Estabelecimento de Infarto Agudo de Pontina em Ratos por Estimulação Elétrica

Desde a década de 1980, o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) induzido por filamentos de silicone tem sido amplamente utilizado na pesquisa básica de derrame¹. Outros métodos (ou seja, a sutura de um ramo do MCA² e infarto focal induzido fotoquimicamente) também foram utilizados. Esses modelos têm sido denominados modelos de AVC baseados em MCA e têm contribuído muito para investigações dos mecanismos fisiodológicos subjacentes ao AVC e potenciais terapêuticos. Embora existam limitações desses modelos experimentais^3,4, esses métodos têm sido utilizados muitos laboratórios^5,6. Os modelos de avc baseados em MCA representam um derrame na circulação anterior; no entanto, poucos relatos têm investigado modelos que imitam o AVC na circulação posterior⁷.

Há diferenças significativas entre a etiologia, mecanismos, manifestação clínica e prognóstico entre os traços de circulação anterior e posterior⁸. Portanto, os resultados derivados de modelos de traçado de circulação anterior não podem ser aplicados ao curso de circulação posterior. Por exemplo, a janela de tempo de reperfusão para circulação anterior foi estendida para 6h, com uma pequena parcela de estudos estendendo-se para 24 h com base em achados de imagem⁹. No entanto, a janela de tempo para circulação posterior pode ser maior que 24 h, de acordo com relatórios anteriores¹⁰ e nossas próprias experiências clínicas. Esta janela de tempo de reperfusão alongada deve ser mais estudada e confirmada em modelos experimentais.

Em relação aos acidentes vasculares cerebrais de circulação posterior, o infarto de pontina é o subtipo mais comum, representando 7% de todos os casos isquêmicos de AVC^11,12. De acordo com a topografia do infarto, os infartos pontinos são divididos em infartos pontinos isolados e não isolados¹³. Os infartos isolados de pontina são categorizados em três tipos com base nos mecanismos subjacentes: doença arterial grande (LAD), doença do ramo da artéria basilar (BABD) e doença arterial pequena (SAD). O conhecimento dos mecanismos, manifestação e prognóstico do infarto do pontino tem sido derivado de investigações clínicas dos casos¹⁴. No entanto, um modelo de roedor imitando o infarto pontino tem sido menos investigado.

Em estudos anteriores, a lesão difusa do tronco tegmentum envolvendo os pons foi explorada⁷. Um grupo tentou criar um modelo de infarto pontino através da ligadura da artéria basilar (BA)¹⁵. Outro grupo usou uma sutura de monofilamento de nyfilament 10-0 para ligar seletivamente quatro pontos da BA proximal seletivamente¹⁶. Este modelo imita LAD, mas a maioria dos infartos pontinos resultam de BABD e SAD. Além disso, a ligadura seletiva da BA é uma cirurgia complicada e tem uma alta taxa de mortalidade.

Fornecido aqui é um protocolo detalhado para um modelo de rato fácil de executar, facilmente reproduzido e bem sucedido de infarto agudo de pontina por estimulação elétrica.

O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Com Animais da Instituição de Cuidados e Uso de Animais do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou, uma instituição credenciada pela AAALACi. Os ratos foram fornecidos pelo Centro Animal da Universidade Médica do Sul.

1. Animal

1. Use ratos adultos machos Sprague-Dawley pesando 250 ± 10 g.
2. Após o transporte, abriga os ratos por pelo menos 1 semana antes da cirurgia sob condições ambientais controladas com temperatura ambiente de 25 °C, umidade relativa de 65%, e ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.
3. Fornecer comida e água ad libitum.

