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Artigo de método

Transplante de microbiota fecal e detecção da prevalência de bactérias revestidas com IgA no intestino

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DOI:

10.3791/60772

⸱

23 de julho de 2020

 ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Sciences, Nanjing University

Neste artigo

Resumo

Estabelecemos uma maneira eficiente de esgotar as bactérias intestinais em três dias e, posteriormente, transplantar a microbiota fecal por meio de gavagem de fluido fecal preparado a partir de conteúdo intestinal fresco ou congelado em camundongos. Também apresentamos um método otimizado para detectar a frequência de bactérias revestidas com IgA no intestino.

Resumo

A microbiota intestinal exerce papéis pleiotrópicos na saúde e na doença humana. O transplante de microbiota fecal (FMT) é um método eficaz para investigar a função biológica das bactérias intestinais como um todo ou no nível da espécie. Vários métodos FMT diferentes foram publicados. Aqui, apresentamos um protocolo FMT que esgota com sucesso a microbiota intestinal em questão de dias, seguido pelo transplante de microbiota fecal do conteúdo intestinal de doadores frescos ou congelados para camundongos convencionais. A PCR em tempo real é aplicada para testar a eficácia da depleção bacteriana. O sequenciamento do RNA ribossômico 16S (rRNA) é então aplicado para testar a abundância relativa e a identidade da microbiota intestinal em camundongos receptores. Também apresentamos um método de detecção baseado em citometria de fluxo de bactérias revestidas com imunoglobulina A (IgA) no intestino.

Introdução

Uma microbiota intestinal diversificada desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do hospedeiro. Este microbioma auxilia em vários processos fisiológicos que vão desde a digestão e absorção de nutrientes dos alimentos, defesa contra infecção de patógenos, regulação do desenvolvimento do sistema imunológico e homeostase imunológica1. A perturbação na composição microbiana intestinal tem sido associada a muitas doenças, incluindo câncer2, doenças autoimunes3, doença inflamatória intestinal4, doenças neurológicas5 e doenças metabólicas 6,7. Camundongos livres de germes (GF) são ferramentas poderosas em modelos de transplante de microbiota fecal para estudar os efeitos biológicos da microbiota8. No entanto, o ambiente de alojamento da FG é muito rigoroso e a realização do transplante de microbiota fecal (FMT) nesses camundongos é cara. Além disso, os camundongos GF têm diferentes propriedades de barreira e mucosa, que regulam a penetração bacteriana, em comparação com os camundongos convencionais9. Esses fatores limitam a ampla aplicação de camundongos GF em estudos. Uma alternativa ao uso de camundongos GF é esgotar a microbiota em camundongos convencionais usando um coquetel de antibióticos seguido de FMT. Os métodos FMT relatados anteriormente não são bem descritos e inconsistentes; portanto, é necessário estabelecer um protocolo viável, eficiente e reprodutível para realizar o TMF usando camundongos convencionais.

Várias etapas são cruciais para um FMT bem-sucedido. A eficiência do esgotamento da microbiota é o primeiro passo importante. Para a depleção de bactérias, o uso de um único antibiótico de amplo espectro (por exemplo, estreptomicina10) ou um coquetel de antibióticos (tratamento com antibióticos triplos ou quádruplos) foi relatado11,12. O tratamento com antibióticos quádruplos, incluindo ampicilina, metronidazol, neomicina e vancomicina, foi considerado o esquema mais eficaz e tem sido usado em vários estudos 13,14,15. Além do tipo de antibiótico usado, a via de administração, a dosagem e a duração do tratamento com antibióticos afetam a eficácia da depleção bacteriana. Alguns pesquisadores aplicam antibióticos na água potável para eliminar bactérias do trato gastrointestinal15. No entanto, é difícil controlar a dosagem de antibióticos que cada camundongo recebe dessa maneira. Portanto, em estudos subsequentes, os pesquisadores trataram camundongos com antibióticos por gavagem oral por 1 a 2 semanas12 para atingir uma depleção satisfatória. No entanto, o uso prolongado de antibióticos pode ser problemático, pois os próprios antibióticos podem afetar algumas doenças em modelos de roedores16. Portanto, métodos mais rápidos e eficientes para a depleção da microbiota são necessários.

