É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/60809

⸱

14 de fevereiro de 2020

 ,  , 
1Cell, Developmental and Integrative Biology Department, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Resumo

A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. Sem inervação sensorial, atividades orais diárias causariam danos irreparáveis. Apesar de sua importância, os papéis de inervação no desenvolvimento e manutenção dos dentes têm sido largamente negligenciados. Vários estudos demonstraram que as células DP secretam proteínas de matriz extracelular e sinais de paracrina para atrair e guiar axônhons TG para dentro e por todo o dente. No entanto, poucos estudos forneceram uma visão detalhada do crosstalk entre o mesenchyme DP e os afíferos neuronais. Para abordar essa lacuna de conhecimento, os pesquisadores começaram a utilizar co-culturas e uma variedade de técnicas para investigar essas interações. Aqui, demonstramos os múltiplos passos envolvidos na co-culturing células DP primárias com neurônios TG dispersos em um filtro transwell sobreposto com poros de grande diâmetro para permitir o crescimento axonal através dos poros. Células DP primárias com o gene de interesse ladeado por sites loxP foram utilizadas para facilitar a exclusão genética usando um sistema de recombinase Adenovirus-Cre-GFP. O uso de neurônios TG do mouse Thy1-YFP permitiu imagens afáveis precisas, com expressão bem acima dos níveis de fundo por microscopia confocal. As respostas dp podem ser investigadas através de coleta e análise de proteínas ou RNA, ou alternativamente, através de coloração imunofluorescente de células DP banhadas em tampas de vidro removíveis. A mídia pode ser analisada usando técnicas como análises proteômicas, embora isso exija esgotamento de albumina devido à presença de soro bovino fetal na mídia. Este protocolo fornece um método simples que pode ser manipulado para estudar as respostas morfológicas, genéticas e citosesqueléticas de neurônios TG e células DP em resposta ao ambiente controlado de um ensaio de co-cultura.

Introdução

A inervação dentária permite que os dentes sentem pressão, temperatura e inflamação, todos cruciais para o uso e manutenção do órgão dentário. A não sentir dor dentária associada a cárie dentária e trauma leva à progressão da doença. Assim, a interioração adequada é uma exigência para o crescimento normal dos dentes, função e cuidado.

Enquanto a maioria dos órgãos são totalmente funcionais e internados no momento do nascimento, o desenvolvimento dentário se estende à vida adulta, com a inervação dentária e mineralização ocorrendo em concerto durante os estágios pós-parto1,2. Curiosamente, o mesenchyme de polpa dentária (DP) inicialmente secreta sinais repelentes durante embriogênese para evitar a entrada de axônono no órgão dentário em desenvolvimento, que mais tarde muda para a secreção de fatores atrativos à medida que o dente se aproxima da erupção3,4. Durante os estágios pós-natal, axôndegas afízios do nervo trigeminal (TG) penetram dentro e em todo o dente em torno do momento em que começa o depoimento dentin (revisado em Pagella, P. et al.5). Vários estudos in vivo demonstraram que interações neuronal-mesenquimicas guiam a interioração dentária em camundongos (revisadas em Luukko, K. et al.6),mas poucos detalhes dos mecanismos moleculares estão disponíveis.

As coculturas celulares fornecem ambientes controlados nos quais os pesquisadores podem manipular interações entre populações neuronais e mesenquinais. Experimentos de cocultura tornam possível aprofundar-se nos caminhos de sinalização que orientam a interioração e o desenvolvimento dos dentes. No entanto, vários dos métodos convencionais utilizados para estudar células na cocultura apresentam desafios técnicos. Por exemplo, a coloração violeta cristalina do crescimento neurite pode não especificamente manchar as células schwann incluídas nas dispersões de feixe de TG, e pode haver picos de intensidade de cor com respostas relativamente pequenas7. As câmaras microfluidas oferecem uma opção atraente, mas são consideravelmente mais caras do que os filtros transwell8,9 e só permitem a investigação de respostas neuronais às secreções dp. Para abordar essas questões, desenvolvemos um protocolo que permite: a) a) a) manipulação precisa e imagem do crescimento neurite TG em resposta às secreções DP, b) modificação genética das células DP e/ou neurônios TG para investigar caminhos específicos de sinalização e c) investigação de respostas de células DP a fatores secretos pelos neurônios TG. Este protocolo fornece a capacidade de investigar com precisão várias características de innervation dentária no ambiente controlado de um ensaio de co-cultura in vitro.

