Method Article

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

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1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um protocolo para imobilizar macromoléculas únicas em dispositivos microfluidos e quantificar mudanças em suas conformações fluxo de cisalhamento. Este protocolo é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas e funcionais de biomoléculas, como proteínas e DNA, em um ambiente de fluxo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O comportamento de uma única molécula perturbação mecânica tem sido amplamente caracterizado para entender muitos processos biológicos. No entanto, métodos como microscopia da força atômica têm resolução temporal limitada, enquanto a transferência de energia de ressonância förster (FRET) só permite que conformações sejam inferidas. A microscopia de fluorescência, por outro lado, permite a visualização em tempo real de moléculas únicas em várias condições de fluxo. Nosso protocolo descreve as etapas para capturar alterações conformacionais de biomoléculas únicas em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento usando microscopia de fluorescência. O fluxo de cisalhamento é criado dentro de canais microfluidos e controlado por uma bomba de seringa. Como demonstrações do método, o fator von Willebrand (VWF) e o DNA lambda são rotulados com biotina e fluoroforo e depois imobilizados na superfície do canal. Suas conformações são continuamente monitoradas fluxo de cisalhamento variável utilizando reflexão interna total (TIRF) e microscopia de fluorescência confocal. A dinâmica reversível de desvendar a VWF é útil para entender como sua função é regulada no sangue humano, enquanto a conformação do DNA lambda oferece insights sobre a biofísica das macromoléculas. O protocolo também pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento dos polímeros, especialmente biopolímeros, em condições variadas de fluxo e investigar a reologia de fluidos complexos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mecanismos de como as biomoléculas respondem a estímulos ambientais têm sido amplamente estudados. Em um ambiente de fluxo em particular, as forças de cisalhamento e alongamento regulam as mudanças conformacionais e potencialmente a função das biomoléculas. Exemplos típicos incluem desvendamento induzido por cisalhamento do DNA lambda e do fator von Willebrand (VWF). O DNA lambda tem sido usado como ferramenta para entender a dinâmica conformação de cadeias de polímeros individuais e flexíveis e a reologia das soluções de polímeros1,2,3,4. VWF é um sensor de fluxo natural que agrega plaquetas em locais de feridas de vasos sanguíneos com taxas de cisalhamento anormal e padrões de fluxo. O desvendamento da VWF é essencial para ativar a vinculação de plaquetas ao domínio A1 e ligação de colágeno ao domínio A3. Além disso, o desdobramento do domínio A2 induzido por cisalhamento permite o decote da VWF, que regula sua distribuição de peso molecular na circulação5,6. Assim, a visualização direta de como essas moléculas se comportam o fluxo pode melhorar muito nossa compreensão fundamental de sua biomecânica e função, que por sua vez podem permitir novas aplicações diagnósticas e terapêuticas.

Metodologias típicas para caracterizar conformações de moléculaúnica incluem pinças ópticas/magnéticas, microscopia de força atômica (AFM) e transferência de energia de ressonância Förster de molécula única (FRET)7. A espectroscopia de força de molécula única é uma poderosa ferramenta para investigar a força e o movimento associados às mudanças conformacionais de biomoléculas. No entanto, não tem a capacidade de mapear conformações moleculares globais8. A AFM é capaz de imagens com alta resolução espacial, mas é limitada na resolução temporal9,10. Além disso, o contato entre a ponta e a amostra pode confundir a resposta induzida pelo fluxo. Outros métodos como a ANÁLISE frete e nanopore determinam o dobrável e desdobramento de proteínas de molécula única com base na detecção de distância molecular e volumes excluídos. No entanto, esses métodos ainda estão em sua infância e limitados em sua observação direta de conformações unimoléculas11,12,13,14.