2. Estabelecimento de infarto nos pons

1. Pesar os ratos antes da cirurgia e avaliar o desempenho neurológico de acordo com os testes comportamentais descritos abaixo (seção 3).
2. Pré-aqueça a almofada de aquecimento imediatamente antes da anestesia.
3. Coloque a broca do crânio no suporte do quadro estereotaxista.
4. Injete intraperitoneally os ratos com 50 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina. Verifique se há falta de resposta do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo.
5. Coloque o rato no quadro estereotaxico em posição propensa. Posicione as barras de ouvido acima do canal auditivo para fixar a cabeça. Certifique-se de que o crânio é mantido horizontalmente para evitar qualquer distorção da injeção.
6. Mantenha a anestesia por isoflurane (100% oxigênio, 2,5% isoflurane) através de um acessório de cone de nariz estereotaxico para ratos com portas de entrada e saída. Mantenha a temperatura a 37 °C usando uma almofada de aquecimento e monitore a temperatura durante todo o procedimento.
7. Use pomada ocular para evitar a secagem da córnea. Use fórceps para apertar ligeiramente as patas para garantir que não haja resposta à dor.
8. Raspe o cabelo do crânio com uma micro-máquina de barbear. Aplique o esfoliante cirúrgico de clorexidina de forma circular, começando no local da incisão cirúrgica e girando para fora.
9. Faça uma incisão de 3 cm de linha média com um bisturi da linha do canthus lateral bilateral a 0,5 cm atrás da fontanelle posterior, que deve ser marcada por uma caneta marcadora cirúrgica.
10. Use um cotonete para remover um sangue.
11. Coloque um pedaço de fita cirúrgica colocada em cada lado da aba da pele para expor o couro cabeludo(Figura 1).
12. Remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio com um cotonete mergulhado em 0,9% NaCl. Se não forem removidos, os tecidos conjuntivos ficarão presos na broca.
13. Identifique a bregma. Escolhai o ponto central do bregma como o ponto de origem e marcá-lo usando uma caneta de marcador cirúrgico preto de ponta fina.
14. Coloque uma broca a 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (variam de 0,5 a 3,0 mm, Figura 2A).
15. Realize a craniotomia (1 mm de diâmetro) utilizando uma broca automática. Prossiga com cuidado, porque este ponto é próximo do seio venoso.
16. Remova a broca do quadro estereotaxic.
17. Coloque uma sonda de 22 G com baia isolada no quadro estereotaxic(Figura 3A). A ponta da sonda deve ser colocada 2 mm acima da extremidade proximal da baia (Figura 3A,B; Figura 2B).
18. Certifique-se de que a baia entre no cérebro 7 mm (7 mm DV, Figura 2B; Figura 1C).
19. Avance a sonda ao longo da baia(Figura 1D) até que a ponta da sonda esteja 9 mm abaixo da superfície do cérebro(Figura 2D).
20. Conecte os eletrodos a um estimulador elétrico(Figura 3C). Conecte o ânodo à sonda, conforme mostrado na Figura 1D. Conecte o cátodo aos ratos (geralmente ao ouvido dos ratos).
21. Ligue o estimulador elétrico e configure os seguintes parâmetros: largura de pulso único = 4.050 ms; tensão = 50 V; e corrente = 4 mA (Figura 3C). Durante a estimulação elétrica, o rato exibirá tremores. Neste estudo, o dispositivo não foi ligado para ratos do grupo controle utilizados para os testes comportamentais, ressonância magnética e TTC.
22. Deixe a sonda em posição por 5 minutos após a estimulação.
23. Remova a sonda do cérebro(Figura 1F).
24. Use cimento ósseo para cobrir a craniotomia. Deixe o cimento secar antes da sutura da ferida.
25. Sutura a ferida com filamentos de sutura de poliamida 4-0. Depois de três ou quatro stiches, empate 2-1-1 nós cirúrgicos padrão.
26. Injete os ratos com penicilina (0,25 mL, 80 UI diluída em 4 mL de soro fisiológico) intraperitonealmente para prevenir infecções.
27. Injete os ratos subcutâneamente com meloxicam a uma dose de 2 mg/kg e repita-o a cada 24 horas.
28. Monitore os ratos a cada 15 minutos até que esteja totalmente acordado e devolva-os para a gaiola com uma almofada de aquecimento. Fornecer acesso gratuito a comida e água até o sacrifício.
    NOTA: Todos os procedimentos devem seguir os princípios cirúrgicos assépticos. Antes da cirurgia, coloque um top de esfoliante, máscara cirúrgica e luvas estéreis após um esfoliante cirúrgico das mãos. Mantenha o material de sutura estéril dentro do campo estéril o tempo todo.