   

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAB (IACUC).

1. Preparação de placas

NOTA: Os deslizamentos de cobertura podem ser usados para visualizar células DP no final do ensaio. Certifique-se de que a tampa da placa está acesa durante toda a incubação e lavagem de passos fora da capa da cultura do tecido estéril para evitar contaminação durante o processamento da amostra.

  1. Preparação do deslizamento de cobertura
    1. Coverslips circulares autoclave.
    2. Filtre água ultrapura o capô.
    3. Transfira os coverslips para uma placa de 24 poços e cubra cada um com 400 μL de 0,1 mg/mL poli-D-lysine.
    4. Deixe os deslizamentos de cobertura para absorver, imersos por 5 min, em um roqueiro a 12 rpm ou shaker orbital a 40-50 rpm. Certifique-se de que a tampa está ligada para evitar contaminação.
    5. Enxágüe os deslizamentos de cobertura com água ultrapura filtrada por cerca de 5 min em um roqueiro a 12 rpm ou shaker a 50 rpm. Repetir.
    6. Deixe os deslizamentos de cobertura secarem por pelo menos 2 h o capô com a tampa da placa desligada para facilitar a evaporação. Esses comprovantes de cobertura devem ser usados dentro de 48 h.
    7. As células DeP de sementes no topo dos deslizamentos de cobertura e processam no final do ensaio para imunofluorescência (seção 3.3).
  2. Filtros de revestimento
    1. Diluir lamina para 10 μg/mL. Filtre o laminindilizado o capô.
    2. Pipette 450-500 μL de 10 μg/mL laminin em cada poço de uma placa de 24 poços.
    3. Coloque o filtro transwell, porosidade de 3 μm, em um poço para que ele entre em contato com a solução de laminin e deixe-o em uma incubadora de 37 °C por 2 h ou durante a noite. Os poros filtrados devem permitir que parte da solução difunda e recubra tanto a parte superior quanto a parte inferior do filtro. Estes filtros devem ser usados dentro de 48 h ou ser refrigerados a 4 °C por até 1 semana.

