Quantificação dos níveis de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para quantificar os níveis de etanol em um embrião de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça de métodos de exposição adequados ao processamento de embriões e análise de etanol.

Resumo

Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem um contínuo altamente variável de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol, incluindo dismorfiologias faciais e prejuízos neurológicos. Com uma patologia complexa, a FASD afeta aproximadamente 1 em cada 100 crianças nascidas nos Estados Unidos a cada ano. Devido à natureza altamente variável da FASD, os modelos animais têm se mostrado críticos em nossa compreensão mecanicista atual de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Um número crescente de laboratórios se concentrou no uso de zebrafish para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Os zebrafish produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, geneticamente tráteis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem precisamente o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em múltiplos contextos genéticos e quantifiquem o impacto da exposição embrionária do etanol por meio de técnicas de imagem ao vivo. Isso, combinado com o alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento com humanos, provou que os zebrafish são um modelo poderoso para estudar a base mecanicista da teratogenicidade do etanol. No entanto, os regimes de exposição ao etanol variaram entre diferentes estudos de zebrafish, o que confundiu a interpretação dos dados de zebrafish nesses estudos. Aqui está um protocolo para quantificar as concentrações de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça.

Introdução

Os Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem uma ampla gama de deficiências neurológicas e dismorfimias craniofaciais associadas à exposição embrionária do etanol¹. Múltiplos fatores, incluindo tempo e dosagem de exposição ao etanol e fundo genético, contribuem para a variação do FASD^2,3. Em humanos, a complexa relação dessas variáveis torna o estudo e a compreensão da etiologia do FASD desafiador. Os modelos animais têm se mostrado cruciais no desenvolvimento da nossa compreensão da base mecanicista da teratogenicidade do etanol. Uma grande variedade de sistemas de modelos animais tem sido usada para estudar múltiplos aspectos do FASD e os resultados têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em exposição em humanos⁴. Os sistemas de modelos de roedores são usados para examinar muitos aspectos do FASD, sendo os camundongos os mais comuns^5,6,7. A maior parte deste trabalho tem se concentrado em defeitos de desenvolvimento para a exposição precoce do etanol⁸, embora a exposição posterior ao etanol tenha sido demonstrada para causar anomalias de desenvolvimento também⁹. Além disso, as capacidades genéticas dos camundongos ajudaram muito em nossa capacidade de sondar os fundamentos genéticos do FASD^10,11. Esses estudos em camundongos sugerem fortemente que existem interações gene-etanol com a via sônica de ouriço, sinalização de ácido retinóico, dismutase de superóxido, óxido nítrico sintetizador I, Aldh2 e Fancd2^{8,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21}. Esses estudos mostram que os modelos animais são fundamentais para avançar em nossa compreensão da FASD e seus mecanismos subjacentes.

O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para examinar muitos aspectos da teratogênese do etanol^22,23. Devido à sua fertilização externa, alta fecundidade, tratério genético e capacidades de imagem ao vivo, os zebrafish são idealmente adequados para estudar fatores como tempo, dosagem e genética da teratogênese do etanol. O etanol pode ser administrado a embriões precisamente encenados e os embriões podem então ser imagem para examinar o impacto direto do etanol durante os processos de desenvolvimento. Este trabalho pode estar relacionado diretamente aos seres humanos, pois os programas genéticos de desenvolvimento são altamente conservados entre zebrafish e humanos e, portanto, podem ajudar a orientar os estudos humanos da FASD²⁴. Embora os zebrafish tenham sido usados para examinar a teratogênese do etanol, a falta de consenso em relatar concentrações embrionárias de etanol torna difícil a comparação com os humanos²⁵. Nos sistemas de mamíferos, os níveis de álcool no sangue correlacionam-se diretamente aos níveis de etanol tecidual²⁶. Muitos dos estudos de zebrafish tratam embriões antes da formação completa de seu sistema circulatório. Sem amostra materna para examinar, é necessário um processo para avaliar as concentrações de etanol para quantificar os níveis de etanol dentro do embrião. Aqui descrevemos um processo para quantificar as concentrações de etanol em um embrião de zebrafish em desenvolvimento usando cromatografia de gás espacial da cabeça.

Protocolo

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram levantados e criados seguindo protocolos estabelecidos da IACUC²⁷. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade do Texas em Austin e pela Universidade de Louisville.

NOTA: A linha de zebrafish Tg (fli1:EGFP)^y1 foi utilizada neste estudo²⁸. Toda a água utilizada neste procedimento é água de osmose reversa estéril. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fazendo mídia embrionária

1. Para fazer um estoque de 20x de mídia embrionária, dissolva 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl₂, 0,41 g de K₂HPO₄, 0,142 g de NA₂HPO₄, e 4,9 g de MgSO₄·7H₂O em 1 L de água. Ignore o precipitado branco que se forma; isso não afetará a mídia. Filtrar esterilizar a solução de estoque e armazenar a 4 °C.
2. Para criar a solução de mídia embrionária funcionando, dissolva 1,2 g de NaHCO₃ em 1 L de 20x estoque de mídia embrionária e adicione 19 L de água. Mantenha a solução de mídia embrionária funcionando a 28 °C.