Por outro lado, observar diretamente macromoléculas com alta resolução temporal e espacial microscopia de fluorescência melhorou nossa compreensão da dinâmica de moléculaúnica em muitos processos biológicos15,16. Por exemplo, Fu et al. recentemente alcançaram visualização simultânea de alongamento VWF e ligação receptor a plaqueta pela primeira vez. Em seu trabalho, as moléculas vwf foram imobilizadas na superfície de um canal microfluido através de interações biotina-streptavidin e imagens reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento17. Aplicando um método semelhante ao de Fu, demonstramos aqui que conformações de DNA VWF e lambda podem ser observadas diretamente microscopia de fluorescência TIRF e confocal. Como mostrado na Figura 1,dispositivos microfluidos são usados para criar e controlar o fluxo de cisalhamento, e as biomoléculas são imobilizadas na superfície do canal. Após a aplicação de diferentes taxas de cisalhamento, conformações da mesma molécula são registradas para medir o comprimento extensão, também mostrado na Figura 1. O método poderia ser amplamente aplicado para explorar outros comportamentos de polímeros em ambientes de fluxo complexos para estudos reológicos e biológicos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparando VWF

  1. Reconstituir o VWF de plasma humano para prepará-lo para as reações de rotulagem. Adicione 100 μL de água desionizada (DI) a 100 μg de VWF liofilizado para criar uma solução de estoque VWF de 1 mg/mL.
  2. Dilatar a solução de estoque da VWF para remover o excesso de glicina, aumentando assim a eficiência de rotulagem de biotina e fluorofóforo.
    1. Transfira 50 μL da solução de estoque da VWF para uma unidade de diálise de 0,1 mL com um corte de peso molecular de 10.000 e vedação com uma tampa. Armazene a solução de estoque restante a -20 °C. As ações da VWF ficarão estáveis por até 1 ano a -20 °C.
    2. Executar diálise em 500 mL de 1x fosfato estéril tampão de fosfato (PBS) (0,01 M fosfato de sódio, 0,0018 fosfato monopotássio, 0,0027 M cloreto de potássio, 0,137 M cloreto de sódio, pH 7.4 a 25 °C) por 1h a 4 °C com agitação lenta. Repita a diálise por mais uma hora usando 500 mL de PBS fresco.
  3. Comece a reação de rotulagem de biotina. Prepare uma solução de 2mM de NHS-PEG 4-biotin dissolvendo o sólido na água DI imediatamente antes da reação. Permitir que o NHS-PEG4-biotina permaneça na água por tempo prolongado fará com que o grupo NHS-ester hidresse, diminuindo assim a eficiência da rotulagem.
    1. Adicione 2,5 μL de 2 mM NHS-PEG4-biotina à unidade de diálise contendo a solução de estoque vwf. Isso resultará em um excesso molar de 20 vezes de biotina em comparação com os monomers vwf. As aminas primárias da VWF reagirão com os grupos NHS-ester, vinculando-se covalentemente aos grupos PEG4-biotinaatravés de ligações de amido.
    2. Coloque a unidade de diálise dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Selar a unidade de diálise com sua tampa correspondente. Proteja a montagem de diálise com parafilm. Mantenha-se ereto e deixe à temperatura ambiente por 40 min.
  4. Comece a reação de rotulagem fluoroforre. Prepare uma solução de 2,8 mM de Alexa 488 tetrafluorofife-ester (TFP-ester) corante fluorescente(extremidade máxima de excitação = 498 nm,emissão máxima = 519 nm) dissolvendo o flúor sólido di em água DI. Faça isso imediatamente antes da reação para evitar que o grupo TFP-ester hidrrate.
    1. Adicione 2,9 μL do fluoroforó de 2,8 mM 488 à unidade de diálise. Isso resultará em um excesso molar de 34 vezes de fluoroforre em comparação com os monomers da VWF. As aminas primárias remanescentes da VWF reagirão com os grupos TFP-ester, ligando covalentemente aos fluoroforreios através de ligações de amido.
    2. Adicione 2,0 μL de 1 M de bicarbonato de sódio (dissolvido em água DI) à unidade de diálise. Isso ajusta o pH da reação mais perto de 8,0, o que aumenta a eficiência do TFP-ester e da reação primária de amina.
    3. Proteja a unidade de diálise em um tubo de microcentrífuga, assim como na etapa 1.3.2. Guarde no escuro para evitar fotobranqueamento e deixe à temperatura ambiente por 1h e 30 min.
  5. Coloque a unidade de diálise em 900 mL de PBS estéreis de 1x e divagação durante a noite a 4 °C. Isso renderá aproximadamente 70 μL de VWF rotulado em uma concentração de 0,71 mg/mL ou 2,84 μM (concentração monomer).
  6. Transferência rotulada VWF em um tubo de microcentrífuga. Cubra o tubo com papel alumínio e proteja da luz. Loja a 4°C. Para armazenamento a longo prazo, adicione azida de sódio antimicrobiano ao azida de sódio antimicrobiana a uma concentração final de 0,02% (w/v).
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Preparando DNA lambda