A preparação do fluido fecal é outra etapa fundamental para garantir o sucesso do FMT. No trato gastrointestinal, o pH varia de 1 no estômago a 7 no intestino proximal e distal9. A microbiota no estômago é limitada devido à alta acidez e inclui Helicobacter pylori17. O intestino proximal produz ácido biliar para a circulação hepático-intestinal e contém microbiota associada à digestão de gordura, proteína e glicose. O trato intestinal distal contém bactérias anaeróbias abundantes e exibe alta diversidade microbiana18. Dada a heterogeneidade espacial da microbiota intestinal, é imperativo isolar o conteúdo intestinal de diferentes regiões do trato intestinal para a preparação do fluido fecal. Além disso, outros fatores, incluindo a natureza da amostra do doador (por exemplo, amostra fresca ou congelada), frequência e duração do transplante são cruciais ao realizar o FMT. As fezes congeladas são mais comumente usadas para colonizar camundongos convencionais com microbiota intestinal humana19. Em contraste, o FMT usando fezes frescas de doadores de animais é mais apropriado e comumente usado em modelos animais20,21. A frequência e a duração do FMT variam dependendo do projeto experimental e dos modelos. Em estudos anteriores, o FMT foi realizado diariamente ou a cada dois dias. A duração do transplante variou de 3 dias22 a 5 semanas23. Além dos fatores acima, a manutenção de um ambiente cirúrgico asséptico e o uso de instrumentos cirúrgicos esterilizados são cruciais para evitar contaminação bacteriana ambiental inesperada.

A microbiota intestinal tem o potencial de regular o acúmulo de células que expressam imunoglobulina A (IgA). IgA, um isotipo de anticorpo predominante, é fundamental para proteger o hospedeiro da infecção por meio de neutralização e exclusão. A IgA de alta afinidade é transcitada no lúmen intestinal e pode se ligar e revestir patógenos agressores. Em contraste, o revestimento com IgA pode fornecer uma vantagem de colonização para bactérias24. Em contraste com a IgA induzida por patógenos, a IgA induzida por comensal indígena tem menor afinidade e especificidade25. A proporção de bactérias intestinais revestidas com IgA é relatada como significativamente aumentada em algumas doenças25,26. Bactérias revestidas com IgA podem iniciar um ciclo de feedback positivo da produção de IgA27. Portanto, o nível relativo de bactérias revestidas com IgA pode prever a magnitude da resposta inflamatória no intestino. De fato, essa combinação pode ser detectada por citometria de fluxo28. Usando classificação baseada em IgA, Floris et al.27, Palm et al.25 e Andrew et al.29 adquiriram bactérias fecais IgA+ e IgA- de camundongos e caracterizaram a microbiota intestinal revestida específica de táxons por meio do sequenciamento de rRNA 16S.

Neste estudo, descrevemos um método otimizado para esgotar eficientemente as bactérias intestinais dominantes e colonizar camundongos convencionais com microbiota fecal fresca ou congelada isolada do conteúdo do íleo e do cólon. Também demonstramos um método baseado em citometria de fluxo para detectar bactérias que se ligam a IgA no intestino.

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Protocolo

Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os regulamentos éticos atuais para cuidados e uso de animais na China.

NOTA: Os animais foram alojados em um ambiente controlado específico livre de patógenos (FPS) sob ciclos de luz e escuridão de 12 horas a 25 °C. A comida foi irradiada antes de ser dada aos camundongos. A água potável e as gaiolas foram autoclavadas antes do uso. Camundongos C57BL/6J machos de oito semanas de idade foram usados no estudo após 1 semana de aclimatação. Eles foram divididos em vários grupos com base no desenho do experimento. Cada grupo consistia em pelo menos três camundongos.

