O acesso à infusão a longo prazo na artéria mesentérica superior (SMA) dos ratos é um procedimento cirúrgico que consiste na cannulação de um ramo proximal da SMA. A cânula sai da ferida abdominal e é encapsulada através do espaço subcutâneo de volta para a dobra interscapular.
Artigo de método
Mirando o intestino delgado do rato: infusão de longo prazo na artéria mesentérica superior
Neste artigo
Resumo
Resumo
A artéria mesentérica superior pode ser canonizada em humanos através de cateterismo radiológico minimamente invasivo da artéria femoral ou axilar. A cannulação de SMA é mais difícil em ratos devido a pequenas dimensões anatômicas. O objetivo do estudo é descrever uma técnica cirúrgica para a canulação da SMA em ratos para realizar a infusão de medicamentos a longo prazo no leito vascular da SMA em animais irrestritos, o que resultará em uma alta taxa de patência do cateter após a recuperação pós-cirúrgica por 24 horas.
Para evitar o risco de trombose SMA ou sangramento do acesso direto, um ramo proximal da SMA é isolado, ligado distralmente e cânulado com um tubo capilar de poliuretano de 0,25 mm cuja ponta é avançada perto da origem do SMA da aorta. A cânula é então encapsulada subcutâneamente para a parte de trás do pescoço do animal e através da pele através de uma válvula artificial. A porção externa da cânula é inserida em um sistema de suporte semirrígido e conectada à bomba de infusão contínua fora da gaiola onde o rato está livre para se mover.
O posicionamento correto da cânula foi demonstrado por angiografia pós-cirúrgica e achados da autópsia. A patency do cateter após 24 horas de infusão salina na região da SMA foi assegurada na maioria dos ratos pela descarga total da bomba e reconhecimento de uma cânula funcional para amostragem de sangue ou infusão salina.
Introdução
A artéria mesentérica superior (SMA) em humanos como em ratos se origina da aorta abdominal e fornece o intestino com sangue arterial do duodeno para o cólon transversal proximal. A SMA dá origem a numerosos ramos.
Após a perfusão capilar, a circulação mesentérica é drenada através da veia portal para o fígado, onde sofre metabolismo hepático antes de ser readmitida na circulação sistêmica. A canulação da SMA é útil para fins diagnósticos, embolização terapêutica e infusão de medicamentos de forma seletiva ou contínua para avaliar o efeito no intestino ou, mais importante, o metabolismo hepático e a liberação química. Em humanos, o cateterismo radiológico minimamente invasivo da SMA é realizado para tratamento endovascular1 ou infusão de drogas seletiva2 usando várias abordagens percutâneas como punção transfemoral ou transaxilar e cannulação.
Há relatos de literatura de diferentes técnicas de cannulação dos pequenos vasos abdominais: a veia mesentérica superior (SMV)3, a artéria mesentérica inferior (IMA)4, o ducto linfático mesentérico5, a artéria hepática6 ou estudos para ex vivo na perfusão intestinal7 em ratos. Em comparação com o lado venoso, a canulação da SMA em ratos é muito mais exigente devido aos riscos simultâneos de trombose e sangramento, desde que sua alta pressão. Em particular, surgem problemas no caso da canulação estiver em operação quando o rato acorda da anestesia no leito cirúrgico e muito mais se o experimento requer um animal livre em uma gaiola após a cirurgia.
Um artigo recente descreveu a cannulação da SMA como parte do experimento (medida da pressão arterial) em um animal sob anestesia8. No entanto, nenhuma técnica é descrita na canulação cirúrgica da SMA para infusão a longo prazo em um animal irrestrito. O objetivo deste manuscrito é descrever passo a passo uma técnica cirúrgica para a cannulação de longo prazo da SMA através de um ramo proximal, que permite a infusão seletiva de drogas no leito mesentérico por pelo menos 24 horas (e mais). Como uma canulação constante e resistente requer ligação permanente e fechamento do vaso onde o cateter é inserido, esta técnica evita inserir o cateter diretamente no SMA9 e se aproxima do vaso através da canulação de um ramo proximal, o mais proximal possível para a própria origem do SMA da aorta. A infusão proximal permite que a droga infundida atinja a cama anatômica mais larga possível, sem fechar o fluxo sanguíneo através do vaso principal.