2. Revestimento celular com manipulação genética opcional

  1. Camundongos: Alterações genéticas das células DP podem ser realizadas (mas não é necessária) para estudar interações mesenquimal-neuronal. Veja as seções 2.3 e 2.4 para variações genéticas sugeridas.
  2. Dissecação dp, dispersão e chapeamento(Figura 1)
    NOTA: Para dissecção dp, use fórceps ultra finos e de borda reta. As bordas ultrafinas permitirão ao usuário cunhar a borda do fórcepentre a estrutura mineralizada e o tecido DP.
    1. Colher ratos P5-P8. Nesta fase, os dentes devem ser mineralizados, e a raiz está aberta.
    2. Anestesiar os recém-nascidos via hipotermia colocando-os em um prato na geladeira 4 °C até que eles não se movam mais ou respondam ao toque. Eutanize os recém-nascidos por decapitação e de acordo com os procedimentos da IACUC na instalação designada.
    3. Prepare uma alíquota de 3-5 mL de 0,25% de trypsin-EDTA em um tubo cônico de 50 mL para coletar o DP de cada mouse. Isso facilitará a digestão da polpa dentária dos camundongos pós-partos. Use mais de 3 mL se digerir tecido de mais de 10 camundongos pós-partos.
    4. Coloque a cabeça em um porca descartável para que a boca esteja em direção ao teto e a base do pescoço esteja plana na superfície do trabalho. Use uma lâmina de barbear em um movimento de serrapara separar a mandíbula da maxilosa.
    5. Remova opcionalmente a língua com tesouras ou com fórceps para permitir um acesso mais fácil aos molares.
    6. Coloque a cabeça aberta em um prato em cima de uma gaze estéril e coloque o espécime um microscópio dissecando(Figura 1D).
    7. Remova o tecido ósseo alveolar ao redor dos primeiros molares. Os dentes submandibulares não estão totalmente emeclosão neste momento. Insira fórceps na abertura alveolar e provoque o tecido longe do dente em direção ao lado buccal (bochecha) ou lingual (língua) da boca. Os dentes maxilos exigirão remoção total da fissura ao redor do dente para exposição e remoção.
    8. Transfira suavemente os primeiros molares submandibulares e maxilars (M1s) para um prato separado de cultura celular com salino 1x fosfato tampão (PBS).
    9. Repita 2.2.4-2.2.8 até que todos os M1 sejam coletados. Mantenha o prato contendo os M1s no gelo durante a colheita.
    10. Remova o Órgão Exterior esmalte (EOE) ao redor do lado de fora de cada M1. Isso pode ser feito após a etapa 2.2.11.
    11. Com um conjunto de fórceps, gire o M1 para que as cuspes caiam e a raiz aberta seja exposta. Haverá uma abertura oval na parte inferior do dente, e tecido DP opaco encapsulado por uma fina camada de dentina e esmalte.
    12. Usando a ponta dos fórceps, solte delicadamente o DP rodando um braço dos fórceps ao redor da circunferência interna do tecido mineralizado. Remova o tecido DP da estrutura mineralizada e transfira-o para um terceiro prato contendo 1x PBS. Remova o EOE se ainda não estiver separado(Figura 1E).
    13. Transfira todo o tecido DP para 0,25% de trypsin-EDTA em um tubo cônico de 50 mL. Vórtice a mistura e coloque em um banho de água morna de 37 °C por 10 min. Isso pode ser feito com os mesmos fórceps ou com fórceps longos e frascos. O tecido será difícil de dispersar e exigirá vórtice a cada 3-4 min. NÃO exceda 10 min de experimentação, já que a tentação pode danificar as membranas celulares.