1. Esgotamento da microbiota intestinal

  1. Preparação de coquetel antibiótico
    1. Prepare uma solução antibiótica em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) com cloridrato de vancomicina 0.5 mg/mL, metronidazol 1 mg/mL, sal de ampicilina sódica 1 mg/mL e sulfato de neomicina 1 mg/mL.
      NOTA: Armazene os antibióticos a 2–8 °C e evite a luz direta. Prepare a solução de coquetel antibiótico fresca e use imediatamente.
  2. Regime de tratamento
    1. Por 3 dias, administre por via oral 200 μL de coquetel de antibióticos preparado com uma agulha # 10 a um camundongo. Segure o mouse verticalmente com uma mão enquanto usa a outra mão para ajustar o ângulo da agulha para evitar atingir o estômago.
      NOTA: O mouse deve ser manuseado com cuidado para evitar lutas, pois danos superficiais do esôfago e do estômago podem resultar em inflamação ou morte.
    2. Adicionar antibióticos à água de bebida nas mesmas concentrações indicadas no passo 1.1.1.
    3. Três dias depois, sacrifique o camundongo por asfixia com CO2 .
    4. Dissecar o abdômen assepticamente usando instrumentos estéreis. A uma distância de 2 cm do ceco, corte um trato de 2 cm do íleo. Usando uma pinça estéril para prender uma extremidade do trato, esprema o conteúdo fresco do trato em tubos pré-pesados.
    5. Para coletar o conteúdo do ceco, corte-o ao meio com uma tesoura cirúrgica. Esprema o conteúdo de cada metade do ceco em tubos pré-pesados.
  3. Avalie a eficácia da depleção da microbiota intestinal.
    1. Pese o conteúdo intestinal isolado do íleo ou ceco de camundongos virgens e camundongos tratados com coquetel de antibióticos e extraia o DNA da microbiota fecal usando um kit de acordo com as instruções do fabricante. Determine a concentração de DNA de acordo com a fórmula:

      amostra de concentração (μg/mL) = OD260 x 50
       
    2. Construa uma curva padrão.
      1. Amplificar genes de E. coli com uma reação em cadeia da polimerase (PCR) usando primers específicos V3-V4. Predenature a 95 °C por 1 min, amplificar por 40 ciclos de 95 °C por 10 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 30 s.
      2. Construa um plasmídeo ligando o produto amplificado a um vetor TA. Clone a cultura com um kit de vetores TA de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Meça a concentração de plasmídeo (ng/μL) com base no valor OD260 , conforme descrito na etapa 1.3.1.
        NOTA: A unidade de concentração de plasmídeo é diferente da unidade de concentração de DNA.
      4. Calcular o número de cópias utilizando a seguinte fórmula, em que MW representa o peso molecular:

        cópias em 1 μL = concentração (ng/μL) x 10-9 x 6,02 x 1023/(plasmídeo MW x 660)
         
      5. Reconstituir o plasmídeo com água bidestilada até uma concentração final de 40 μg/μl. Preparar uma série de diluições de gradiente de 10x com oito fases. Construa uma curva padrão plotandoo valor CT (eixo Y) em relação a log (Copiaplasmídeo) (eixo X) após a amplificação por PCR,onde CT significa ciclo de limiar para amplificação de alvo. Extraia a equação do gráfico (neste caso, era y = -3,07x + 45,07, R2 = 0,994).
    3. Amplificar 1 μL das amostras de DNA obtidas na etapa 1.3.1 extraídas do íleo ou ceco de um grupo de controle virgens e do grupo de tratamento com coquetel antibiótico por PCR em tempo real, conforme descrito na etapa 1.3.2.1. Calcular o número de cópias em 1 μL das amostras de ADN com base na curva-padrão do passo 1.3.2.5 e, em seguida, calcular o número total de cópias utilizando a seguinte fórmula:
      Número total de cópias (por mg) nas amostras ponderadas = número de cópias × volume total de ADN/peso inicial da amostra
  4. Analise o DNA da microbiota sequenciando as regiões 16S rRNA V3 e V4.