  1. Biotinylate DNA linear lambda preenchendo seus locais finais coesos (cos sites) com nucleotídeos biotina-14-dCTP de acordo com protocolos padrão, repetidos aqui na etapa2.118. Preencha o restante dos sites cos com nucleotídeos dATP, dTTP e dGTP.
    1. Prepare 1 mM soluções de dATP, dTTP, dGTP e biotina-14-dCTP em um tampão de reação de 10x (cloreto de sódio de 500 mM, hidrocloreto tris de 100 mM, cloreto de magnésio de 100 mM, 10 m dithiothreitol, pH 7,9 a 25 °C).
    2. Coloque 48 μL de DNA lambda de 500 ng/μL em um tubo PCR e aqueça por 5 min a 65 °C. Os cos locais de DNA de lambda circular se separarão o calor, linearizando a molécula e deixando as saliências de uma única cadeia prontas para a biotinylation. Imediatamente depois, coloque no gelo para evitar que os locais cos reanam.
    3. Adicione 5 μL de 1 mM dATP, dTTP e dGTP e 4 μL de 1 mM biotina-14-dCTP ao DNA lambda. Adicione também 2,5 μL de 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) para catalisar a síntese de DNA.
    4. Incubar a mistura de reação por 1 h a 37 °C.
    5. Adicione 1,2 μL de 0,5 M EDTA. Em seguida, aqueça a mistura de reação por 5 min a 70 °C. Isso desativará o Fragmento klenow e a reação de biotinylation.
  2. Remova o excesso de nucleotídeos do DNA lambda usando uma coluna de spin que pode conter 10-70 μL e tem um corte de peso molecular de 6.000.
    1. Coloque a coluna dentro de um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Centrífuga a coluna e o tubo a 1000 x g por 2 min. Descarte o fluxo-through que coleta no tubo.
    2. Substitua o buffer da coluna por uma solução de 1x do mesmo buffer de reação da etapa 2.1.1. Faça isso adicionando 500 μL de 1x tampão à coluna. Centrífuga por 1 min a 1000 x g. Descarte o fluxo. Repita essas duas vezes mais para que um total de 1500 μL tenha sido adicionado à coluna.
    3. Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione cuidadosamente a solução da etapa 2.1.5 à camada superior da coluna. Centrífuga por 4 min a 1000 x g.
    4. Colete o fluxo -through (40-70 μL) do tubo de microcentrífuga e coloque em um tubo PCR. Isso contém o DNA de lambda purificado e biotinylado.
  3. Rotular dNA lambda com corante YOYO-1 fluorescente(extremidade máxima = 490 nm,emissão máxima = 509 nm) de acordo com protocolos padrão, repetido aqui na etapa 2.3.120.
    1. Prepare uma solução de YOYO-1 dye e DNA lambda com um corante para a razão molar par base de 1:10. Suponha que nenhum DNA tenha sido perdido na etapa de purificação para calcular a concentração de DNA do par base de DNA lambda. O DNA lambda de comprimento completo tem 48.502 pares de base.
      NOTA: Por exemplo, se 50 μL de solução foi recuperado da etapa 2.2.4, adicione 7,4 μL de 500 μM YOYO-1 tinante.
    2. Aqueça a solução por 2h a 50 °C no escuro para completar a reação.
    3. Cubra o tubo com papel alumínio e proteja da luz. Loja a 4°C. A solução está pronta para ser injetada em dispositivos microfluidos.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Criar moldes de canais microfluidos em wafer de silício

  1. Use a fotolitografia para criar canais microfluidos com dimensões apropriadas (Figura 2) em um wafer de silício mestre de acordo com os protocolos padrão19.

