Summary
Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.
Abstract
Las imágenes en vivo de la proteína de membrana asociada al pHluorin etiquetada Soluble N-etillmaleimida-factor Accesorio REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana asociada al Vesículo 7 (VAMP7) por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) es una manera sencilla de explorar la secreción del compartimento lisosomal. Aprovechando el cultivo celular en superficies micropatrieras para normalizar la forma celular, se emplearon una variedad de herramientas estadísticas para realizar un análisis espacial de los patrones secretores. Usando la función K de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana (NND), confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio, sino que muestra clustering significativo. Cabe destacar que nuestro análisis reveló que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas de no adherencia, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Aún así, descubrimos que la adhesión celular mejora la agrupación en clústeres. Además de las áreas adhesivas y nodhesivas definidas con precisión, la geometría circular de estos micropatrón permite el uso de coordenadas polares, simplificando los análisis. Utilizamos la estimación de densidad de núcleo (KDE) y la función de distribución acumulativa en coordenadas polares de eventos de exocitosis para identificar áreas enriquecidas de exocitosis. En las células de micropatrón en forma de anillo, la agrupación se produjo en el borde entre las áreas adhesivas y nodhesivas. Nuestro análisis ilustra cómo se pueden emplear herramientas estadísticas para investigar las distribuciones espaciales de diversos procesos biológicos.
Introduction
La exocitosis es un proceso celular universal en el que una vesícula se fusiona con la membrana plasmática y libera su contenido. La vesícula puede fusionarse totalmente con la membrana plasmática (fusión completa) o crear un poro de fusión que permanece abierto durante un tiempo limitado (beso y carrera)1. Por ejemplo, las proteínas recién sintetizadas se liberan en el medio extracelular a partir de vesículas que provienen del complejo Golgi. Esta vía biosintética y anterograda es primordial, especialmente en organismos multicelulares, para secretar péptidos de señalización (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores) y componentes de matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), así como para traficar proteínas transmembranas a la membrana plasmática. Además, las secreciones pueden ocurrir de diferentes endosomas: 1) reciclar endosomas con el fin de reutilizar las proteínas transmembranas; 2) cuerpos multivesiculares (MVB) para liberar exosomas; y 3) lisosomas para la liberación de enzimas proteolíticas. Se ha demostrado que la secreción endosomal es importante para el crecimiento de la neurita, la formación de pseudopodias, la reparación de la membrana plasmática y la señalización dependiente de ATP2.
Para estudiar la exocitosis a nivel de una sola célula, se han empleado varias técnicas. Patch-clamp permite la detección de eventos de exocitosis individuales con una alta resolución temporal en una amplia variedad de células vivas3. Sin embargo, este método no proporciona información sobre la localización de eventos de exocitosis, ni desde qué compartimiento se produce. La microscopía electrónica permite la visualización directa de eventos excíticos con alta resolución espacial, y en combinación con el inmunoetiquetado proporciona información sobre la especificidad de los compartimentos y moléculas involucrados. Una desventaja de este enfoque es la falta de información sobre la dinámica del proceso, así como su incapacidad para realizar estudios de alto rendimiento. Los enfoques de microscopía ligera, como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), que explota el campo evanescente para iluminar los fluoróforos en las proximidades del cubreobjetos (100 nm), proporciona una buena resolución temporal y espacial para estudiar eventos de exocitosis. Sin embargo, este método sólo es compatible con las células adherentes y sólo se puede aplicar a la parte ventral/inferior de las células.
Cabe destacar que la membrana plasmática revela una heterogeneidad significativa basada en complejos adhesivos que están presentes sólo en áreas restringidas. Esta heterogeneidad restringe, por ejemplo, la captación de diferentes ligandos4. Del mismo modo, recientemente se ha informado de que la secreción del complejo Golgi se concentra en "puntos calientes" en la membrana plasmática5. Además, se sabe que ciertas cargas se secretan a través de la exocitosis asociada a la adhesión focal6. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la cuestión de si los eventos de exocitosis se distribuyen aleatoriamente en el espacio, o si se concentran en áreas específicas de la membrana plasmática. Se han propuesto varias herramientas estadísticas basadas en la función K de Ripley para explorar estas preguntas7,,8,,9. Nuestro enfoque combina estas herramientas con micropatrón para controlar la forma celular y la heterogeneidad de la membrana plasmática. Además de proporcionar un medio para distinguir entre áreas adhesivas y no adhesivas, esta técnica también permite la comparación entre diferentes células y condiciones y aumenta el poder de los análisis estadísticos.
