número crescente de laboratórios se concentrou no uso de zebrafish para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Os zebrafish produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, geneticamente tráteis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem precisamente o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em múltiplos contextos genéticos e quantifiquem o impacto da exposição embrionária do etanol por meio de técnicas de imagem ao vivo. Isso, combinado com o alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento com humanos, provou que os zebrafish são um modelo poderoso para estudar a base mecanicista da teratogenicidade do etanol. No entanto, os regimes de exposição ao etanol variaram entre diferentes estudos de zebrafish, o que confundiu a interpretação dos dados de zebrafish nesses estudos. Aqui está um protocolo para quantificar as concentrações de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça.

Introduction

Os Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem uma ampla gama de deficiências neurológicas e dismorfimias craniofaciais associadas à exposição embrionária do etanol¹. Múltiplos fatores, incluindo tempo e dosagem de exposição ao etanol e fundo genético, contribuem para a variação do FASD^2,3. Em humanos, a complexa relação dessas variáveis torna o estudo e a compreensão da etiologia do FASD desafiador. Os modelos animais têm se mostrado cruciais no desenvolvimento da nossa compreensão da base mecanicista da teratogenicidade do etanol. Uma grande variedade de sistemas de modelo....

Protocol

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram levantados e criados seguindo protocolos estabelecidos da IACUC²⁷. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade do Texas em Austin e pela Universidade de Louisville.

NOTA: A linha de zebrafish Tg (fli1:EGFP)^y1 foi utilizada neste estudo²⁸. Toda a água utilizada neste procedimento é água de osmose reversa estéril. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fazendo mídia embrionária

1. Para fazer um estoque de 20x de mídia em....

Results

Os níveis de etanol sanguíneo não podem ser determinados em zebrafish embrionário siciado precocemente, porque eles não têm um sistema circulatório totalmente formado. Para determinar o nível de concentração de etanol nos embriões de zebrafish, os níveis de etanol são medidos diretamente a partir de tecido embrionário homogeneizado. Para medir adequadamente as concentrações embrionárias de etanol, o volume embrionário deve ser levado em conta. O embrião (gema anexada) fica dentro da corção (casca de ovo) cercada por flui.......

Discussion

Como um sistema modelo de desenvolvimento, os zebrafish são idealmente adequados para estudar o impacto dos fatores ambientais no desenvolvimento. Eles produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, o que permite paradigmas precisos de tempo e dosagem em estudos de etanol. Isso, combinado com as capacidades de imagem ao vivo e a conservação genética e de desenvolvimento com humanos, faz do zebrafish um poderoso sistema modelo para estudos de teratologia. Descrito é um protocolo para medir as concentraçõ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ar			fornecido por contrato com a universidade
Balança analítica	VWR	10204-962
Amostrador automático, CP-8400	Cromatógrafo a gás	Varian
Cloreto de cálcio	VWR	97062-590
Etanol	Decon Labs	2701
Frasco para cromatógrafo gasoso com septo de politetrafluoretileno/silicone e tampa plástica 2 mL	Agilent	8010-0198	Pode reutilizar os frascos após a limpeza, mas não as tampas/septos
Cromatógrafo Gasoso, CP-3800	Varian
Helium			Fornecido por contrato para a coluna
capilar HP Innowax	da universidade Agilent	19095N-123I	30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m filme espesso
Hyrdogen			Fornecido por contrato para a universidade
Sulfato de Magnésio (Heptahidratado)	Fisher Scientific	M63-500
Tubo de microcentrífuga 1,5 mL	Fisher Scientific	2682002
Micropipeta pontas 10 μ L	Fisher Scientific	13611106
Pontas de Micropipeta 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Pontas de Micropipeta 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
placas de Petri 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Micropipeta	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipeta	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipeta	Gilson	FA10001M
Politetrafluoretileno/silicone septo e tampa de plástico	Agilent	5190-7021	Tampas de substituição/septos para frascos de cromatógrafo gasoso
Cloreto de Potássio	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato de Potássio (Dibásico)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Contas de Sílica .5 mm	Biospec Products	11079105z
Contas de Sílica 1.0 mm	Biospec Products	11079110z
Bicarbonato de Sódio	VWR	BDH9280-500G
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato de Sódio (Dibásico)	Fisher Scientific	S374-500
Conjunto de fibra de microextração em fase sólida Carboxen/Polidimetilsiloxano	Millipore Sigma	57343-U	Estação de trabalho de
cromatografia estrela	Software de cromatografia	Varian
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septos	Millipore Sigma	23154	Septos de entrada de substituição