    14. um capô estéril, adicione a mídia de cocultura aquecida(Tabela 1) a uma proporção final de pelo menos 1:1 mídia para tentar inativar a enzima. Proporções maiores são aceitáveis se mais dispersão tecidual for desejada.
    15. Pipette a mídia para cima e para baixo várias vezes com uma pipette de 10 mL para dispersar ainda mais o DP na mídia. Tenha cuidado para evitar grandes bolhas. A dispersão completa é quase impossível devido à natureza pegajosa do tecido. No entanto, também não é necessário, uma vez que as células migrarão para fora do tecido uma vez emplacados.
    16. Transfira 1 mL do DP disperso para cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (Figura 1F).
    17. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C e permita que as células se anivirem e migrem do tecido não disperso por 48 h antes de mudar a mídia. As células primárias precisam ser banhadas em concentrações relativamente altas para atingir 85-90% de confluência dentro de 1 semana. Se isso não for alcançado após 1 semana, descarte a placa.
  3. Manipulação Genética Opcional de Células DP
    1. Para alterar as vias de sinalização celular, colher células DP de camundongos de nocaute genético ou de camundongos em que um gene de interesse é flanqueado por locais loxP. Neste último caso, o gene pode ser excluído usando a recombinação Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) para remover o gene ladeado, conforme descrito abaixo. Use o Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) como um vírus de controle para garantir que a infecção viral não cause uma resposta celular.
      NOTA: O Ad-eGFP é controlado pelo potencializador de promotores cmv, que é muito forte. O Ad-Cre-GFP é regulado por um IRES, uma região regulatória interna entre o Cre e o GFP, que não é muito forte. Isso resulta em fluorescência mais brilhante em células Ad-eGFP do que as células Ad-Cre-GFP. Confirme os níveis equivalentes de infecção com base no número total de células fluorescing, não nos níveis de fluorescência celular.
    2. Prepare 500 μL de mídia contendo vírus e 10 μg/mL de polibreno por poço. Polibreno auxilia com infecção viral em células próximas à confluência10. Este protocolo baseia-se em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 para Ad-eGFP e 200 Ad-Cre-GFP para infecção genética eficiente com pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular. O número estimado de células é de 4 x 104 células/poço de uma placa de 24 poços:
      figure-protocol-1
    3. Misture a mídia com breve vórtice ou pipetting e adicione 500 μL a cada poço.
    4. Após 24 horas, adicione mais 500 μL de mídia de cocultura que não contenha polibrena ou vírus adicionais.
    5. Depois de um total de 48 h, aspirar a mídia contendo vírus e substituir por novas mídias de cocultura. Neste ponto, os neurônios TG podem ser adicionados em cima de filtros transwell.
  4. Dissecção trigeminal do neurônio, dispersão e chapeamento
    NOTA: Neste protocolo, a imagem do crescimento neurite na cocultura com células DP foi otimizada utilizando adolescentes (6 semanas de idade) B6.Cg-Tg.Thy1-YFP)16Jrs/J ratos. Sistemas nervosos centrais e periféricos de camundongos Thy1-YFP têm uma etiqueta amarela de proteína fluorescente (YFP), cuja expressão começa em torno de P6-P10 em neurônios e aumenta exponencialmente em todo o sistema nervoso durante a vida pós-natal e adulto11,12. YFP e GFP conservaram sequências que permitem que esses nervos sejam manchados com anticorpos anti-GFP, resultando em uma mancha pan-neuronal. Em última análise, esses camundongos permitem uma melhor visualização e quantificação dos neurônios usados e cultivados na cultura celular.