Aquí empleamos una variedad de herramientas estadísticas para estudiar la distribución espacial de eventos de exocitosis desde el compartimiento lisosomal monitoreado por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células hTert-RPE1 normalizadas en forma de anillo. Se confirmó que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio8,9 y que los eventos de exocitosis exhiben agrupación. Cabe destacar que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas no nadhesivas, lo que indica que las moléculas de adhesión no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Sin embargo, la adhesión celular mejoró la agrupación en clústeres. Consistentemente, nuestro análisis identificó áreas enriquecidas de exocitosis que se encontraban en la frontera entre las áreas adhesivas y no nadhesivas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de células micropatrnadas
- Transfección de células
- Un día antes de la transfección, la semilla 2,5 x 106 hTERT-RPE1 células en un pocero de una placa de 12 pozos (2 x 2 cm) en 1 ml de medio.
- El día de la transfección, preparar la mezcla de transfección con plásmido VAMP7-pHluorin (100 l de tampón, 0,8 g de ADN, 3 l de mezcla de transfección). Incubar durante 10 min.
NOTA: VAMP7 es un lysosomal v-SNARE, fusionado con una etiqueta de pHluorin luminal. La sonda de pHluorin se apaga por pH bajo, pero durante la exocitosis se liberan protones y la pHluorina comienza a emitir una señal10,,11. - Agregue la mezcla de transfección a las células en su medio.
- Cambie el medio 4 h después de añadir la mezcla de transfección en las células.
- Utilice las células para experimentos durante las próximas 24–48 h.
- Preparación de micropatrón (método de fotolitografía)
- Lavar los cubreobjetos (25 mm de diámetro) en etanol y dejarlos secar durante 5 min.
- Activar los cubreobjetos mediante la iluminación bajo UV profundo durante 5 min.
- Cree una cámara húmeda humidificando completamente una toalla de papel en la que se coloca una película de parafina. Añadir gotas (30 ml para el cubreobjetos de 22 mm) de la solución de poli-L-lisina-injerto-polietileno glicol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH a 7,4) y colocar cubreobjetos con la superficie activada en ellos. Cierre la cámara húmeda con una parte superior e incubar los cubreobjetos durante 1 h.
- Lavar los cubreobjetos 2x en PBS y 1x en agua destilada y dejar que se sequen.
- Lave la fotomasca de cuarzo con agua destilada y luego con etanol o propanol. Seque la fotomasca con flujo de aire filtrado.
NOTA: La fotomasca de cuarzo está recubierta en un lado con cromo antirreflecttivo que contiene agujeros en forma de micropatrón. En este protocolo se utiliza una fotomasca que contiene micropatrones en forma de anillo de 37 m. Cuando uv profundo es brillante en la fotomasca, la luz sólo puede pasar a través de estos agujeros12. - Exponga la fotomasca (lado cromado) a UV profundo durante 5 minutos para limpiar la superficie.
- Agregue pequeñas gotas de agua (10 ml para un cubreobjetos de 20 mm) en el lado cromado de la fotomasca. Coloque el cubreobjetos con su lado tratado con PLL-g-PEG en la gota y seque el agua extra. Asegúrese de que no se formen burbujas de aire entre la máscara y los cubreobjetos.
NOTA: La fuerza capilar del agua inmovilizará los cubreobjetos. - Exponga la fotomasca a UV profundo durante 5 minutos con el lado no cromado hacia arriba (los cubreobjetos están unidos en la superficie inferior).
NOTA: La luz sólo puede pasar a través de los orificios y modificar la superficie tratada con PLL-g-PEG de los cubreobjetos debajo de la fotomasca. - Retire los cubreobjetos de la fotomasca añadiendo el exceso de agua.
NOTA: Los cubreobjetos deben flotar rápidamente. - Incubar los cubreobjetos en una solución de proteínas de matriz extracelular (50 g/ml de fibronectina, 5 g/ml de fibrinógeno fluorescente diluido en agua) sobre película de parafina en una cámara húmeda (como en el paso 1.2.3) durante 1 h bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
NOTA: El experimento se puede pausar en este punto almacenando los cubreobjetos en PBS a 4 oC.
- Siembra celular en superficies micropatrnadas
- Utilice un soporte de cubreobjetos magnético que se ajuste al tamaño de los cubreobjetos micropatrnados para montar los cubreobjetos. El día de la adquisición, caliente el soporte de cubreobjetos a 37 oC para evitar el choque térmico de las células durante los pasos posteriores.
- Preparar el medio de patrón complementando el medio DMEM/F12 con 20 mM HEPES y 2% de penicilina/estreptomicina.
- Coloque los cubreobjetos en el soporte con el lado micropatrnado hacia arriba y agregue el medio de patrón tan pronto como el cubreobjetos esté en la base del soporte. Agregue el sello e inmovilice con el dispositivo magnético. Llene el soporte del cubreobjetos con el medio de patrón y ciérrelo con la tapa de vidrio.