3. Testes comportamentais

1. Longa pontuação¹⁷
   1. Coloque os ratos na superfície da mesa.
   2. Os escores recordes da seguinte forma: 0 = sem déficit neurológico; 1 = falha na prorrogação total da preevação contralateral, um leve déficit neurológico focal; 2 = circulando para a esquerda, um déficit neurológico focal moderado; 3 = queda para a esquerda, um déficit focal severo; 4 = sem caminhada espontânea e um nível de consciência deprimido.
2. Berderson marca¹⁸
   1. Segure o rato pela cauda e deixe os membros dianteiros estender em busca de uma mesa. Registos: 0 = ambos os membros chegaram à tabela; 1 = apenas um membro atinge a mesa.
   2. Coloque o animal em uma superfície áspera. Registos da seguinte forma: 0 = uma forte compreensão na superfície áspera com boa resistência quando empurrado; 1 = uma leve resistência vista apenas em uma pata; 2 = nenhuma resistência quando empurrada em uma direção.
   3. Coloque o rato em uma área fechada (18 em × 36 in) e deixe-o vagar livremente. Registos: 0 = caminhar toda a extensão do gabinete sem circular; 1 = caminhar toda a extensão do gabinete com circulação; 2 = não pode andar o comprimento do gabinete, mas pode circular; 3 = não pode se mover muito. Use a soma dos escores de avaliação de cada tarefa como o escore final de avaliação.
3. Teste de feixe de equilíbrio¹⁹
   1. Certifique-se de que o aparelho consiste em um feixe de 3 cm de largura e 70 cm de comprimento e está 20 cm acima do chão. Coloque uma caixa escura na extremidade mais distante da viga com uma entrada estreita.
   2. Coloque um gerador de ruído branco e uma fonte de luz brilhante no início do feixe. O barulho e a luz foram usados para motivar o rato a atravessar a trave e entrar na caixa de gol.
   3. Termine os estímulos quando os animais entrarem na caixa escura. Regissuor a latência para alcançar a caixa de gol (em segundos) e o desempenho do rato em segundo traseiro ao atravessar a trave.
   4. Registos para cada desempenho da seguinte forma: 0 = saldos com postura estável; 1 = agarra o lado do feixe; 2 = feixe de abraços e 1 membro cai da viga; 3 = feixe de abraços e dois membros caem da viga, ou giram no feixe após >60 s; 4 = tentativas de equilíbrio na viga, mas cai após >40 s; 5 = tentativas de equilíbrio na viga, mas cai após >20 s; e 6 = cai, sem tentar equilibrar ou segurar a viga após <20 s.
4. Teste somatossensorial de remoção adesiva²⁰
   1. Coloque os ratos em uma caixa de plexiglass clara e permita que eles explorem o novo ambiente por 2 ou 3 minutos.
   2. Coloque uma etiqueta adesiva de cor verde de 10 mm de diâmetro na superfície interna de cada membro dianteiro acima do polegar e no pulso.
   3. Devolva os ratos para a caixa de plexiglass.
   4. Regissei o tempo para o rato remover a primeira etiqueta e todos os outros rótulos, respectivamente. Permita um máximo de 3 min. O teste deve ser realizado 2x em treinamento.
5. Teste de colocação de membros
   1. Segure os ratos em uma posição horizontal e evite o movimento.
   2. Uma vez que o rato perca contato com a superfície da mesa (movimento passivo do membro), aplique estímulos táteis e proprioceptivos na pata com a borda da mesa.
   3. Avalie a colocação da pata (sucesso ou falha) na borda da mesa.
   4. Registos: 0 = sem colocação; 0,5 = colocação inacabada e/ou atrasada; 1 = colocação imediata e completa.

4. Confirmação infarto por ressonância magnética

1. Faça a ressonância magnética 24h após a cirurgia.
2. Anestesiar o rato por isoflurane (5% para indução, 1%-1,5% para manutenção).
3. Fixar a cabeça do rato em uma bobina de matriz cerebral de rato e combinado com uma bobina de volume somente de transmissão.
4. Coloque a bobina e o rato no scanner de ressonância magnética. Fixar o rato dentro do berço usando as barras de dente e orelha.
5. Mantenha a temperatura corporal a 37 °C ± 0,5 °C durante o procedimento de ressonância magnética usando uma jaqueta térmica de circuito fechado.
6. Use uma sequência piloto para garantir a geometria correta.
7. Coletar varreduras ponderadas por T2 usando uma sequência de eco de giro rápido: tempo de eco (TE) = 33 ms; tempo de repetição (TR) = 8.000 ms; campo de visão = 30 mm x 30 mm; matriz de aquisição = 512 × 512; 50 fatias; 0,4 mm de espessura.
8. Coletar um DWI de imagem planar spin-echo de quatro tiros: tempo de eco = 30,5 ms; tempo de repetição = 8000 ms; matriz = 96 × 96; campo de visão = 25 mm x 25 mm; três direções = x, y, z; Valores B = 0 1.000 s/mm² e 1.000 s/mm²; 50 fatias axiais contíguas; 0,4 mm de espessura.
9. Devolva os ratos para a jaula.