    1. Eutanize camundongos adolescentes com dióxido de carbono seguido de luxação cervical.
    2. Decapitar os ratos e remover a pele do crânio. Certifique-se de incluir números equivalentes de machos e fêmeas.
    3. Insira a ponta de um par de tesouras microdissecares na base do crânio. Corte ao longo da sutura sanittal do crânio (Figura 1A).
    4. Faça quatro pequenos cortes horizontais: dois ao longo das suturas coronais pelas orelhas, e dois ao longo das suturas lambdoides na base do crânio. Isso deve criar dois retalhos de osso.
    5. Use o fórceps para descascar os dois retalhos de osso. Isso deve revelar o cérebro.
    6. Remova o cérebro. Transfira a cabeça para um prato de cultura tecidual com 1x PBS e coloque o microscópio.
    7. Localize os gânglios TG, que é facilmente visível em roedores13, alojados na matéria dura entre o cérebro e osso do processo maxilar (Figura 1B).
    8. Corte os três ramos que viajam para os olhos, maxilos e mandíbulas e transfira os gânglios para PBS frios 1x usando fórceps finos de borda reta. Mantenha o prato contendo os gânglios TG no gelo durante a colheita.
    9. Uma vez colhidos todos os pacotes TG, transfira gânglios para um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mg/mL de colagenase filtrada estéril tipo II usando fórceps frascos.
    10. Vórtice a colagenase com o pacote TG e coloque o tubo em um banho de água de 37 °C por 25-30 min. Durante esse tempo, pegue o tubo cônico do banho de água, vórtice, e volte ao banho a cada 5-10 min.
    11. Centrífuga a solução de neurônio colagenase-TG por 2 min a 643 x g.
    12. um capuz de cultura tecidual, gentilmente aspiraa a colagenase com uma micropipeta.
    13. Adicione 5 mL de 1% de trypsin filtrado estéril tipo II e vórtice. Coloque o tubo cônico em um banho de água de 37 °C por 5 min.
    14. Centrífuga o mix trypsin-TG por 5 min a 643 x g. Remova a porção superior da trippsina com uma micropipette, para que os neurônios TG não sejam removidos. Ainda haverá líquido no tubo.
    15. Adicione mídia suficiente para desativar a trippsina restante (a uma proporção 1:1 ou menor de trippsina para mídia).
    16. Conte o número de células e dilua a solução para 200.000 células/mL (250 μL de células contendo 50.000 células).
    17. Coloque filtros transwell revestidos da seção 1.2 em poços com DP.
    18. Diluir a solução contendo células para que existam 200.000 células/mL. Pipette 250 μL no filtro transwell, e cultura as células a 37 °C durante a noite(Figura 1F).
    19. No dia seguinte, substitua a mídia por 1 mL da mídia co-cultura por 1 μM uridina e 15 μM 5'-fluor-2'deoxyuridina para impedir a superproliferação de células mesenquimals que podem evitar o crescimento do neurite. Opcional: Adicione fatores de crescimento ou inibidores neste meio de comunicação se tentar mais manipulação.
    20. Cultura as células para pontos de tempo mais desejados. Este protocolo foi otimizado por 5 dias totais de cultura com a mídia alterada apenas no dia 2 para adicionar inibidores mitocóticos. Períodos de tempo mais longos exigirão mudanças adicionais na mídia.