A técnica de cannulação de SMA de rato tem muitas aplicações. Seria possível administrar drogas seletivamente no compartimento arterial mesentérica para obter ação local no nível gastrointestinal e evitar efeitos sistêmicos e metabolismo hepático de drogas. O modelo de rato canulado SMA tem vantagens em relação a modelos animais maiores: é menos caro, é eticamente aceitável, e é mais fácil de executar e aprender. A cirurgia de cannulação SMA também é mais fácil de executar no modelo de rato em comparação com o modelo do mouse.
Protocolo
Os estudos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo Comitê de Ética animal local (Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma) e foram conduzidos de acordo com o Ministério da Saúde italiano.
1. Preparação da cânula para inserção no ramo proximal da SMA
- Corte a cânula maior de 0,93 mm de O.D, 0,5 mm de identidade ao comprimento necessário (cerca de 30 cm).
- Corte a cânula menor (0,4 mm de O.D, 0,25 mm I.D.) para cerca de 5 cm de comprimento e insira-a 1 cm na cânula maior.
- Fixar as duas cânulas juntas por cola cianoacrilato, evitando a oclusão do lúmen.
- Conecte a extremidade livre da cânula maior a um adaptador Luer stub (23 G) montado em uma seringa de 1 mL cheia de solução salina.
- Afie a ponta livre da cânula menor com uma tesoura para facilitar a inserção do cateter no ramo do SMA.
- Verifique a patency da cânula lavando com solução salina.
NOTA: A extremidade afiada da cânula não danificará a artéria durante o movimento do animal porque ela será fixada e não deslizará ao longo do vaso.
2. Preparação do rato para o procedimento cirúrgico
- Realizar anestesia intramuscular com cetamina/xilazina (100/10 mg/kg).
NOTA: A profundidade anestésico suficiente é julgada pela ausência ou quase ausência do reflexo da pata-pinch. - Raspe a pele das regiões cirúrgicas: o abdômen para o ramo da canulação SMA, e a parte de trás do pescoço para a saída da cânula.
- Limpe as regiões cirúrgicas asepticamente usando um reflexo cirúrgico da pinça da pata.
NOTA: Toda a preparação deve ser realizada com técnica asséptica. - esfregar ou solução aplicada em movimento circular, seguida de soro fisiológico estéril ou 70% de etanol, 3 vezes.
- Coloque o animal em uma posição supina, imobilizando os quatro membros.
3. Cannulação de um ramo proximal da SMA
- Certifique-se de profundidade anestésico adequada testando o reflexo da pinça antes da incisão.
- Aplique uma cortina cirúrgica estéril e resistente à água.
- Com uma lâmina de bisturi, abra a parede abdominal com uma incisão de 3 cm retas na linha média da região mesogástrica através de todos os planos abdominais no peritônio.
- Coloque gazes, encharcadas com solução salina, ao redor da incisão de laparotomia em cima da cortina cirúrgica. Use suturas para manter a incisão cirúrgica aberta.
NOTA: Todos os cotonetes e instrumentos cirúrgicos devem ser estéreis. - Use cotonetes de algodão para identificar e expor o intestino delgado. Siga sua disposição natural para identificar a mesenteria. Extrair o mesentery do corte laparotômico e colocá-lo para baixo sobre as gazes (Figura 1A).
- Identifique o SMA sentindo a pulsação.
- Use os cotonetes de algodão para "abrir caminho" entre a gordura mesentérica e descobrir o SMA e 2-3 de seus ramos proximais.