NOTA: Sea rápido, para no permitir que el cubreobjetos se seque. No lave el soporte de cubreobjetos con etanol entre experimentos, ya que el sello podría retener un poco de etanol, que puede reaccionar con PLL-g-PEG y provocar estrés celular. Lave el soporte del cubreobjetos solo con agua jabonosa. Por otra parte, la articulación se puede incubar en el medio de patrón a 37 oC durante 1 h para diluir el producto residual. - Recoger las células hTERT-RPE1 transfectosas por tripsinización (0,5 ml para una placa de 12 pozos) y añadir 1 ml de 10% FBS DMEM/F12 medio.
- Agregue 0,5 x 106 células hTERT-RPE1 transfectadas al soporte del cubreobjetos y vuelva a cerrarlo. Incubar durante 10 min en la incubadora.
- Lavar el soporte de cubreobjetos 5x con un medio de patrón para eliminar las células noinuadas y el FBS residual añadiendo el medio de patrón con una pipeta y aspirando el medio con otra pipeta para crear un flujo de lavado. Mantenga siempre un pequeño volumen de patrón medio en el soporte del cubreobjetos para evitar el secado de las células en el cubreobjetos micropatrnados, lo que conducirá a la muerte celular.
- Incubar en la incubadora durante 3 h para permitir la propagación de células completas.
2. Adquisición de datos de exocitosis
- Imágenes de eventos de exocitosis
- Coloque el soporte de cubreobjetos bajo un TIRM. La señal tiene que ser detectada por una cámara sensible configurada con el mejor formato de imagen disponible.
NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de lente 100x y una cámara EMCCD con una región de detección de 512 x 512 píxeles que daba lugar a un tamaño de píxel de 160 nm. - Busque una celda que exprese VAMP7-pHluorin que esté completamente extendida (Figura 1A).
NOTA: Las celdas que expresan VAMP7 son claramente identificables, porque exhiben una señal verde. - Cambie el ángulo del láser hasta que se alcance un ángulo TIRF que permita la visualización de eventos de exocitosis VAMP7-pHluorin. Realizar una adquisición de 5 minutos a una frecuencia compatible con la velocidad de exocitosis y la escala de tiempo (normalmente 3 Hz, Figura 1D) utilizando el software del microscopio.
NOTA: Las células hTERT-RPE1 tienen una tasa de secretoría lisosomal de alrededor de 0,3 Hz en micropatrón. La exocitosis lisosomal tiene una duración típica de 1 s. Se caracteriza por una intensidad máxima seguida de una decadencia exponencial. La difusión de la sonda debe ser evidente en este momento(Figura 1B, C). - Para cada célula, también realice una adquisición del micropatrón utilizando el software del microscopio (Figura 1A).
- Coloque el soporte de cubreobjetos bajo un TIRM. La señal tiene que ser detectada por una cámara sensible configurada con el mejor formato de imagen disponible.
- Adquisición de coordenadas de exocitosis
- Abra la película adquirida con ImageJ/FIJI. Usar archivo ?? Importación ? Secuencia de imágenes. Encuentra eventos de exocitosis por ojo. Un evento de exocitosis se caracteriza por la aparición de una señal brillante que se extiende hacia afuera (Figura 1).
- Utilice la herramienta de punto para marcar el centro del evento exocítico. Usar analizar ( Use Analyze) Medir para medir las coordenadas X e Y, así como la coordenada temporal (número de sector). Realice estas mediciones para todos los eventos de exocitosis de la película.
- Guardar los resultados (Resultados ? Archivo ? Guardar como). Prepare un archivo de texto para cada celda analizada denominada "Results(cell_name).txt" que contenga el sector, las coordenadas X y las coordenadas Y para todos los eventos de exocitosis en ese orden.
Se supone que el archivo de texto tiene este aspecto:
Radio de diámetro de ID X Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOTA: Tenga cuidado de reemplazar todas las comas por puntos. - Mida el centro y el diámetro de cada celda usando la"Herramienta Oval". Ajuste un círculo perfecto (no utilice un óvalo) y use"Medida"para obtener las coordenadas X e Y y el diámetro de Feret. Guarde la identidad de cada celda (ID), las coordenadas X e Y, el diámetro y el radio de Feret (diámetro/2) en un archivo de texto denominado "Spherical parameter.txt".
Se supone que el archivo de texto tiene este aspecto:
Radio de diámetro de ID X Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOTA: Tenga cuidado de reemplazar todas las comas por puntos. - Mida el grosor del anillo de micropatrón (longitud de adhesión) con la herramienta recta y guarde el ID de celda, el radio de celda (del archivo: "Parámetro esférico.txt") y la longitud de adhesión en un archivo de texto denominado "Parámetro de patrón.txt". Calcule la longitud de adhesión normalizada dividiendo la longitud de adhesión por el radio de celda.