2. Medir o volume embrionário usando o deslocamento da água

NOTA: Neste protocolo, são utilizados embriões de pós-fertilização 24h (hpf)(Figura 1). Os embriões utilizados nas medições de volume não são utilizados na análise do etanol.

1. Coloque 10 embriões e fluido extraembrionário em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL marcado em um volume de 250 μL (Figura 2A). Adicione água à linha de enchimento de 250 μL (consulte amostra com água dyed na Figura 2B).
2. Repita a etapa 2.1 para configurar recipientes para embriões que tiveram suas corions removidas.
   1. Para remover a corção, coloque os embriões em suas corions em uma placa de Petri de 100 mm com 2 mg/mL de coquetel protease em meios de embriões à temperatura ambiente (RT) por 10 min. A cada poucos minutos, gire suavemente os embriões para quebrar a corsão.
   2. Uma vez que todos os embriões estejam livres de sua corionria, remova os embriões descorionados da mídia protease coquetel/embrião e coloque em uma nova placa de Petri de 100 mm com mídia de embrião fresco para lavar os embriões. Repita esta etapa de lavagem 1 vez mais tempo (para um total de 2 lavhes). Transfira os embriões para uma placa de Petri fresca de 100 mm.
3. Usando a menor ponta possível e sem danificar os embriões, remova cuidadosamente todo o líquido de todo o ambiente usando um micropipettor p200(Figura 2C) e pese a água com uma balança com precisão <0,1 mg. Para determinar o volume da amostra de 10 embriões, subtraia o peso/volume da água (1 mL de água = 1 g de água.) removido de 250 μL. Para determinar o volume de um único embrião, divida a diferença entre 250 μL e o peso da água removida por 10.

3. Tratar embriões com etanol

1. Reúna embriões de tanques de acasalamento e coloque em uma placa de Petri padrão de 100 mm. Não conte mais do que 100 embriões por prato único de Petri e incuba a 28,5 °C.
   NOTA: Se a corção for removida (etapa 2.2), ela precisa ser removida antes de adicionar etanol.
2. Às 6 hpf, adicione 100 embriões a uma nova placa de petri padrão de 100 mm, seja com mídia embrionária ou mídia embrionária + 1% de etanol (v/v). Cubra, mas NÃO seque a placa de Petri. Coloque os embriões em uma incubadora de temperatura baixa fixada em 28,5 °C por 18 h, ou até que os embriões atinjam o ponto de tempo de desenvolvimento de 24 hpf.

4. Preparar fluxo de trabalho antes de processar os embriões para cromatografia de gás espacial da cabeça

1. Faça uma solução de 5 M NaCl na água (450 μL serão necessários por tubo de amostra) para desnaturar todas as proteínas e prevenir o metabolismo do etanol. Faça o coquetel protease (Tabela de Materiais) em uma concentração de 2 mg/mL em meios de embriões.
2. Rotular um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e um frasco de cromatógrafo de gás de 2 mL para cada amostra. Rotular frascos adicionais de cromatógrafo de gás de 2 mL para os padrões de etanol descritos abaixo, bem como ar, água e os espaços em branco de 5 M NaCl/protease.
3. Configure três micropipetres p200 dois conjuntos a 50 μL, e o terceiro conjunto para 200 μL; um micropipettor p1000 definido para 450 μL e um micropipettor p2 definido para 2 μL. Para as pipetas de vidro usadas para transferir embriões das placas de Petri para os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, passe rapidamente a ponta da pipeta através de uma chama para suavizar as bordas para não danificar os embriões ao atraí-los para a pipeta.

5. Processamento de embriões para cromatografia de gás espacial da cabeça

NOTA: Tanto os embriões em suas corions quanto os anteriormente removidos de suas corions são tratados da mesma forma para consistência no cálculo de fatores de diluição.