2. Transplante de microbiota fecal

  1. Preparação de fluido fecal para amostras de fezes frescas e congeladas
    NOTA: Todos os instrumentos são embebidos em álcool 75% antes do uso para evitar contaminação bacteriana preexistente. É crucial evitar a contaminação quando o conteúdo do íleo e do cólon é coletado.
    1. Sacrifique 3–5 camundongos doadores por asfixia por CO2 .
    2. Colete o conteúdo do íleo conforme descrito na etapa 1.2.4.
    3. Para coletar o conteúdo no cólon, faça a primeira incisão perto do ânus e corte o trato superior de 2 cm. Extraia o conteúdo conforme explicado na etapa 1.2.4. Colete as amostras em 1 minuto para reduzir a exposição ao ar.
    4. Para fluido fecal congelado, colete o conteúdo do íleo ou cólon conforme descrito nas etapas 2.1.2 e 2.1.3 e congele rapidamente o conteúdo em nitrogênio líquido.
    5. Armazene as amostras em um freezer a -80 °C até que estejam prontas para uso.
  2. Junte e pese o conteúdo, adicione tubos estéreis frescos com miçangas. Para amostras congeladas, descongele os pellets fecais no gelo antes de pesar.
  3. Adicione PBS estéril no tubo e ressuspenda os grânulos fecais em PBS (1 mL de PBS / 0,2 g de grânulo fecal) usando uma agulha de seringa de 5 mL. Homogeneizar completamente o pellet fecal com grânulos e vórtice 3x por 1 min cada.
  4. Centrifugar a 800 x g durante 3 min e, em seguida, filtrar os sobrenadantes passando por um filtro de células de 70 μm. Colete o fluido fecal filtrado em um tubo estéril e use para FMT imediatamente.

3. Procedimento de transplante de microbiota fecal

  1. Administre 200 μL de fluido fecal preparado aos camundongos empobrecidos da microbiota por meio de gavagem oral a cada dois dias por 7 dias. Camundongos controle por gavagem com 200 μL de PBS estéril.
  2. Sacrifique os camundongos por asfixia com CO2 e colha o conteúdo do íleo e do cólon de acordo com as etapas 2.1.2 e 2.1.3. Armazene as amostras a -80 °C até processamento posterior.
  3. Extraia o DNA da microbiota do conteúdo do íleo e do cólon, conforme descrito na etapa 1.3.1. Verificar a composição da microbiota no intestino de camundongos transplantados por sequenciamento de rRNA 16S.

