Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Resumo

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Resumo

A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. Sem inervação sensorial, atividades orais diárias causariam danos irreparáveis. Apesar de sua importância, os papéis de inervação no desenvolvimento e manutenção dos dentes têm sido largamente negligenciados. Vários estudos demonstraram que as células DP secretam proteínas de matriz extracelular e sinais de paracrina para atrair e guiar axônhons TG para dentro e por todo o dente. No entanto, poucos estudos forneceram uma visão detalhada do crosstalk entre o mesenchyme DP e os afíferos neuronais. Para abordar essa lacuna de conhecimento, os pesquisadores começaram a utilizar co-culturas e uma variedade de técnicas para investigar essas interações. Aqui, demonstramos os múltiplos passos envolvidos na co-culturing células DP primárias com neurônios TG dispersos em um filtro transwell sobreposto com poros de grande diâmetro para permitir o crescimento axonal através dos poros. Células DP primárias com o gene de interesse ladeado por sites loxP foram utilizadas para facilitar a exclusão genética usando um sistema de recombinase Adenovirus-Cre-GFP. O uso de neurônios TG do mouse Thy1-YFP permitiu imagens afáveis precisas, com expressão bem acima dos níveis de fundo por microscopia confocal. As respostas dp podem ser investigadas através de coleta e análise de proteínas ou RNA, ou alternativamente, através de coloração imunofluorescente de células DP banhadas em tampas de vidro removíveis. A mídia pode ser analisada usando técnicas como análises proteômicas, embora isso exija esgotamento de albumina devido à presença de soro bovino fetal na mídia. Este protocolo fornece um método simples que pode ser manipulado para estudar as respostas morfológicas, genéticas e citosesqueléticas de neurônios TG e células DP em resposta ao ambiente controlado de um ensaio de co-cultura.

Introdução

A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. A não sentir dor dentária associada a cárie dentária e trauma leva à progressão da doença. Assim, a interioração adequada é uma exigência para o crescimento normal dos dentes, função e cuidado.

Enquanto a maioria dos órgãos são totalmente funcionais e internados no momento do nascimento, o desenvolvimento dentário se estende à vida adulta, com a inervação dentária e mineralização ocorrendo em concerto durante os estágios pós-parto^1,2. Curiosa....

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAB (IACUC).

1. Preparação de placas

NOTA: Os deslizamentos de cobertura podem ser usados para visualizar células DP no final do ensaio. Certifique-se de que a tampa da placa está acesa durante toda a incubação e lavagem de passos fora da capa da cultura do tecido estéril para evitar contaminação durante o processamento da amostra.

1. Preparação do deslizamento de cobertura
   1. Coverslips circulares autoclave.
   2. Filtre água ultrapura o capô.
   3. Transfira o....

Resultados

Esses resultados mostram que o crescimento do neurite TG foi aumentado na presença de células PP primárias no poço subjacente em comparação com o controle da monocultura neurita TG(Figura 2A,C). Há alguma variabilidade de ensaio em crescimento neurite. Assim, uma monocultura de neurônioS TG deve ser incluída em todos os ensaios como um controle para detectar os níveis basais de crescimento neurite. As células primárias do camundongo Tgfbr2^f/f foram utilizadas nest.......

Discussão

As atividades diárias da cavidade oral exigem que os dentes sentem estímulos externos e inflamação interna, a fim de permitir o uso e manutenção adequados. No entanto, apenas informações limitadas estão disponíveis sobre os sinais que impulsionam os processos de desenvolvimento da interioração dentária. Este protocolo fornece um método para isolar e co-cultura células DeP primárias e neurônios TG, a fim de estudar a comunicação cruzada entre as duas populações. Várias variáveis foram otimizadas e deixam abertas mais aven.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-Fluoro-2'-desoxiuridina	Sigma-Aldrich	F0503	Usado como um inibidor mitótico a 15 μ Concentração M em meios de co-cultura, Dia 2
Placa de cultura de células de 24 poços	Corning	3524	Placa de co-cultura
Alexa-546 anti-frango	Invitrogen	A-11040	Secundário para manchar o crescimento de neuritos marcado por anticorpo anti-GFP, diluição 1:500
Anticorpo anti-GFP	Aves Lab, Inc	GFP-1010	Anticorpo primário para marcar neurônios Thy1-YFP, diluição 1:200
Anti-Neurofilamento 200 anticorpo	Sigma-Aldrich	NO142	Anticorpo primário monoclonal para marcar neurônios, diluição 1:1000, alternativa se camundongos YFP não estiverem disponíveis
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	The Jackson Laboratory	12603	Tgfbr2f/f modelo de camundongo usado para células da polpa dentária no protocolo B6 otimizado
. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	The Jackson Laboratory	3709	Thy1-YFP genótipo de modelo de camundongo usado para neurônios do trigêmeo
Colagenase Tipo II	Millipore	234155-100MG	Usado para dispersar neurônios do trigêmeo Soro
Fetal Bovino	Gibco	10437	Aditivo para meios de co-cultura
Fórceps finos	Ferramentas de ciência fina	11413-11	Fórceps finos para dissecção de TG
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	reveste as inserções transwell na concentração final de 10 μ g/ml, a solução estoque é assumida em 1,5 mg/ml
Tampão de lise (Tampão RLT)	Qiagen	79216	Extrai RNA de células da polpa dentária pós-co-cultura
L-Glutamina	Gibco	25030081	Aditivo para meios de co-cultura
Tesoura de micro-dissecação	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Tesoura de dissecção para abrir crânio
Vidro de cobertura de microscópio	Fisherbrand	12-545-81	Lamínula circular para cultura celular opcional e processamento de imunofluorescência
Meio essencial mínimo a	Gibco	12571063	Base de meios de co-cultura
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070063	Aditivo antibiótico para meios de co-cultura
Inibidor de fosfatase	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	Aditivo para tampão RIPA para extração de proteínas de células da polpa dentária pós co-cultura
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Usado para auxiliar na transfecção de células da polpa dentária
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280	Revestimento de lamínula para auxiliar na adesão celular da polpa dentária
Inibidores de protease	Millipore	05 892 791 001	Aditivo ao tampão RIPA para extração de proteínas de células de polpa dentária pós-co-cultura
de tubos eppendorf livres de RNAse/DNAse	Denville	C-2172	Tubos pré-esterilizados de 1,7 ml para coleta de RNA, DNA ou proteína no final do ensaio
ThinCert Cell Culture Insert	Greiner Bio-One	662631	Transwell inserções para neurônios trigêmeos em ensaios de co-cultura
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Usado para dispersar células da polpa dentária
Tripsina Tipo II	Sigma-Aldrich	T-7409	Usado para dispersar
fórceps ultra finos	ciência das ferramentas	11370-40	trigêmeos ultra fino para a
uridina	Sigma-Aldrich	U3750	Usado como um inibidor mitótico em 1 μ M em meios de co-cultura, Sistema de
Filtração a Vácuo	Millipore	SCNY00060	Steriflip, 50 μ m nylon net
filtro frasco pinça	Fine Science Tools	110006-15	pinça longa para transferência de tecido para cônicos

da da ciência dos neurônios da dissecção Dia 2 Filtro descartável