1. Usando os dois micropipetres p200 definidos para 50 μL, desenhe 50 μL da solução de coquetel protease em um e desenhe 50 μL de água para o segundo.
2. Usando a pipetette de vidro e o micropipettor, coloque rapidamente 10 embriões (a partir da etapa 3.2) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e feche a tampa (como descrito na Figura 2A). Repita para que todas as amostras sejam testadas, controles e embriões tratados com etanol.
3. Usando o micropipettor p200 definido para 200 μL, abra rapidamente a tampa e remova todos os meios residuais de embriões (conforme descrito na Figura 2C). Coloque rapidamente a pipeta contendo 50 μL de água no tubo e rapidamente, mas suavemente (para não danificar os embriões) adicione, em seguida, remova a água. Adicione rapidamente 50 μL da solução de coquetel protease do pipettor de espera e feche a tampa do tubo(Figura 2D).
   NOTA: Realize este processo uma amostra de cada vez.
4. Deixe a amostra sentar-se na RT por 10 min para permitir que o coquetel protease degrade a corion. Em seguida, adicione rapidamente 450 μL de 5 M NaCl e feche a tampa do tubo(Figura 2E). Vortex as amostras por 10 min. Para acelerar o processo, configure a batedeira para vórtice várias amostras ao mesmo tempo.
   NOTA: Adicione uma pequena quantidade (~100 μL) de uma mistura de tala de sílica (2 tamanhos, 0,5 mm e 1 mm) a qualquer tubo com embriões com mais de 24 hpf. Em embriões mais antigos, o notochord permanecerá intacto independentemente de quanto tempo eles são homogeneizados.
5. Depois de homogeneizar por 10 min, remova rapidamente 2 μL de supernatante embrião homogeneizado e adicione a um frasco de cromatógrafo a gás. Selar rapidamente o frasco com o boné politetrafluoroethtileno.

6. Preparando padrões de mídia e etanol

1. Para preparar os padrões de mídia, diluir a mídia por um fator de 10 com uma solução de coquetel 5 M NaCl/protease. Adicione 2 μL de cada amostra a um frasco de cromatógrafo a gás e veda com uma tampa de politetrafluoetileno.
2. Para preparar as normas do etanol, crie uma diluição serial de 100% de etanol na solução de coquetel 5 M NaCl/protease para as seguintes concentrações: 0,3125, 0,625, 1.25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 mM. Adicione 2 μL de cada padrão a um frasco de cromatógrafo a gás e veda com uma tampa de politetrafluoroethtileno.

7. Preparando o cromatógrafo de gás espacial da cabeça

NOTA: Esta configuração e protocolo podem precisar ser alterados dependendo do cromatógrafo de gás utilizado. A cromatografia de gás espacial da cabeça é usada para quantificar os níveis de etanol, não para separação.

1. Coloque o aquecedor para o amostrador automático a 58 °C e ligue. Permita que o aquecedor atinja 58 °C, e ligue as linhas de ar e gás hidrogênio alimentando o cromatógrafo gasoso (para ionização de chamas usada para quantificar o etanol).
   NOTA: O psi deve ser definido para operar adequadamente o cromatógrafo de acordo com as especificações do fabricante. Certifique-se de que a linha de hélio está ligado e definido para o psi adequado.
2. Para o septo, certifique-se de que o número de amostras injetadas não é >100. Para a fibra de injeção, certifique-se de que o número de amostras injetadas não é >500.
   NOTA: Se algum deles for maior a quantidade de injeções, elas precisarão ser alteradas antes de executar as amostras de teste.
3. Ligue o software de análise e certifique-se de que a estação de trabalho está configurada corretamente. Armazene todos os dados de acordo com os padrões de laboratório/departamento. Crie uma nova lista de amostras para que as amostras sejam executadas.
4. Inicie o método de inicialização e aguarde que o detector de ionização de chamas se estabilize antes de executar as amostras. Uma vez estável, execute o método de inicialização de software para limpar a fibra.

8. Medidas de amostra usando cromatografia de gás espacial da cabeça

1. Uma vez que o método de inicialização esteja completo, crie 1 nova linha por amostra na lista de amostras. A partir do cardápio de métodos no software de análise, carregue 436 Etanol spme corrente 2013 3min absorver 2_5min rg run. METANFETAMINA para cada amostra na lista de amostras.
   1. Preencha a lista de amostras, começando com o ar, água, 5 M NaCl/protease coquetéis em branco. Em seguida, entre nas normas em ordem, de 0,3125 a 40 mM. Siga os padrões com uma segunda rodada de ar, água e 5 m naCl/protease coquetéis em branco.
   2. Insira todas as amostras de supernatante de embriões homogeneizados para serem testadas, desde a menor até a maior concentração de etanol prevista. Termine entrando em uma terceira e última rodada do ar, água e 5 m naCl/protease coquetéis em branco.
2. Adicione os frascos de cromatógrafo a gás ao amostrador automático na ordem em que as amostras foram inseridas. Deixe as amostras aquecerem por 10 a 15 min. Inicie a amostra executada no software.
3. Depois de todas as amostras e os espaços em branco finais terem sido executados, ative o método de desligamento no software adicionando uma amostra final na lista de amostras e correndo em espera. METH. Respalda todos os dados adquiridos durante as corridas da amostra. Desligue o equipamento na seguinte ordem: aquecedor de amostragem automática, tanque de hidrogênio e, somente após a temperatura do cromatógrafo chegar a 30 °C, o tanque de ar. Deixe o tanque de hélio ligado para preservar a coluna de cera.