3. Coleta e Processamento de Amostras

  1. Coloração trigeminal
    1. Pipette 1 mL alíquotas de 1x PBS estéreis em uma placa de 24 poços uma capa de cultura de tecido para cada filtro transwell a ser processado.
    2. Remova o líquido em cima do filtro ser removido com uma pipeta de 200-1.000 μL, tendo cuidado para deixar as camadas das células intactas. As células anexadas devem permanecer presas e as células não ligadas se soltarão durante esta pipetting suave. Um filtro de vácuo pode danificar a camada celular e não é recomendado para aspiração.
    3. Transfira o filtro para a placa 1x PBS, certificando-se de remover a camada superior de mídia como mencionado na etapa anterior.
    4. Coloque a placa com todos os filtros transwell e tampas em um roqueiro a 12 rpm ou 40-50 rpm em um agitador orbital por 10 min.
    5. Aspirar o PBS, incluindo a camada superior como descrito acima, adicione 500 μL de 1xPBS e coloque no roqueiro ou agitador orbital para uma lavagem adicional de 5-10 min.
    6. Aspirar o 1x PBS mais uma vez e substituir por 4% de paraformaldeído (PFA). Use pelo menos 500 μL para que toda a superfície do filtro esteja submersa. Coloque a placa em um roqueiro a 12 rpm ou agitador orbital a 40-50 rpm em temperatura ambiente por 1 h.
    7. Retire o PFA e enxágue as placas duas vezes por 5-10 min cada em um roqueiro com 500 μL de 1x PBS.
    8. Bloqueie com 10% de albumina de soro bovino (BSA) + 5% de soro de cabra/burro, dependendo do animal hospedeiro de anticorpos secundários, em 0,05% Tween-1xPBS (PBST). Use 450-500 μL de solução para que o filtro esteja submerso no líquido.
      NOTA: Nesta fase, essas placas podem ser armazenadas a 4 °C por vários meses para serem processadas posteriormente. Use parafilme para selar a placa para garantir que a evaporação não ocorra e verifique regularmente a evaporação para que as superfícies do filtro permaneçam submersas.
    9. Remova o bloco e adicione 450-500 μL de anticorpo primário em 1% BSA-PBST sem um enxaguar adicional. Incubar a 4 °C durante a noite, balançando suavemente.
    10. Remova a solução primária de anticorpos e enxágue com 500 μL de 1xPBST em um roqueiro, 3 vezes, à temperatura ambiente
    11. Remova o PBST, adicione anticorpo secundário e incubar em um roqueiro durante a noite a 4 °C envolto em papel alumínio para proteger fluoroforos da degradação da luz. Enxágüe novamente, 3 vezes, com 1x PBST em um roqueiro em temperatura ambiente. Substitua por 1x PBS.
      NOTA: Neste ponto, a placa pode ser armazenada por vários meses a 4 °C se embrulhada em papel alumínio para evitar a degradação do fluorofóforo. Use parafilme para selar a placa para garantir que a evaporação não ocorra e verifique regularmente a evaporação para que as superfícies do filtro permaneçam submersas. É melhor imaginar dentro de um mês.
    12. Para imagens ótimas, utilize neurônios do camundongo Thy1-YFP com um anticorpo anti-GFP para manchar especificamente as apararendas neuronais bem acima dos níveis de fundo. Use anti-neurofilamento 200 para manchar precisamente estruturas axonais se os camundongos Thy1-YFP não estiverem disponíveis.
    13. Imagem como desejado. Os filtros não precisam ser banhados e, em vez disso, podem ser colocados em cima de um deslizamento ou deslizamento para imagem com um microscópio invertido.
      NOTA: As áreas do filtro não conterão estruturas aférentas. Tire várias imagens com uma profundidade de pilha z que captura todas as estruturas afantes. Use software de costura para visualizar o crescimento neurite sobre grandes áreas, ou (preferencialmente) regiões de filtro inteiros.
  2. Coleção de RNA, proteína e mídia
    1. Enquanto os filtros transwell estão processando, colete a mídia em tubos livres rnase/dnase e congele para ensaios posteriores (ELISA, proteomics, etc.).
    2. Imediatamente após a coleta de mídia, o buffer de lise de alíquota ou tampão de ensaio de precipitação radioimuno (RIPA) com inibidores de proteinase e fosfatase nos poços. Este protocolo foi otimizado para 100 μL/well em uma placa de 24 poços.
    3. Deixe os buffers para lemejar células por 5 min, em seguida, raspar cada filtro com uma nova ponta de pipeta e coletar as amostras de células em tubos rnase/dnase-free. Congele a lise para ensaios futuros (PCR semi-quantitativo e/ou quantitativo, mancha ocidental, etc.).
  3. Imunofluorescência opcional de células de celulose dentárias:
    1. Levante suavemente os coverslips da Seção 1.1 com fórceps e transfira-os para diferentes poços com 4% de PFA por 1 h com balanço.
    2. Aspirar pfa e enxaguar os coverslips duas vezes com 1x PBS. Acompanhe isso com permeabilização, bloqueio e imunofluorescência para marcadores de interesse com técnicas padrão de imunofluorescência.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Esses resultados mostram que o crescimento do neurite TG foi aumentado na presença de células PP primárias no poço subjacente em comparação com o controle da monocultura neurita TG(Figura 2A,C). Há alguma variabilidade de ensaio em crescimento neurite. Assim, uma monocultura de neurônioS TG deve ser incluída em todos os ensaios como um controle para detectar os níveis basais de crescimento neurite. As células primárias do camundongo Tgfbr2f/f foram utilizadas nest...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

