Este protocolo descreve um método para montar larvas drosophila para alcançar mais de 10 h de imagens ininterruptas de lapso de tempo em animais vivos intactos. Este método pode ser usado para visualizar muitos processos biológicos próximos à parede do corpo larval.
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Artigo de método
LarvaSPA, um método para montagem de larva drosophila para imagem de lapso de tempo de longo prazo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imagens vivas são uma abordagem valiosa para investigar questões de biologia celular. A larva Drosophila é particularmente adequada para imagens ao vivo ao vivo porque a parede do corpo larval e a maioria dos órgãos internos são transparentes. No entanto, imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por mais de 30 min têm sido desafiadoras porque é difícil imobilizar larvas não invasivamente imobilizadas por muito tempo. Aqui apresentamos um método de montagem larval chamado LarvaSPA que permite imagens contínuas de larvas Drosophila vivas com alta resolução temporal e espacial por mais de 10 horas. Este método envolve anexar parcialmente larvas ao deslizamento de cobertura usando uma cola uv-reativa e também restringir o movimento larval usando um bloco de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método é compatível com larvas em estágios de desenvolvimento de segunda instar a terceira instar vagando. Demonstramos aplicações desse método no estudo de processos dinâmicos de neurônios somatosensoriais Drosophila, incluindo crescimento dendrito e degeneração induzida por lesões. Este método também pode ser aplicado para estudar muitos outros processos celulares que acontecem perto da parede corporal larval.
Introdução
A imagem ao vivo por lapso de tempo é um método poderoso para estudar processos celulares dinâmicos. As informações espaciais e temporais fornecidas por filmes de lapso de tempo podem revelar detalhes importantes para responder a perguntas de biologia celular. A larva Drosophila tem sido um modelo popular in vivo para investigações usando imagens vivas porque sua parede corporal transparente permite imagens não invasivas de estruturas internas1,2. Além disso, inúmeras ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila para rotular fluorescentemente estruturas anatômicas e macromoléculas
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Protocolo
1. Fazendo a câmara de imagem
- A estrutura metálica pode ser construída a partir de um bloco de alumínio em uma loja de máquinas típica. As especificações do quadro são ilustradas na Figura 1A.
- Para construir a câmara de imagem, veda a parte inferior da estrutura metálica usando um deslizamento de cobertura longo (22 mm x 50 mm) e cola UV(Figura 1A). Cure a cola UV usando uma lâmpada UV portátil.
2. Fazendo cuboides PDMS
- Prepare o molde para cuboides PDMS.
- Conecte camadas de fita de embalagem à superfície ....
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Resultados
A câmara de imagem larva é construída colando uma estrutura metálica feita medida e dois coverslips juntos. O design da estrutura metálica é especificado na Figura 1A. Larvas de drosophila dentro da câmara são aderidas ao deslizamento de cobertura superior com o auxílio de cola UV e cuboides PDMS. O sulco no cuboide PDMS e a fita dupla lateral o cuboide é anexado para criar o espaço para segurar as larvas(Figura 1B,C). O PDMS também aplica press.......
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Discussão
Aqui descrevemos larvaspa, um método versátil de montagem larvas drosophila vivas para imagens de lapso de tempo a longo prazo. Este método não requer recuperação ou remontagem de larvas, permitindo imagens ininterruptas. Por isso, é ideal para acompanhar processos biológicos que levam horas para serem concluídos, como degeneração e regeneração. Este método também pode ser usado para imagens de dinâmica scalcicelular e eventos subcelulares, como o crescimento de microtúbulos. Como a parede do corpo larval é está.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Lingfeng Tang por estabelecer uma versão anterior do método LarvaSPA; Glenn Swan na loja Cornell Olin Hall Machine para fazer protótipos anteriores da câmara de imagem; Philipp Isermann para a construção de esquadrias metálicas e sugestões sobre a fabricação de cuboides PDMS; Instalação de imagem cornell BRC para acesso a microscópios (financiada pelo NIH grant S10OD018516); Maria Sapar para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa Cornell concedida a H.J.; um fundo inicial de Cornell e subvenções nih (R01NS099125 e R21OD023824) concedidos a C.H. H.J. e C.H. conceberam o projeto e projetaram os experimentos. H.J. conduziu os....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 6061 Barras de alumínio | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| Fita dupla face 3M | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Fita de Embalagem Scotch | 3M | 1.88"W x 22.2 Jardas | |
| DUMONT #3 Fórceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Lamínula de Vidro | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurano | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Microscópio Confocal Leica | SP8 equipado com um ressonante scanner | ||
| Papel para lentes | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Placas de Petri (médias) | VWR | 25373-085 | |
| Placas de Petri (pequenas) | VWR | 10799-192 | |
| Lâmina de barbear | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Placa de Petri retangular | VWR | 25384-322 | |
| Kit SYLGARD 184 (kit PBMS) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Pipeta de transferência | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| cola UV | Norland products | #6106, NOA 61 | Índice de refração 1.56 |
| Lâmpada UV (Workstar 2003) | Maxxeon | ||
| vácuo | Microscopia Eletrônica Sciences | 71232 | |
| Toalhetes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
Referências
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.....
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Reimpressões e permissões