4. Medição de bactérias revestidas com IgA

  1. Preparação da amostra
    1. Coletar 50 mg de pellets fecais de camundongos doadores conforme descrito nas etapas 2.1.2 e 2.1.3 e incubar em 1 mL de PBS estéril a 4 °C por 1 h. Homogeneizar os pellets usando um batedor de contas por 5 s.
    2. Centrifugar a solução a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Coletar sobrenadante após filtração através de um filtro de 70 μm.
      NOTA: Evite centrifugação em alta velocidade.
    3. Adicione 5 μL do sobrenadante a 1 mL de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em PBS (tampão FACS). Pastilha a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
    4. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão FACS, centrifugue a 8.000 x g por 5 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante.
      NOTA: O volume usado aqui pode precisar ser otimizado. Muito do sobrenadante nesta etapa pode mascarar o sinal positivo de bactérias revestidas com IgA.
    5. Ressuspenda o pellet em 100 μL de PBS contendo 10% de soro de cabra e incube em gelo ou a 4 °C por 30 min. Adicione 1 mL de tampão FACS no tubo e centrifugue a 8.000 x g por 5 min a 4 °C para o pellet.
  2. Citometria de fluxo
    1. Ressuspenda o pellet obtido na etapa 4.1.5 com 200 μL de tampão FACS contendo anticorpo IgA de camundongo anti-biotina (1:100) e anticorpo anti-biotina conjugado com APC (1:100) e incube por 30 min a 4 ° C.
    2. Adicione 1 mL de tampão FACS no tubo e centrifugue a 8.000 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    3. Manchar o pellet da etapa 4.2.2 adicionando 200 μL de tampão FACS contendo coloração de ácido nucleico fluorescente verde (1:200) e incubar a 4 °C por 5 min.
    4. Adicione 1 mL de tampão FACS e centrifugue a 8.000 x g por 5 min a 4 °C para pellet.
    5. Ressuspenda o pellet em 250 μL de tampão FACS antes da medição.
    6. Adquira os dados usando um citômetro de fluxo e analise-os usando o software FlowJo.

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Resultados

O cronograma FMT usado neste estudo está descrito na Figura 1. Após o tratamento com o coquetel antibiótico, a eficiência da depleção da microbiota intestinal foi analisada por meio do sequenciamento da região 16S rRNA. Detectamos 196 espécies no íleo de camundongos virgens, enquanto o tratamento com antibióticos de 3 dias reduziu rapidamente as espécies bacterianas para 35 (Figura 2A). Foram detectadas oito espécies apenas em camundongos submetidos ao tratament...

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Discussão

Os antibióticos usados no procedimento de depleção têm propriedades antibacterianas diferentes. A vancomicina é específica para bactérias gram-positivas30. A doxiciclina oral pode induzir alterações significativas na composição da microbiota intestinal em camundongos C57BL/6NCrl fêmeas31. A neomicina é um antibiótico de amplo espectro que tem como alvo a maioria das bactérias residentes no intestino32. No entanto, nã...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado sob o patrocínio do projeto interdisciplinar Outstanding do West China Hospital, Sichuan University (Grant Nr: ZYJC18024) e National Natural Science Foundation of China (Grant: 81770101 e 81973540).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 5 mLSheng guang biotech5mL
70 µ filtro de células mBD biosciences352350
Sal de ampicilina sódicaAMERESCO0339
APC StreptavidinBD biosciences554067
Biotina anticorpo IgA de camundongo Biolegend407003
Albiumina de soro bovino (BSA)SigmaB2064-50G
C57BL / 6J camundongosChengdu Dashuo
CO2Xiyuan biotecnologia
E.Coil genoma DNATsingKe
Eppendorf tubosAxygenMCT150-C
Fezes de DNA rápido mini ManualQIAGEN51604
MetronidazolShyuanyeS17079-5g
Sulfato de neomicinaSIGMAN-1876
Agulha de gavagem oralYuke biotech10 #
pClone007 Kit vetorial TA simples versátilTsingKe007VS
Tampão de fosfato salino (PBS)HycloneSH30256
Precellys lysing kitPrecellysKT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIXVazymeQ411-01
SYTO BC verde Mancha de ácido nucleico fluorescenteThermo fisher scientificS34855
V338 F primerTsingKeACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primerTsingKeGGACTACHVGGGTWTCTAAT
Cloridrato de vancomicinaSigmaV2002
Equipamentos
BD FACSCalibur flow citômetroBD biosciences
Batedor de contas vortxScilogex
BIORAD CFX ConnectBIORAD
Máquina centrífugaEppendorf
Illumina MiSeqIllumina
Nanodrop máquina de medição de ácido nucleicoThermo fisher scientific
Instrumentos cirúrgicosYuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015Versão 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prisma 7
Banco de dados
Silva (SSU132) 16S rRNA banco de dados

Referências

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