NOTA: Tenga cuidado de reemplazar todas las comas por puntos.
El archivo debe tener este aspecto:
Longitud de adhesión del radio de la célula ID Longitud de adhesión normalizada
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826
3. Análisis espacial de una sola célula
- Paquete R e instalación
NOTA: El paquete R para este análisis aprovecha el paquete13 de Spatstat para calcular la densidad bidimensional (2D) y la función K de Ripley. El código es de código abierto y utiliza archivos de texto que se han descrito anteriormente.- Descargar e instalar R desde https://www.r-project.org/ (la versión 3.5.2 se utilizó en este análisis).
- Descargue el paquete (y el conjunto de datos de demostración) de: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Instale el paquete en R Studio utilizando "Herramientas" usando "Instalar paquetes". Seleccione "Archivo de archivo de paquetes (.zip; .tar.gz)" para la categoría " Instalardesde:" y elija el archivo de paquete. Pulse "Instalar".
- Cargue el paquete con la función "library("ExocytosisSpatialAnalysis")" escribiendo este comando en R studio y presionando "Enter".
- Ejecute el paquete con la función "ESA()" escribiendo este comando en R studio y pulsando "Enter".
NOTA: Se abrirá una interfaz de usuario. - Seleccione el directorio para el conjunto de datos (archivos .txt) y un directorio para los trazados de salida.
NOTA: Los parámetros del análisis (ver texto a continuación) se pueden cambiar a través de una interfaz de usuario. - Este script se iniciará automáticamente y realizará el análisis. Proporciona archivos .pdf de las gráficas correspondientes y archivos .txt que contienen resultados numéricos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las características espaciotemporales de los eventos de exocitosis se analizaron a partir de lisosomas visualizados por VAMP7-pHluorin10,,11 en células hTert-RPE1. Las células hTert-RPE1 son células notransformadas que adoptan bien a la micropatrón y se han utilizado ampliamente en estudios anteriores basados en micropatrón4,,14. VAMP7 es un lisosomal v-SNARE15 que fue etiquetado con la pHlurina súper eclíptica en su término N y se encuentra en el lumen del lisosoma. Dentro de la célula, la sonda de pHluorin fue sofocada por el bajo pH del lisosoma, pero durante la exocitosis pHluorin comenzó a emitir una señal porque el pH aumentó debido a la liberación de protones. VAMP7-pHluorin fue monitoreado por imágenes de células vivas TIRFM en micropatrón en forma de anillo (Figura 1A–B). La señal de pHluorin mostró un pico durante la exocitosis que representaba la liberación rápida de protones lisosomales seguidos de descomposición exponencial, que representa la difusión 2D de la sonda en la membrana plasmática (Figura 1C). Las células hTERT-RPE1 presentaron una importante actividad de secreción lisosomal con una tasa media de exocitosis de 0,28 Hz(Figura 1D). Sin embargo, se observó una alta heterogeneidad en la tasa de exocitosis entre células (desviación estándar de 0,15 Hz), lo que indica que había una fuerte variabilidad de célula a célula en la secreción de los lisosomas.
Análisis espacial de una sola célula para investigar si la exocitosis de los lisosomas es aleatoria
Fue posible visualizar la distribución 2D de la exocitosis por KDE, como se realizó anteriormente para los compartimentos endomembranosos14,lo que podría revelar diferencias en las densidades locales (Figura 2B). Este enfoque es pertinente para la visualización de la distribución media de una población de células, pero menos informativo en celdas individuales debido al número limitado de eventos detectados (decenas frente a los varios miles obtenidos por análisis basados en la población) y alta variabilidad de células a células. Por ejemplo, este enfoque no nos permitió evaluar si la distribución de eventos de exocitosis siguió un comportamiento completo de aleatoriedad espacial (CSR) (es decir, correspondió a una distribución uniforme de puntos en una región observada para una sola célula). Un patrón de puntos sigue un comportamiento de CSR cuando las dos hipótesis siguientes son verdaderas: 1) la ubicación de cada punto es independiente de la de los otros puntos; y 2) la probabilidad de encontrar un punto en una subregión sólo depende de la relación entre el área de esta subregión y el área total. Hay tres posibles desviaciones de la CSR: 1) agrupación en clústeres (es decir, agregación); 2) dispersión (es decir, orden con distancia constante); o 3) una mezcla de agrupamiento y dispersión(Figura 2C). La función K de Ripley se utilizó para responder a esta pregunta como en análisis anteriores7,8,9 (Figura 2D). La función K de Ripley está cerca de la distancia normalizada de un evento ( con la función K de Ripley), pero superior (inferior respiratoria) a ár2 en el caso de agrupamiento (dispersión respiratoria). Al restar el número 2 de la función K de Ripley, la curva teórica de RSC debe estar en 0. Las simulaciones de casos de RSC se realizaron utilizando el mismo número de puntos que los eventos de exocitosis observados para evaluar la bondad de ajuste para el caso de RSC (envolvente gris alrededor de la curva teórica). La función K transformada de Ripley aplicada a los datos experimentales mostraba valores positivos fuera del sobre, indicando agrupación en clústeres (Figura 2D).