- Escolha um ramo proximal do SMA suficientemente grande para permitir as manobras cirúrgicas de cannulação. Amarre este ramo (com uma sutura de seda 4-0) 3-4 cm a jusante de sua origem para permitir que sua expansão mantenha as extremidades da sutura tempo suficiente para ser manipulada mais tarde.
- Coloque um suporte rígido sob o ramo do SMA. A alça dos fórceps cirúrgicos é suficiente aqui.
- Segure a extremidade da cânula menor (ligada à cânula maior na extremidade oposta) com a mão dominante usando fórceps e puxe as extremidades da sutura com a outra mão para coar o vaso e facilitar a entrada do cateter (Figura 1B).
- Segure a ponta da cânula em um ângulo de 20° do plano do vaso na direção oposta ao fluxo sanguíneo.
- Pressione levemente a ponta para penetrar na parede da artéria e insira a cânula.
NOTA: A canulação é realizada sem cortar a artéria; a ponta do cateter quebrará a parede do vaso e facilitará a entrada. O sangue que flui de volta para a cânula confirma a inserção correta. - Continue a inserção da cânula por mais 1 cm no ramo arterial próximo à origem da SMA.
- Fixar a cânula na artéria com um nó cirúrgico (4-0 de seda) e verificar seu funcionamento correto lavando 1 mL de solução salina estéril ou com uma amostragem de sangue.
4. Túnel da cânula e colocação no sistema de suporte de infusão
- Coloque uma cortina cirúrgica estéril na incisão antes de mudar a posição do animal.
NOTA: O túnel das costas para o abdômen é criado exercendo pressão no espaço subcutâneo com um instrumento cirúrgico pontiagudo. Deve ser utilizada uma cortina cirúrgica estéril no abdômen e nas costas. - Faça uma incisão de 1 cm da região posterior do pescoço e acomode uma válvula esférica.
- Passe a cânula do acesso à laparotomia à válvula colocada no pescoço através de tecidos subcutâneos (Figura 2A). Feche a extremidade distal da cânula com um plugue de cateter para evitar a entrada de ar.
- Substitua o intestino delgado na cavidade abdominal. Feche a parede abdominal e feche as incisões da pele com uma sutura contínua de seda 3-0.
- Fixar a válvula na pele do pescoço com pontos. Feche as incisões da pele com uma sutura contínua de seda 3-0.
5. Gestão pós-operatória
- Vista o rato com uma jaqueta para proteger a válvula do botão. Proteja a parte exposta da cânula com uma haste de aço durante a infusão e fixe-a na válvula (Figura 2B).
NOTA: Uma vez que a cirurgia é realizada sob técnica asséptica, os antibióticos não são indicados. O NSAID deve ser administrado pré-operacionalmente para controle da dor (5 mg/mL Meloxicam injetável, 1 mg/kg uma vez por dia por até 3 dias). Após a operação, estabilize o rato em uma gaiola metabólica para o momento da infusão (24h). Em seguida, re-anestesiar o rato com inalação de isoflurano pelo tempo necessário para desmontar o sistema de infusão. Posteriormente, é possível abrigar o rato em uma gaiola normal com um ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso livre a comida e água. - Estabilize o rato em uma gaiola metabólica para o tempo de infusão. O rato agora está acordado e livre para se mover e comer na gaiola.
- Conecte a extremidade distal da cânula a uma bomba elastomérica (100 mL de volume máximo, taxa de fluxo de 5,0 mL/h) preenchida com 50 mL de solução salina estéril. Proceda com infusão por 24 horas (Figura 2C).
- No primeiro dia, administre antibióticos intramusculares (enrofloxacina 10 mg/kg para as primeiras 24 h) e depois passe para administração oral (enrofloxacina 100 mgs em 500 mL em água potável). Dispense a terapia analgésica intramuscularmente durante o despertar (cetoprofeno 5,0 mg/kg) e nos dias seguintes oralmente (paracetamol 200 mgs em água potável).