9. Amostra de etanol de integração máxima e análise de concentração amostral

NOTA: Todos os valores a partir de 9,3 on foram calculados em um arquivo excel que todas as equações pré-preenchidas.

1. Uma vez que o método de desligamento esteja completo, clique no cromatograma Aberto. Abra a pasta contendo os resultados. As amostras são automaticamente integradas neste programa.
2. Nos resultados, certifique-se de que os picos corretos tenham sido integrados (picos de etanol entre 2 e 2,5). Uma vez confirmadas todas as amostras, imprima ou exporte os resultados.
3. Traçar a altura máxima dos padrões de etanol em um gráfico. Calcule os valores de inclinação, Intercept Y e R² para as normas de etanol (R² deve ser >0,99).
   NOTA: Esses valores serão utilizados para determinar a concentração de etanol a partir da altura do pico da amostra.
4. Para cada amostra, subtraia a altura máxima da amostra da interceptação Y dos padrões de etanol. Divida esse valor pela inclinação das normas de etanol para obter o valor do etanol para cada amostra nos frascos gc.

5. Para calcular a concentração de etanol nos embriões, primeiro calcule o fator de diluição para cada amostra. Tome a medida de volume calculada na etapa 2.3 deste protocolo e divida-a pela medida de volume mais 500 μL. Isso representa a solução de coquetel 5 M NaCl/protease adicionada a cada amostra durante o processamento de embriões (passos 5.3 e 5.4).

6. Utilizando este fator de diluição amostral, multiplique pelo valor do etanol amostral para cada amostra. Os resultados serão na concentração de MM. Calcule as amostras de referência da mídia multiplicando o valor do etanol de mídia pelo fator de diluição de 10.

Resultados

Os níveis de etanol sanguíneo não podem ser determinados em zebrafish embrionário siciado precocemente, porque eles não têm um sistema circulatório totalmente formado. Para determinar o nível de concentração de etanol nos embriões de zebrafish, os níveis de etanol são medidos diretamente a partir de tecido embrionário homogeneizado. Para medir adequadamente as concentrações embrionárias de etanol, o volume embrionário deve ser levado em conta. O embrião (gema anexada) fica dentro da corção (casca de ovo) cercada por flui...

Discussão

Como um sistema modelo de desenvolvimento, os zebrafish são idealmente adequados para estudar o impacto dos fatores ambientais no desenvolvimento. Eles produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, o que permite paradigmas precisos de tempo e dosagem em estudos de etanol. Isso, combinado com as capacidades de imagem ao vivo e a conservação genética e de desenvolvimento com humanos, faz do zebrafish um poderoso sistema modelo para estudos de teratologia. Descrito é um protocolo para medir as concentraçõ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ar			fornecido por contrato com a universidade
Balança analítica	VWR	10204-962
Amostrador automático, CP-8400	Cromatógrafo a gás	Varian
Cloreto de cálcio	VWR	97062-590
Etanol	Decon Labs	2701
Frasco para cromatógrafo gasoso com septo de politetrafluoretileno/silicone e tampa plástica 2 mL	Agilent	8010-0198	Pode reutilizar os frascos após a limpeza, mas não as tampas/septos
Cromatógrafo Gasoso, CP-3800	Varian
Helium			Fornecido por contrato para a coluna
capilar HP Innowax	da universidade Agilent	19095N-123I	30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m filme espesso
Hyrdogen			Fornecido por contrato para a universidade
Sulfato de Magnésio (Heptahidratado)	Fisher Scientific	M63-500
Tubo de microcentrífuga 1,5 mL	Fisher Scientific	2682002
Micropipeta pontas 10 μ L	Fisher Scientific	13611106
Pontas de Micropipeta 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Pontas de Micropipeta 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
placas de Petri 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Pipetman L p1000L Micropipeta	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipeta	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipeta	Gilson	FA10001M
Politetrafluoretileno/silicone septo e tampa de plástico	Agilent	5190-7021	Tampas de substituição/septos para frascos de cromatógrafo gasoso
Cloreto de Potássio	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato de Potássio (Dibásico)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
Contas de Sílica .5 mm	Biospec Products	11079105z
Contas de Sílica 1.0 mm	Biospec Products	11079110z
Bicarbonato de Sódio	VWR	BDH9280-500G
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato de Sódio (Dibásico)	Fisher Scientific	S374-500
Conjunto de fibra de microextração em fase sólida Carboxen/Polidimetilsiloxano	Millipore Sigma	57343-U	Estação de trabalho de
cromatografia estrela	Software de cromatografia	Varian
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septos	Millipore Sigma	23154	Septos de entrada de substituição