Para investigar si la agrupación de eventos de exocitosis se debió a la adhesión celular como se informó anteriormente6,realizamos un análisis similar de los datos de exclusivamente el área celular no andhesiva en el centro(Figura 2A, área adhesiva en gris, área central de celda no nadhesiva en blanco). Cabe destacar que los eventos de exocitosis en el área nodhesiva también estaban agrupados(Figura 2E),lo que indica que las moléculas de adhesión no eran las únicas estructuras que inducían puntos calientes secretores en las membranas plasmáticas.
Debido a que la función K de Ripley es una estadística descriptiva que no proporciona un valor P, se estableció una prueba estadística comparando eventos de exocitosis celular con simulaciones de RSC. Se utilizó el método NND(i) de la distancia del vecino más cercano. NDD se define como la distancia mínima de Euclides entre un punto i y todos los demás puntos. El NND(i) promedio de todos los eventos exocíticos de una célula fue calculado y en comparación con la RSC obtenida con un alto número de simulaciones de Monte Carlo (Figura 2F). Encontramos que el NND promedio de la célula única analizada en la Figura 2F era menor que el promedio de la distribución simulada del caso CSR, indicando vecinos más cercanos en promedio y por lo tanto agrupando. En el caso de la dispersión, se esperaba un valor más alto para el NND promedio (Figura 2C). Esta comparación permitió el cálculo de un valor P para cada celda. El valor P representa el porcentaje de simulaciones que exhibieron un NND más extremo (de forma a doble). Para ser precisos, el valor P imparcial se calculó como (k+1)/(N+1) siendo N el número total de simulaciones de Montecarlo (10.000), y k el número de estas simulaciones que era más extremo que el medidor observado16. El histograma de todos los valores P se antiptuó para el área de celda total (Figura 2G) y el área de celda no adándesiva (Figura 2I). Si H0: "La exocitosis es un proceso de RSC" era verdadera, se esperaba una distribución uniforme de los valores P. Si H0 era falso, se esperaba un pico con un valor P bajo. Realización de una prueba Kolmogorov-Smirnov en los histogramas de valor P, se obtuvo un valor P inferior a 0.001, mostrando una desviación significativa de la CSR en ambos casos (Figuras 2G y 2I). Además, un coeficiente de agrupación en clústeres de 0,955 para el área celular total y 1.000 para el área celular no anistémica indicaba que la exocitosis lisosomal era un proceso agrupado independiente de la adhesión celular. El coeficiente de agrupación en clústeres representa el porcentaje de celdas que estaban más cerca de un comportamiento de agrupación en clústeres que la dispersión. Este resultado fue consistente con la función K de Ripley.
Para evaluar el papel de la adhesión celular en la agrupación en clústeres, comparamos el NND promedio en el área no adnádhesiva con el del área general de cada celda individual(Figura 2H). Debido a que el NND promedio era inversamente proporcional a la densidad de la superficie, normalizamos el NND promedio del área no adestesiva usando homotety. El NND promedio significativamente mayor de los eventos de exocitosis en el área no adnádhesiva indicaba menos agrupación(Figura 2H). Por lo tanto, aunque la secreción de cúmulos de lisosomas en áreas no nadhesivas, la adhesión celular parecía mejorar la agrupación.