NOTA: Diluir a terapia oral administrada em água potável para obter um sabor suportável. Monitore a medição e hidratação do peso corporal. - No final do tempo de infusão (24 horas) desmonte o sistema de infusão externa do animal removendo a bomba, a jaqueta, a haste de aço e a válvula do rato. Feche e corte a cânula quando sair do pescoço, deixando esta extremidade sob a pele do pescoço após a sutura da ferida.
NOTA: Nesta fase pode ser necessário anestesiar ratos por alguns minutos por inalação de isofluorano. - Abriga o rato, individualmente, em uma gaiola normal com um ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso livre a comida e água.
NOTA: A ingestão de alimentos pós-operatórios na linha de base é de cerca de 30 g./dia A ingestão de água da linha de base é de cerca de 50 ml/dia. O peso médio deve ser de cerca de 400 mgs.
Resultados
Neste estudo, o procedimento foi realizado em 15 ratos. Ao final de 24 horas de infusão salina, não foram observados sinais de soro fisiológico ou perda de sangue nas gaiolas metabólicas e a ferida abdominal estava limpa em todos os animais, assim como as gaiolas.
Nas gaiolas normais, os ratos foram observados durante 5 dias com monitoramento diário do peso e da ingestão de água/alimentos. Durante esse período, a condição geral dos animais no exame bruto foi boa, sem indícios de anormalidades comportamentais. Todos os ratos imediatamente após a cirurgia começaram a se alimentar novamente. A ingestão diária média de alimentos e água aumentou progressivamente até o normal após 3 dias, como mostrado nas Figuras 3A e 3B, respectivamente. Na Figura 3C, é possível ver que o ganho de peso foi regular, aumentando gradualmente até o final do período de observação. Não houve alterações nos movimentos intestinais e as fezes diárias e a saída de urina foram normais.
Após 24 horas, houve resíduo salino (respectivamente, 40 mL e 20 mL) em apenas 2 bombas preenchidas com 50 mL de solução salina, enquanto todas as outras (86,7%) estavam vazias. Além disso, após esse período de infusão, 12 cânulas (80%) ainda estavam funcionais tanto para amostragem de sangue quanto para infusão salina (5 mL), enquanto 3 cânulas não eram mais patente (2 delas eram as cânulas conectadas às bombas com resíduo) (Tabela 1).
Na necropsia, 100% das cânulas (n=15) ainda estavam localizadas no ramo da SMA e nenhum rato apresentava sinais de isquemia intestinal (Figura 4B) ou hemorragia intrabdominal. As 3 cânulas ocluídas foram encontradas dobradas respectivamente a 0,5 cm, 1 cm e 1,5 cm da inserção no ramo SMA. Esse fenômeno deve-se provavelmente aos movimentos dos animais nas gaiolas.
Em 5 ratos, imediatamente após o procedimento e antes da conexão da bomba, 2 mL de meio de contraste iodinaado foram injetados na cânula mesentérica, para obter uma angiografia através de um intensificador de imagem (a angiografia foi realizada intraoperatória). Em cada rato (n=5), foi possível ver o círculo arterial mesenérico e o SMA e seus ramos principais sem contraste se espalhando no abdômen como mostrado na Figura 4A. Isso confirmou que a cânula estava bem colocada e fixada no ramo da SMA.