5. Confirmação infarto por manchas de TTC

1. Sacrifique os ratos no ponto de tempo de acordo com o projeto experimental. Neste experimento, sacrificamos os ratos 24 horas após a cirurgia.
2. Prepare uma solução TTC de 2% antes do sacrifício. Adicione 0,2 g de pó TTC ao 10 mL 0,01 M PBS (pH 7.4). Transfira a diluição para um prato de 10 cm coberto com papel prata e pré-armado a 37 °C em banho-maria.
3. Exponha o rato a 5% de isoflurane até a perda de consciência. Em seguida, exponha o rato ao CO₂ (20%-30% do volume da gaiola por minuto) até que a respiração tenha parado, depois mantenha 2 min de exposição ao CO_2.
4. Use os seguintes sinais para confirmar a morte: sem aumento e queda do peito, sem batimentos cardíacos palpáveis, cor da membrana mucosa pobre, nenhuma resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo, mudança de cor ou opacidade nos olhos.
5. Faça deslocamento cervical.
6. Proteja os animais gravando as patas em uma plataforma estéril. Crie uma incisão midline da clavícula para o hipogastério e uma incisão lateral do xiphoide para a esquerda ao longo da caixa torácica. Faça um corte no diafragma também ao longo da caixa torácica e uma incisão de linha média do tórax para expor o coração.
7. Conecte a ponta de uma agulha (27 G) a uma bomba de perfusão contendo 0,01 M PBS a 4 °C no ventrículo esquerdo.
   NOTA: Avance a ponta ao longo da borda esquerda do ventrículo para evitar entrar no átrio. Ligue a bomba de perfusão para garantir que a ponta esteja no ventrículo esquerdo e corte o átrio direito. Se o fluido escorrer da narina, a ponta está no átrio e precisa ser ajustada ou reinserida.
8. Utilize aproximadamente 100 mL de 0,01 M PBS, mantido a 4 °C para perfusão. Desligue a bomba de perfusão até o fígado ficar branco.
9. Decapitar os ratos e dissecar todo o cérebro usando a tesoura e fórceps. Remova qualquer água da superfície cerebral com papel manchado.
10. Armazene todo o cérebro a -80 °C por 1 min (cortar seções cerebrais é mais fácil depois de congelar).
    NOTA: Este passo pode ser ignorado se as seções cerebrais puderem ser bem cortadas sem congelamento.
11. Coloque o cérebro na matriz com o lado dorsal para cima.
12. Identifique o orifício na superfície do cérebro como mostrado na Figura 1G e insira uma lâmina de aço inoxidável de 0,21 mm de espessura. Normalmente, a maior área de infarto está no plano da sonda; assim, uma lâmina deve ser inserida nesta região.
13. Insira as outras lâminas em um intervalo de 2 mm.
14. Remova simultaneamente as lâminas, todas de uma vez, da matriz e coloque todo o cérebro com as lâminas na solução TTC no prato. Remova as lâminas cuidadosamente.
    NOTA: Aqui, as seções cerebrais não foram facilmente removidas do líquido porque algumas pia mater residuais na base cranii interferiram na secção. Se alguma seção permanecer na matriz, use uma pequena espátula para transferi-las para o prato.
15. Coloque o prato com solução TTC e seções cerebrais em um banho de água a 37 °C.
16. Verifique o prato a cada 5 minutos e não se sobreponha de seções.
17. Adicione 10 mL de solução de paraformaldeído de 4% ao prato para terminar a reação TTC.
18. Oriente as seções do rostral ao caudal e tire fotos.

6. Estatísticas

1. Use software de análise estatística (por exemplo, GraphPad Prism) para realizar o teste tde um aluno.
   NOTA: Todos os dados são expressos como média ± SE. As diferenças entre os grupos são determinadas com os t-testsdo aluno de duas caudas (p < 0,05 definidos como significância estatística).