Análisis espacial de eventos de exocitosis utilizando coordenadas polares
La geometría circular del micropatrón en forma de anillo permitió el uso de las coordenadas polares comunes, lo que simplificó los análisis, como se encontró anteriormente17. Por lo tanto, cada evento de exocitosis podría ser descrito por un módulo (distancia desde el origen, aquí el centro del plano inferior de la celda) y un ángulo (según un eje arbitrario fijo). Además, el módulo se puede normalizar dividiéndolo por el radio de la celda. El histograma de eventos de exocitosis se traza de acuerdo con el módulo de una célula representativa (Figura 3A). Esto reveló un pico alrededor de la frontera entre las áreas adhesivas/nodhesivas. También se observó una gran variabilidad entre las células. Por lo tanto, agrupamos n.o 22 células para obtener una distribución media de los eventos de exocitosis. Sin embargo, para dar el mismo peso estadístico a cada celda, se seleccionó aleatoriamente el mismo número de eventos de cada celda. Esta selección aleatoria no cambió los patrones generales vistos. Para obtener una distribución media continua de las distribuciones individuales de celdas individuales, se utilizó un KDE (Figura 3B). Sin embargo, debido a que el módulo normalizado está entre 0 y 1, las condiciones del borde tuvieron que ser tenimente en cuenta. Se utilizó un núcleo beta que cambia de forma junto a los bordes18. Se calculó una banda de error con una estrategia de arranque. La distribución media observada se comparó con una hipotética distribución de RSC que mostró más eventos en un módulo más alto, porque el área aumentó con un módulo más alto. Porque la integral de una densidad de probabilidad debe ser una, la distribución CSR fue 2r (con son el radio normalizado, sin unidades). Se calculó una banda de confianza alrededor de la curva teórica utilizando un gran número de simulaciones de CSR Monte Carlo (5.000 cada una). Se trazaron lospercentiles 1 y 99 de la distribución del módulo a partir de estas simulaciones. Encontramos que la distribución media de los eventos de exocitosis se desvía del hipotético en 0.7rmax,que corresponde al principio del área adhesiva de la célula.
Tratamos de probar si la distribución observada del módulo era diferente de la teórica. Debido a que las distribuciones medias, como en este caso, no pueden probarse con precisión mediante una prueba de bondad de ajuste (por ejemplo, Kolmogorov-Smirnov), se empleó un método alternativo propuesto por Pecot et al. Este método mide la diferencia entre la variación entre una población y la variación dentro de una población, y por lo tanto permite pruebas independientes para cada coordenada (es decir, módulo y ángulo)17. Esta prueba se utilizó para comparar nuestros datos con datos simulados que representan eventos de exocitosis de RSC (el mismo número de células y eventos de exocitosis que los datos observados), y encontró una diferencia estadísticamente significativa en las variaciones (p < 0.001 con la prueba Wilcoxon-Mann-Whitney, n .22 células), lo que indica que la distribución media observada de la exocitosis no era CSR. Sin embargo, cuando se compararon dos simulaciones de CSR (con 5.000 simulaciones cada una), encontramos que el histograma del valor P no mostraba una distribución uniforme, pero mostraba un pico cercano a 1, lo que indica que esta prueba probablemente carecía de sensibilidad.
Dado que la estimación de KDE se basa en una elección no trivial del ancho de banda del núcleo y es sensible a los efectos de borde, también se calculó la función de distribución acumulativa, lo que supera los problemas inherentes a la estimación de KDE (Figura 3D). Esta función se define entre 0 y 1 y no contiene parámetros o sesgos arbitrarios (por ejemplo, sesgos de borde). Las bandas de error y confianza se calcularon de la misma manera que para la distribución del módulo. La función de distribución acumulativa confirmó que los eventos de exocitosis no seguían una distribución de RSC, sino que estaban sobreconcentrados en módulos alrededor de 0,7rmáx. Por lo tanto, este análisis nos permitió identificar las áreas celulares donde se produjo la agrupación en clústeres. Una pregunta interesante que plantea este resultado es si la sobreconcentración a 0,7rmax fue debido a la presencia de áreas adhesivas/no nadhesivas del micropatrón en forma de anillo o a un efecto de las áreas periféricas/centrales de secreción de las células.
Como la distribución media de los eventos de exocitosis se desvía del caso de la RSC en áreas no adnádhesivas y adhesivas, también nos preguntamos dónde era mayor la densidad de exocitosis. Se calcularon y compararon las densidades superficiales de la exocitosis en las áreas de adhesión y no adherencia. Encontramos que la densidad de la superficie era menor en el área de adhesión que en el área de nonadhesión por un análisis emparejado (Figura 3C). Esto podría explicarse por la fuerte disminución de la exocitosis en la periferia celular (0,85 – 1rmáx, Figura 3B).