4. Preparação do dispositivo microfluido de polimetilexino (PDMS)

  1. Adicione 5 partes base de elastômero de silicone a 1 peça agente de cura (por massa) em um barco de pesagem. Mexa o conteúdo completamente por 1 min para criar solução PDMS pré-curada.
  2. Coloque o mestre do wafer de silício em uma placa de Petri de plástico. Despeje a solução PDMS sobre o wafer para criar uma camada de 5 mm. Cubra o prato e deixe em um dessecador vácuo por 1h para remover bolhas de ar.
  3. Incubar placa de Petri coberta a 60 °C durante a noite para curar PDMS em um sólido flexível. A cura resultará em canais microfluidos moldados no PDMS na interface PDMS-wafer.
  4. Corte retângulos de 20 x 10 mm no PDMS, em torno de cada canal microfluido, usando uma navalha. Remova os blocos PDMS retangulares com pinças.
  5. Use uma agulha final de 25 G com bordas afiadas para furar 0,5 mm de diâmetro em uma extremidade do canal, certificando-se de que o buraco passe completamente pelo bloco PDMS(Figura 2). Use uma agulha fina para socar PDMS do buraco. Repita isso do outro lado do canal. Isso criará uma entrada e saída para o fluxo através do canal.
  6. Limpe a superfície do bloco PDMS com fita de limpeza de vinil. Soprar gás nitrogênio comprimido sobre um deslizamento de cobertura nº 1 1/2, 22 x 50 mm para remover detritos.
  7. Coloque o bloco PDMS com o lado do canal para cima e o deslizamento de cobertura na câmara de uma máquina de ligação de plasma. Comece o tratamento.
  8. Quando o tratamento estiver completo, coloque rapidamente o bloco PDMS em um deslizamento de cobertura para que o canal esteja em contato com o deslizamento. Aplique pressão ao longo das bordas do bloco. Coloque o conjunto coverslip-PDMS em uma placa quente a 115 °C por 15 min para reforçar o vínculo permanente.
  9. Insira tubos de diâmetro interno de 10 cm de comprimento e 0,25 mm no orifício de saída na parte superior do bloco PDMS. Isso permite que o fluido flua facilmente para fora do canal. O dispositivo está completo.

5. Tratando superfície de dispositivo microfluido

  1. Injetar <10 μL de 10 μg/mL biotinylated trico soro albumin (BSA-biotin) dissolvido em PBS estéreis 1x na entrada de dispositivo microfluido para experimentos VWF. Injetar <10 μL de 1 mg/mL BSA-biotina para experimentos de DNA lambda. Retenha alguns microlitros de BSA-biotina na ponta da pipeta após a injeção e deixe que a ponta permaneça embutida na entrada.
    1. Mantenha sempre uma gota de água DI ao redor da ponta. Isso impedirá que bolhas de ar entrem no canal. Aplique essa técnica toda vez que uma nova solução é injetada no canal.
    2. Permita que a BSA-biotina incubar no dispositivo por 2 h. A BSA se ligará especificamente à superfície do deslizamento de cobertura(Figura 3A).
  2. Remova a ponta da pipeta. Injetar <10 μL de solução de bloqueio de caseína no canal e permitir que ela incuba por 30 min. A caseína bloqueará quaisquer locais livres, reduzindo a ligação não específica de biomoléculas à superfície (Figura 3B).
  3. Remova a ponta e injete <10 μL de 10 μg/mL streptavidin dissolvido em PBS 1x estéreis no canal para experimentos VWF. Use 100 μg/mL streptavidin para experimentos de DNA lambda. Incubar por 10 min. A streptavidin se ligará aos grupos de biotina da BSA-biotina (Figura 3C).
  4. Remova a ponta e injete <10 μL de solução de detergente 1x (0,05% Tween 20 em PBS) no canal para lavar o excesso de streptavidin.
  5. Remova a ponta e injete <10 μL de 28,4 nM VWF diluído na solução de casein ou DNA lambda a partir da etapa 2.3.3. Incubar VWF por 3 min. Incubate lambda DNA por 45 min (Figura 3D).
  6. Remova a ponta e injete <10 μL de 5 mM de biotina livre diluída na solução de casein. A biotina gratuita bloqueará o excesso de locais de ligação streptavidin na superfície do canal(Figura 3E).