As atividades diárias da cavidade oral exigem que os dentes sentem estímulos externos e inflamação interna, a fim de permitir o uso e manutenção adequados. No entanto, apenas informações limitadas estão disponíveis sobre os sinais que impulsionam os processos de desenvolvimento da interioração dentária. Este protocolo fornece um método para isolar e co-cultura células DeP primárias e neurônios TG, a fim de estudar a comunicação cruzada entre as duas populações. Várias variáveis foram otimizadas e deixam abertas mais aven...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por a) os Institutos Nacionais de Saúde/NIAMS (números de subvenção R01 AR062507 e R01 AR053860 para RS), b) bolsa da Universidade do Alabama no Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) para sBP do Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial/Instituto Nacional de Saúde, c) um Centro Global de Transtornos Craniofaciais, Bucais e Dentários (GC-CODED) Bolsa piloto e viabilidade ao SBP e d) do Instituto Nacional de Odontologia e Craniofacial Pesquisa/Institutos Nacionais de Saúde K99 DE024406 bolsa ao SBP.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-Fluoro-2'-desoxiuridinaSigma-AldrichF0503Usado como um inibidor mitótico a 15 μ Concentração M em meios de co-cultura, Dia 2
Placa de cultura de células de 24 poçosCorning3524Placa de co-cultura
Alexa-546 anti-frangoInvitrogenA-11040Secundário para manchar o crescimento de neuritos marcado por anticorpo anti-GFP, diluição 1:500
Anticorpo anti-GFPAves Lab, IncGFP-1010Anticorpo primário para marcar neurônios Thy1-YFP, diluição 1:200
Anti-Neurofilamento 200 anticorpoSigma-AldrichNO142Anticorpo primário monoclonal para marcar neurônios, diluição 1:1000, alternativa se camundongos YFP não estiverem disponíveis
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/JThe Jackson Laboratory12603Tgfbr2f/f modelo de camundongo usado para células da polpa dentária no protocolo B6 otimizado
. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JThe Jackson Laboratory3709Thy1-YFP genótipo de modelo de camundongo usado para neurônios do trigêmeo
Colagenase Tipo IIMillipore234155-100MGUsado para dispersar neurônios do trigêmeo Soro
Fetal BovinoGibco10437Aditivo para meios de co-cultura
Fórceps finosFerramentas de ciência fina11413-11Fórceps finos para dissecção de TG
LamininaSigma-AldrichL2020reveste as inserções transwell na concentração final de 10 μ g/ml, a solução estoque é assumida em 1,5 mg/ml
Tampão de lise (Tampão RLT)Qiagen79216Extrai RNA de células da polpa dentária pós-co-cultura
L-GlutaminaGibco25030081Aditivo para meios de co-cultura
Tesoura de micro-dissecaçãoSigma-AldrichS3146-1EATesoura de dissecção para abrir crânio
Vidro de cobertura de microscópioFisherbrand12-545-81Lamínula circular para cultura celular opcional e processamento de imunofluorescência
Meio essencial mínimo aGibco12571063Base de meios de co-cultura
Penicilina-estreptomicinaGibco15070063Aditivo antibiótico para meios de co-cultura
Inibidor de fosfataseSigma-Aldrich04 906 837 001Aditivo para tampão RIPA para extração de proteínas de células da polpa dentária pós co-cultura
PolybreneMilliporeTR-1003-GUsado para auxiliar na transfecção de células da polpa dentária
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280Revestimento de lamínula para auxiliar na adesão celular da polpa dentária
Inibidores de proteaseMillipore05 892 791 001Aditivo ao tampão RIPA para extração de proteínas de células de polpa dentária pós-co-cultura
de tubos eppendorf livres de RNAse/DNAseDenvilleC-2172Tubos pré-esterilizados de 1,7 ml para coleta de RNA, DNA ou proteína no final do ensaio
ThinCert Cell Culture InsertGreiner Bio-One662631Transwell inserções para neurônios trigêmeos em ensaios de co-cultura
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200056Usado para dispersar células da polpa dentária
Tripsina Tipo IISigma-AldrichT-7409Usado para dispersar
fórceps ultra finosciência das ferramentas11370-40trigêmeos ultra fino para a
uridinaSigma-AldrichU3750Usado como um inibidor mitótico em 1 μ M em meios de co-cultura, Sistema de
Filtração a VácuoMilliporeSCNY00060Steriflip, 50 μ m nylon net
filtro frasco pinçaFine Science Tools110006-15pinça longa para transferência de tecido para cônicos
da da ciência dos neurônios da dissecção Dia 2 Filtro descartável

Referências

  1. Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
  2. Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
  3. Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
  4. Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
  5. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
  6. Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
  7. Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
  8. de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
  9. Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).
  10. Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
  11. Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
  12. Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
  13. Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
  14. Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
  15. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).
  16. Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
  17. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
  18. Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
  19. Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
  20. Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
  21. Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
  22. Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799(2016).
  23. Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).
  24. Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Células da Polpa DentáriaNeurônios TrigêmeosFiltro TranswellAdenovírus-Cre-GFPCamundongo Thy1-YFPMicroscopia ConfocalColoração ImunofluorescenteAnálise Proteômica
Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.