Figura 1. Excitación de lisosomas en células hTert-RPE1: (A) Micropatrón en forma de anillo (rojo) y célula adhesiva hTert-RPE1 transfectada con VAMP7-pHluorin (verde)imagen por TIRFM. La flecha muestra un evento de exocitosis. Barras de escala a 10 m. (B) Kymograph de eventos de exocitosis. Las flechas muestran eventos de exocitosis. Barra de escala a 2 m, barra de escala en el tiempo a 5 s. (C) Perfil de intensidad normalizada de la exocitosis lisosomal de 22 células. Cada punto es un promedio de al menos 1.530 eventos de exocitosis. Se presentan la tasa de exocitosis sesenta(D)de las 22 células. La desviación estándar promedio +/- se traza en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis espacial de eventos de exocitosis lisosomal. (A) Dispersión de eventos de exocitosis durante 5 min de adquisición. Cada punto representa un evento de exocitosis. El área adhesiva se muestra en gris. (B) Estimación de la densidad del núcleo 2D (KDE) de la gráfica de dispersión de A. El color representa la densidad local de eventos de exocitosis. (C) Representación esquemática de posibles patrones de puntos. Se muestran los cuatro casos, Aleatoriedad espacial completa (CSR), Clustering, Dispersión y Mixto, y se trazan varias distancias de vecino más cercanas (NND) (líneas discontinuas) para mostrar cómo el NND promedio disminuyó en clustering y aumentó con dispersión. (D) Análisis de una celda representativa utilizando la función K de Ripley. La línea discontinua roja es igual a la "función K de Ripley - ér2" para los eventos de RSC, el sobre gris representa la bondad de ajuste estimada de las simulaciones de Monte Carlo con el mismo número de puntos que los eventos de exocitosis(evento N n 81). La línea sólida negra es igual a la "función K de Ripley – ér2" para los eventos de exocitosis observados(evento N n.o 81). Su desviación positiva de la curva roja fuera de la envolvente gris indica agrupación de eventos de exocitosis. La función K de Ripley se normalizó para tener un valor máximo de 1. (E) Análisis del área no adnádhesiva de la misma celda utilizando la función K de Ripley como en D. La desviación positiva de la curva roja fuera de la envolvente gris indica una agrupación de eventos de exocitosis en el área no nacional. (F) Comparación de la distribución media de NND de una célula representativa (línea roja) con el KDE de la RSC obtenido a partir de simulaciones de Monte Carlo (curva azul). El valor P se calculó como el porcentaje de valores simulados que eran más extremos que el valor observado. (G) histograma de valor P obtenido de la prueba NND como en F para n a 26 celdas. El pico de valores P bajos significa que la hipótesis nula "la exocitosis sigue a la RSC" fue rechazada con una prueba Kolmogorov-Smirnov, lo que indica que la exocitosis lisosomal no era CSR. (H) Gráfica de NND promedio de eventos de exocitosis en áreas no nadhesivas (blancas) y áreas celulares totales (gris). Los dos puntos de datos de la misma celda se unen mediante una línea. El NND promedio fue más grande en el área nodhesiva, p < 0.001 con una prueba de Wilcoxon emparejada (n a 25 células), lo que indica significativamente menos agrupación en el área no asistido. (I) Igual que G para el área no adádhesiva para n a 26 celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis espacial de eventos de exocitotosis lisosomal agrupados: (A) Histograma de los eventos de exocitosis de una célula representativa durante una adquisición de 5 minutos con eventos de exocitosis n a 161 en función del módulo normalizado; 0 representa el centro celular y 1 la periferia de la célula. El área adhesiva de la celda se muestra en gris y corresponde a módulos de 0.65–1 para las celdas mostradas. Hay un pico al principio del área adhesiva alrededor de módulos entre 0,6 y 0,7. (B) KDE de los eventos de exocitosis en función del módulo normalizado para n a 22 células con 56 eventos en cada celda; 0 representa el centro celular y 1 la periferia de la célula. El área adhesiva promedio se muestra en gris y corresponde en promedio a los módulos de 0.61–1. La curva azul discontinua es la curva teórica esperada en el caso de la CSR. Esta curva teórica va acompañada de un sobre que representa los percentiles 1-99 de la RSE obtenidos mediante la simulación de Monte Carlo. La curva KDE de los datos observados está en rojo y acompañada de una banda de error generada por el arranque. El área adhesiva es en gris +/- SEM. (C) Análisis emparejado de las densidades superficiales en áreas de adhesión y no adherencia. La densidad superficial de la exocitosis se calculó como el número de eventos por área normalizada y por segundo. Aquí, *p < 0.05 de una prueba t del estudiante emparejado (n á 22 celdas). La normalidad fue probada previamente por una prueba Shapiro-Wilk. (D) Función de distribución acumulativa de los datos en B (línea roja) y de simulaciones de RSC de Monte Carlo (línea azul punteada). Los sobres se generaron como en B. Observe que la línea roja se desvían de la CSR teórica en alrededor de 0.7rmax. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monitoreamos los eventos de exocitosis desde el compartimento lisosomal por imágenes de células vivas TIRFM de VAMP7-pHluorin en células normalizadas con micropatrón en forma de anillo y realizamos un análisis estadístico riguroso de los parámetros espaciales de los eventos de exocitosis. Empleando la función K transformada de Ripley y una prueba estadística basada en la distancia de vecino más cercana, confirmamos que la secreción de lisosomas no es un proceso aleatorio8,,9. Ambos análisis estadísticos mostraron convincentemente que los eventos de exocitosis presentan agrupaciones(Figuras 2D y 2G). Aplicando herramientas similares al área celular nodhesiva, encontramos que los eventos de exocitosis también están agrupados en áreas no nadhesivas (Figuras 2E y 2I). Por lo tanto, las moléculas de adhesión que se han divulgado previamente para permitir el clustering6 no son las únicas estructuras que pueden inducir puntos calientes secretores en la membrana plasmática. Sin embargo, la adhesión celular mejoró la agrupación: la distancia media del vecino más cercano entre los eventos de exocitosis fue significativamente mayor en áreas no adnádhesivas (Figura 2H). Consistentemente, nuestro análisis basado en la estimación de la densidad del núcleo y la función de distribución acumulativa identificó áreas enriquecidas de exocitosis que se encontraban en la frontera entre las áreas adhesivas y no anunesivas en células de micropatrón en forma de anillo. Se necesita más trabajo para determinar los mecanismos moleculares subyacentes a la agrupación, como la adhesión o una focalización específica del lisosoma a esta región. Curiosamente, observamos una alta heterogeneidad en la tasa de exocitosis a través de células hTERT-RPE1 (desviación estándar de 0,15 Hz para la tasa media de excitotosis de 0,28 Hz, Figura 1D), lo que indica que la secreción de lisosomas tiene una alta variación intercelular. Por lo tanto, los análisis de subpoblación deben considerarse en trabajos futuros. Sería particularmente interesante investigar si esta variación refleja la diversidad de compartimentos lisosomales, diferencias en las cargas o dependencia de la maquinaria de exocitosis.
Estos resultados ilustran cómo se pueden emplear herramientas estadísticas para investigar parámetros espaciales de diversos procesos biológicos. Además, los micropatrón facilitan el estudio del efecto de la adhesión celular de manera imparcial con la ayuda de diferentes geometrías de micropatrón (por ejemplo, en forma de anillo frente a disco). En particular, el uso de formas redondas facilita los análisis porque se pueden emplear coordenadas polares. Debido a que las herramientas estadísticas requieren una cierta cantidad de datos para ser significativas, se utilizaron celdas con más de 30 eventos para nuestro análisis. Sin embargo, existe la posibilidad de que las celdas con 30 o menos eventos sean significativas. Por lo tanto, se podrían realizar celdas de muestreo con 30 o menos eventos para obtener eventos suficientes para el análisis para determinar si este es el caso. Del mismo modo, es difícil estimar cuántas células deben analizarse, especialmente si hay una fuerte variación intercelular. Una manera de eludir esto es seleccionar aleatoriamente el mismo número de eventos de cada celda para dar el mismo peso estadístico a cada celda al agruparlos. Sin embargo, recomendamos que los análisis en menos de 15 células se realicen con precaución. Como las distribuciones medias de las células agrupadas no pueden ser probadas con precisión mediante pruebas de bondad de ajuste (por ejemplo, Kolmogorov-Smirnov) empleamos una estadística de prueba propuesta por Pecot y otros.17 Aunque esta prueba nos permitió encontrar una diferencia estadísticamente significativa en las variaciones en las distribuciones promedio, sospechamos que esta prueba tiene baja sensibilidad porque el histograma del valor P no era plano (es decir, mostró una distribución uniforme) al comparar diferentes simulaciones de CSR para valores p cercanos a 1. Por lo tanto, este procedimiento estadístico puede necesitar ser mejorado.
Un inconveniente de nuestros análisis es la detección manual de eventos de exocitosis, lo que reduce drásticamente la velocidad del análisis. Las limitaciones en la detección automática a menudo se deben a una fuerte heterogeneidad en el parámetro único y simple que se está analizando (por ejemplo, la intensidad de los eventos de exocitosis). Las redes neuronales podrían ser potencialmente potentes para la detección automática, ya que se pueden entrenar para reconocer muchas características.
El análisis presentado aquí se puede aplicar a otros procesos dinámicos observados por TIRFM, como la secreción de otros compartimentos y la distribución del microdominio de membrana o presentación de antígeno. También se pueden aplicar análisis similares a las células fijas para estudiar la distribución espacial de las proteínas. Esperamos que nuestro trabajo mejore el creciente interés en el análisis de distribución espacial en la biología celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos mucho a Thierry Galli (Centro de Psiquiatría y Neurociencias, INSERM) por proporcionar el plásmido VAMP7-pHluorin. Agradecemos a Tarn Duong por el asesoramiento sobre análisis estadístico y a los miembros del laboratorio GOUD para debates fructíferos. Los autores reconocen en gran medida el Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg y PICT-IBiSA @Pasteur) y Nikon Imaging Center, Institut Curie (París), miembro de la France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. recibió el apoyo de la Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) y P.M. recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Sk-odowska-Curie no 666003. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) e Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), así como el Centre National de la Rechecher Scientif y Curique Institut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