Seis animais foram submetidos ao protocolo cirúrgico descrito acima. O grupo controle, como mostrado na Figura 4, consistia de seis ratos. As fatias cerebrais mostradas na Figura 4 foram derivadas de um rato por grupo.

A ressonância magnética mostrou que o infarto estava localizado na base dos pons(Figura 4A). Uma vez que a sonda foi injetada 2 mm à esquerda da linha média, o infarto foi localizado lateralmente. Este infarto imita infartos anterolaterais de pontina em pacientes (Figura 4A). Como foi utilizada uma baanha isolada, não houve infarto além da ponta da sonda, incluindo o córtex, cerebelo e midbrain(Figura 4A). As imagens da DWI também revelaram o infarto agudo de pontina(Figura 4A).

A coloração ttc foi utilizada para confirmar o infarto 24 h pós-cirurgia(Figura 4A). Em relação ao grupo controle, o volume de infarto foi significativamente maior (Figura 4B).

Os escores comportamentais foram medidos antes e depois da cirurgia. Os escores dos grupos de modelos de controle e infract antes e depois da cirurgia são apresentados na Tabela 1. Devido à falta de um teste comportamental específico projetado para infarto de pontina, foram utilizados o escore de Longa, escore de Berderson e teste de feixe de equilíbrio para avaliar os déficits neurológicos. Além disso, o teste somatosensorial de remoção adesiva para avaliar a função sensorial, bem como o teste de colocação de membros para avaliar a propriocepção.

Em comparação com o grupo controle, os ratos com infarto pontino circularam para a esquerda(Figura 4A). Houve diferenças significativas na pontuação de Longa (2,67 ± 0,52 vs. 0, p < 0,05, Figura 4C), pontuação de Berderson (2,67 ± 0,52 vs. 0, p < 0,05, Figura 4D),teste de colocação de membros (4,67 ± 0,52 vs. 0, p < 0,05, Figura 4E), escore do teste de equilíbrio do feixe (118,33 ± 2,66 vs. 10,17 ± 1,47, p < 0,05, Figura 4F) e adh Escore do teste somatosensorial de remoção (2,33 ± 0,52 vs. 12,0 ± 0, p < 0,05, Figura 4G) entre ratos com infarto pontino e ratos do grupo controle.

Figura 1: Estabelecimento de infarto. UmAburaco feito no crânio. (B) A baia é movida para o buraco. (C) Injeção da baia. (D)Injeção da sonda. (E) O ânodo (seta vermelha) está conectado. (F) A sonda é removida. (G) Buraco (seta vermelha) deixado na superfície cerebral. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Figura 2: Localização da sonda. (A) Diagrama esquemático de locais estereotaxicos: setas apontam para retração de retalhos de pele, local de Bregma e posicionamento da broca. (B) Diagrama esquemático da baia e da sonda. (C) Localização da ponta da baia colocada nos pons. (D) Localização da ponta da sonda colocada nos pons. (E) Design experimental. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Figura 3: Dispositivo produtor de lesões. (A) Separar a baia e a sonda. (B) A sonda na baia. (C) O eletrodo azul era ânodo que estava conectado à sonda caudal; o eletrodo vermelho era cátodo. (D) Estimulador elétrico. (E) Instrumentos cirúrgicos. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Figura 4: Resultados representativos. (A) O infarto foi avaliado pela ressonância magnética com sequência T2 e DWI in vivo e foi confirmado por manchas de TTC in vitro 24h após a cirurgia. Infarto agudo de pontina localizado nos pons anterolateral direito (linha pontilhada). O teste comportamental mostrou que o rato circulou para o lado contralateral da lesão. (B) O volume de infarto. (C) Pontuação longa. (D) Bederson marcar. (E) Teste de colocação de membros. (F) Teste de caminhada do feixe de equilíbrio. (G) Teste somatosensorial de remoção adesiva. As barras representam média ± SD(p < 0,05 vs. grupo de controle). Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Figura S1: Infarto lacunar nos pons. O comprimento da ponta da sonda está encurtando. A ressonância magnética mostra um infarto lacunar nos pons certos. (A) Imagem T2. (B) Imagem DWI. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Tabela 1: Pontuações comportamentais.

Nenhum conflito de interesses.