Figura 1: Fotografias experimentais. (A) O intestino delgado seguindo sua disposição natural em uma gaze (é possível visualizar a SMA com todos os ramos); (B) O operador que insere a cânula no ramo SMA. É necessário ter um suporte sólido sob a nave para garantir a inserção do tubo. A sutura de seda distal fecha o vaso e a proximal fixa o cateter dentro do galho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sistema de suporte de infusão. (A) Uma vez encapsulada subcutânea, a cânula emerge da região posterior do pescoço através da válvula branca; (B) Um rato usando uma jaqueta para estabilizar a válvula branca. Uma haste de aço protege o cateter durante a infusão. (C) Representação diagramatica de um rato alojado em uma gaiola metabólica durante a infusão de soro fisiológico com uma bomba elastomérica conectada à cânula que sai da haste de aço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados representativos para ingestão de alimentos, ingestão de água e ganho de peso de ratos (n=15) em período de observação de 5 dias. A ingestão média diária de alimentos (A) e água (B) aumenta progressivamente, e estabiliza-se em níveis fisiológicos após 3 dias. O ganho médio de peso (C) aumenta gradualmente até o final do período de observação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fotografias de (A) a angiografia de contraste da região arterial mesentérica após infusão de contraste através da cânula (prova de cânula adequadamente colocada) e (B) a cânula ainda bem posicionada durante a autópsia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Bomba elastomérica | Cânula | |||
| Vazio | Com resíduo | Patente | Não patente | |
| n=15 | 13 | 2 | 12 | 3 |
| % | 86.7 | 13.3 | 80 | 20 |
Tabela 1: Descargas de bomba elastoméricas e patência de cânula após 24 horas de infusão salina. A patency foi testada por extrair sangue com uma seringa e infundir 5 mL de soro fisiológico na cânula.
Discussão
A principal vantagem deste modelo de infusão de SMA de rato é sua firmeza e durabilidade por pelo menos 24 horas na grande maioria dos animais. A infusão de anti-coagulante pode alongar este intervalo de tempo. O modelo permite uma infusão confiável de drogas seletivamente na região mesentérica, visando o intestino delgado e a parte proximal do cólon.
Vários passos são fundamentais para o sucesso da técnica. Para alcançar a canulação em um vaso muito pequeno é importante selecionar ratos pesando pelo menos 400 g; o sexo e a idade não são relevantes. Também é importante escolher os instrumentos cirúrgicos corretos e o tipo de cânula. Aqui, uma cânula de poliuretano menor (0,4 mm de O.D, 0,25 mm I.D.) é inserida 1 cm na cânula maior (0,93 mm de O.D, 0,5 mm de I.D.) para obter um cateter funcional e útil para permitir ambas as conexões à pequena artéria e ao sistema de infusão maior.
O primeiro passo crítico cirúrgico é a limpeza do SMA e do ramo identificado para cannulação do tecido adiposo circundante (etapa 3.5). Isso ajuda a evitar a inserção da cânula entre o tecido e a artéria, o que é um erro comum. No entanto, esta etapa de limpeza é difícil, pois o pequeno ramo da SMA é frágil e fácil de danificar. Se o ramo estiver ferido, é possível parar o sangramento por ligadura e escolher um ramo proximal diferente, para não desperdiçar o animal.
Para evitar a formação de bolhas de ar dentro da cânula e evitar embolias gasosas, a cânula deve ser preenchida com soro fisiológico até a ponta antes da inserção no ramo. Para fixar a cânula no lugar, a aplicação de rosca cirúrgica (4-0 de seda) deve estar entre o ponto de inserção na artéria e a ponta da cânula, diretamente em cima do vaso ao redor do cateter. O nó cirúrgico deve ser apertado o suficiente para fixar a cânula, mas não muito apertada para oclui-la (passo 3.12).
A melhor maneira de garantir uma cannulação correta é ver o fluxo sanguíneo de volta através da cânula (passo 3.10). Em termos de solução de problemas, se isso não ocorrer, pode ser devido às seguintes razões:
a cânula não foi corretamente inserida na artéria;
a cânula está dentro da artéria, mas ocluída pelo nó em uma posição incorreta;
a cânula está dentro da artéria e uma bolha de ar na cânula está diminuindo o fluxo;
um coágulo se formou dentro da cânula.