6. Visualização de DNA VWF e Lambda microscopia de fluorescência

  1. Prepare 1 mL de solução de bloqueio de caseína com 2,2 mM de ácido protocatecônico e protocatechuana toda-3,4 dioxygenase (para minimizar o fotobranquelo). Carregue em uma seringa e segure em uma bomba de seringa. Leve 30 cm de comprimento, tubo de diâmetro interno de 0,25 mm e conecte uma extremidade à agulha de seringa. Flua na solução para remover bolhas de ar. Conecte a outra extremidade do tubo à entrada do dispositivo microfluido. Recomenda-se fazer isso 3 minutos após a etapa 5.6.
  2. Selecione o maior objetivo de ampliação (ou seja, 60-100X) de uma reflexão interna total (TIRF) ou microscópio de fluorescência confocal. Adicione uma gota de óleo de imersão em seu objetivo, se necessário. Coloque o dispositivo microfluido no palco do microscópio para que o deslizamento de cobertura esteja alinhado com o objetivo.
  3. Comece microscopia de campo brilhante. Ajuste o foco para que quaisquer características, como detritos e bolhas, sejam visíveis. Em seguida, ajuste o estágio na direção X e Y até que a borda do canal microfluido seja visível e bissecta a moldura.
  4. Mude para o canal 488 (FITC). Ajuste o ângulo z-nível e TIRF conforme necessário até que moléculas verdes e globulares individuais possam ser distinguidas. Estas são moléculas de DNA VWF ou lambda.
  5. Ajuste o tempo de exposição e a intensidade do laser para visualizar moléculas fluorescentes sem fotobranque-las muito rapidamente. Ajuste o contraste para também visualizar moléculas com mais clareza.
  6. Inicie o fluxo da bomba de seringa para que a solução de bloqueio de casein flua para dentro do canal e para fora da tomada. Faça exatamente 5 minutos após o passo 5.6. Pare e inicie o fluxo para observar as mudanças na conformação de moléculas. Ao aplicar o fluxo, as taxas de uso entre 5.000 e 30.000 μL/h. Repita isso em várias áreas do dispositivo microfluido. Continue esse processo para localizar moléculas que podem se estender e relaxar em vários ciclos de parada e início do fluxo.
  7. Observe quanto tempo leva para as moléculas atingirem a extensão máxima e relaxarem completamente em glóbulos. Grave vídeos do comportamento contínuo das moléculas fluxo de cisalhamento, selecionando o melhor tempo de exposição, frequência de exposição e duração do vídeo que capturará toda a gama de comportamento extensivo e minimizará o fotobranqueamento.
  8. Salve os vídeos como . Arquivos AVI com uma barra de escala.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

