Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Summary

Apresentamos um protocolo para imobilizar macromoléculas únicas em dispositivos microfluidos e quantificar mudanças em suas conformações fluxo de cisalhamento. Este protocolo é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas e funcionais de biomoléculas, como proteínas e DNA, em um ambiente de fluxo.

Abstract

O comportamento de uma única molécula perturbação mecânica tem sido amplamente caracterizado para entender muitos processos biológicos. No entanto, métodos como microscopia da força atômica têm resolução temporal limitada, enquanto a transferência de energia de ressonância förster (FRET) só permite que conformações sejam inferidas. A microscopia de fluorescência, por outro lado, permite a visualização em tempo real de moléculas únicas em várias condições de fluxo. Nosso protocolo descreve as etapas para capturar alterações conformacionais de biomoléculas únicas em diferentes ambientes de fluxo de cisalhamento usando microscopia de fluorescência. O fluxo de cisalhamento é criado dentro de canais microfluidos e controlado por uma bomba de seringa. Como demonstrações do método, o fator von Willebrand (VWF) e o DNA lambda são rotulados com biotina e fluoroforo e depois imobilizados na superfície do canal. Suas conformações são continuamente monitoradas fluxo de cisalhamento variável utilizando reflexão interna total (TIRF) e microscopia de fluorescência confocal. A dinâmica reversível de desvendar a VWF é útil para entender como sua função é regulada no sangue humano, enquanto a conformação do DNA lambda oferece insights sobre a biofísica das macromoléculas. O protocolo também pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento dos polímeros, especialmente biopolímeros, em condições variadas de fluxo e investigar a reologia de fluidos complexos.

Introduction

Mecanismos de como as biomoléculas respondem a estímulos ambientais têm sido amplamente estudados. Em um ambiente de fluxo em particular, as forças de cisalhamento e alongamento regulam as mudanças conformacionais e potencialmente a função das biomoléculas. Exemplos típicos incluem desvendamento induzido por cisalhamento do DNA lambda e do fator von Willebrand (VWF). O DNA lambda tem sido usado como ferramenta para entender a dinâmica conformação de cadeias de polímeros individuais e flexíveis e a reologia das soluções de polímeros^1,2,3,4. V....

Protocol

1. Preparando VWF

1. Reconstituir o VWF de plasma humano para prepará-lo para as reações de rotulagem. Adicione 100 μL de água desionizada (DI) a 100 μg de VWF liofilizado para criar uma solução de estoque VWF de 1 mg/mL.
2. Dilatar a solução de estoque da VWF para remover o excesso de glicina, aumentando assim a eficiência de rotulagem de biotina e fluorofóforo.
   1. Transfira 50 μL da solução de estoque da VWF para uma unidade de diálise de 0,1 mL com um corte de peso molecular de 10.000 e vedação com uma tampa. Armazene a solução de estoque restante a -20 °C. As ações da VWF ficarão estáveis por até 1 ano a -20 °C.
   2. Executar diálise em 50....

Results

Observar o comportamento dinâmico de biomoléculas como VWF e DNA lambda é altamente dependente da otimização de sua ligação com a superfície do dispositivo. A incubação de tratamentos superficiais para os tempos recomendados no dispositivo microfluido é crucial para obter a ligação com alguns pontos de ancoragem, para que as moléculas possam se estender livremente e relaxar ao mudar o fluxo. Se as proteínas ou DNA estiverem muito fortemente ligados a várias ligações, elas se estenderão a comprimentos limitados ou não se .......

Discussion

Para obter dados de alta qualidade de alterações conformais de molécula única usando microscopia de fluorescência como descrito neste método, é fundamental incubar a molécula pela quantidade adequada de tempo, minimizar suas interações inespecíficas com a superfície e estabelecer configurações de microscópio que reduzem o fotobranqueamento. A capacidade da molécula de mudar livremente a conformação está relacionada ao número de interações biotina-streptavidin formada entre a molécula e a superfície. Como mencionado anter.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de Rotulagem Alexa Fluor 488	Invitrogen	A30006
Bio-Spin P-6 Colunas de Gel	Bio-Rad	7326221
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501	Use como biotina gratuita na Etapa 5.6
Biotina-14-dCTP	AAT Bioquest	17019
BSA-Biotina	Sigma-Aldrich	A8549
Lamínulas	VWR	48393-195	No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set	Invitrogen	10297018
Bóias Flutuantes para Mini Dispositivo de Diálise	Thermo Scientific	69588
Fragmento de Klenow (3'→ 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S	Use para tampão de reação 10X na Etapa 2.1.1 e tampão de reação 1X na Etapa 2.2.2
Lambda DNA	New England BioLabs	N3011S
Mini Dispositivo de Diálise	Thermo Scientific	69570	10K MWCO, volume de 0,1 mL
NEBuffer 4	New England BioLabs	B7004S
NHS-PEG4-Biotina	Thermo Scientific	21330
Protocatecuate 3,4-Dioxigenase	Sigma-Aldrich	P8279
Ácido protocatecuico	Santa Cruz Biotechnology	sc-205818
Kit de elastômero de silicone para fabricação de PDMS	A Dow Chemical Company	4019862
Streptavidin	Sigma-Aldrich	85878
A solução de bloqueio	CANDOR Bioscience	110 050	Use como solução de bloqueio de caseína em todo o protocolo
Fita de Vinil para Sala Limpa	Fisher Scientific	19-120-3217
von Willebrand Factor, Plasma Humano	Millipore Sigma	681300
YOYO-1 Corante	AAT Bioquest	17580
Tubo de diâmetro interno de 0,25 mm	Cole-Parmer	EW-06419-00
Agulha de calibre 25	Thomas JG2505X