Uma inserção incorreta pode ser devido ao posicionamento da cânula no espaço entre a artéria e o tecido adiposo. Neste caso, é necessária a reinserção. Quando o nó acima do vaso oclui a cânula, é possível desamarrá-la com muito cuidado e refazê-la. Pequenas bolhas de ar no cateter geralmente não comprometem a cannulação e não correm risco de vida; mas se houver uma grande bolha de ar na cânula é necessário retirar a cânula usando a seringa ou re-posicionar o cateter em um ramo diferente. Normalmente, é possível evitar a formação de coágulos e manter a patente da cânula infundindo 0,2 mL de soro fisiológico de vez em quando durante a operação.
Uma limitação deste estudo é uma subavaliação da patência da cânula em tempos mais longos de infusão: aqui, foi realizada uma infusão de 24 horas enquanto ratos alojados em uma gaiola metabólica. Para obter um período de infusão mais longo, pode ser útil o uso de terapia anticoagante, não administrada neste estudo. No entanto, durante a infusão, o rato deve ser alojado na gaiola metabólica porque é o único que suporta o sistema de infusão. Este local é desconfortável para o animal que pode ser estressado se tratado por um período mais longo. Além disso, apenas a solução salina foi utilizada para infusão, portanto não há resultados sobre a administração específica de medicamentos. Uma limitação do método é a impossibilidade de infundir nos ramos arteriais (se presentes) acima do utilizado para o cateter. Por essa razão, recomenda-se a canonização do ramo mais próximo da aorta.
Nenhum outro modelo de infusão de longo prazo da SMA de rato para animais sem restrições está presente na literatura. Em comparação com o modelo de cannulação do IMA descrito há muitos anos4, a técnica descrita aqui tem um alvo experimental mais amplo porque permite a infusão de drogas na área de perfusão de SMA e não se limita ao cólon. Recentemente, pela primeira vez, a canulação seletiva de um ramo da SMA foi usada para infusão de toxina botulínica diretamente na região mesentérica arterial para estudar o efeito no músculo liso intestinal10, mas muitas outras drogas poderiam ser testadas no futuro. Por exemplo, anticoagulantes podem ser infundidos para estudar trombose mesentérico, ou drogas com uma ação de microbiota intestinal11 ou até mesmo drogas para doenças inflamatórias intestinais12. A infusão intra-arterial é útil para estudos de metabolismo intestinal em particular, porque o efeito da droga é inestimável antes que o sangue passe pela circulação do portal onde está sujeito ao metabolismo hepático.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer o Cen.Ri.S. (Centro di ricerche sperimentali) da Università Cattolica del Sacro Cuore em Roma para licenças.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Porta-agulhas Crile-Wood | 2Biological Instruments | Forma da Ponta: Reta; Largura da ponta: 2 mm; Comprimento de fixação: 14 mm; Bloqueio: Sim; Tesoura: Não; Liga / Material: Aço Inoxidável; Comprimento: 15 cm; Serrilhado: Sim | |
| Pinça Graefe Extra Fina | 2Instrumentos Biológicos | Largura da ponta: 0,5 mm; Dimensões da ponta: 0,5 x 0,5 mm; Liga / Material: Aço Inoxidável; Comprimento: 10 cm | |
| Luer Stub Adapter | BD Intramedic | 23 gauge para utilização com tubos 427410 | |
| Válvula de membrana | Biomed | Mod 617 | |
| Cateter de poliuretano | ENKI | diâmetro externo: 0,4 mm, diâmetro interno: 0,25 mm | |
| Cateter Silastic Tubing de laboratório | Healthcare industries | 508-002 | |
| Tesoura de mola | 2Instrumentos Biológicos | Forma da Ponta: Angular; Pontas: Afiadas; Liga / Material: Tesoura cirúrgica de estudante de aço inoxidável | |
| 2Instrumentos | biológicos | Forma da ponta: reta; Liga / Material: Aço Inoxidável Estudante; Serrilhado: Não; Característica: Qualidade do Aluno |
Referências
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Reimpressões e permissões