7. Análise de imagem de alterações conformacionais

  1. Calcule a taxafigure-protocol-1de cisalhamento da parede aplicada às macromoléculas usando a taxa de fluxo(Q)e a altura(h) e largura(w)do canal microfluido retangular. Use a seguinte equação para fazê-lo:
    figure-protocol-2
  2. Determine o comprimento de qualquer biomolécula várias taxas de cisalhamento usando um código MATLAB personalizado (ver Arquivos Suplementares). Crie uma análise de vídeos intitulada pasta que inclua os seguintes códigos MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m e get_length.fig. Crie uma subpasta dentro de vídeos de análise de vídeos intitulado vídeos e adicione . Arquivos AVI a serem analisados nele.
  3. Abra o main.m usando o MATLAB 2019a e execute o código. Digite o nome do arquivo de vídeo a ser analisado na janela de comando em por favor insira o arquivo de dados para analisar:.
  4. Na interface gráfica aberta do usuário (GUI), definir o limiar (texto na caixa no canto superior direito da janela) para 20 e clicar no botão de limiar set para confirmar.
  5. Use o cursor de dados na barra de ferramentas superior da janela para escolher um pixel em qualquer lugar na barra de escala. Clique no ponto de partida na seção de barras de escala à direita da janela. A posição (x,y) do pixel escolhido aparecerá à direita do botão. Clique no botão tamanho Pixel (μm). O tamanho do pixel precisa ser medido apenas uma vez em cada vídeo.
  6. Escolha qualquer pixel na molécula de interesse. Clique no ponto de partida na seção VWF. Após a posição do pixel escolhido aparecer na caixa de texto à direita, clique na extremidade esquerda, extremidade direita e comprimento de string para obter o comprimento molecular na imagem.
    NOTA: Esta etapa pode ser usada para analisar as alterações conformaçãois de qualquer biomolécula, apesar do código ter uma seção específica chamada VWF.
  7. Verifique duas vezes a extremidade esquerda e direita da molécula. Amplie e use o cursor de dados para verificar a posição de interesse do pixel. Escolha manualmente o pixel como uma extremidade e recalcule o comprimento (em pixels) quando necessário.
  8. Grave o tamanho do pixel em μm e comprimento de corda em número de pixel em uma folha excel e calcule o comprimento da corda em μm.
  9. Repita os passos acima para cada imagem. Use por último, botão Next no canto inferior direito da GUI para alternar entre imagens no mesmo arquivo de vídeo. Clique em Fechar a janela gui.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Observar o comportamento dinâmico de biomoléculas como VWF e DNA lambda é altamente dependente da otimização de sua ligação com a superfície do dispositivo. A incubação de tratamentos superficiais para os tempos recomendados no dispositivo microfluido é crucial para obter a ligação com alguns pontos de ancoragem, para que as moléculas possam se estender livremente e relaxar ao mudar o fluxo. Se as proteínas ou DNA estiverem muito fortemente ligados a várias ligações, elas se estenderão a comprimentos limitados ou não se ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para obter dados de alta qualidade de alterações conformais de molécula única usando microscopia de fluorescência como descrito neste método, é fundamental incubar a molécula pela quantidade adequada de tempo, minimizar suas interações inespecíficas com a superfície e estabelecer configurações de microscópio que reduzem o fotobranqueamento. A capacidade da molécula de mudar livremente a conformação está relacionada ao número de interações biotina-streptavidin formada entre a molécula e a superfície. Como mencionado anter...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado em parte por uma Fundação Nacional de Ciência sacada dMS-1463234, Institutos Nacionais de Saúde concede HL082808 e AI133634, e financiamento interno da Universidade Lehigh.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kit de Rotulagem Alexa Fluor 488InvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Colunas de GelBio-Rad7326221
BiotinaSigma-AldrichB4501Use como biotina gratuita na Etapa 5.6
Biotina-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinaSigma-AldrichA8549
LamínulasVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP SetInvitrogen10297018
Bóias Flutuantes para Mini Dispositivo de DiáliseThermo Scientific69588
Fragmento de Klenow (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212SUse para tampão de reação 10X na Etapa 2.1.1 e tampão de reação 1X na Etapa 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini Dispositivo de DiáliseThermo Scientific6957010K MWCO, volume de 0,1 mL
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinaThermo Scientific21330
Protocatecuate 3,4-DioxigenaseSigma-AldrichP8279
Ácido protocatecuicoSanta Cruz Biotechnologysc-205818
Kit de elastômero de silicone para fabricação de PDMSA Dow Chemical Company4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
A solução de bloqueioCANDOR Bioscience110 050Use como solução de bloqueio de caseína em todo o protocolo
Fita de Vinil para Sala LimpaFisher Scientific19-120-3217
von Willebrand Factor, Plasma HumanoMillipore Sigma681300
YOYO-1 CoranteAAT Bioquest17580
Tubo de diâmetro interno de 0,25 mmCole-ParmerEW-06419-00
Agulha de calibre 25Thomas JG2505X
Científica

References

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