O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).
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Artigo de método
Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
CR1 (CD35, Receptor Complementar tipo 1 para C3b/C4b) é uma glicoproteína de membrana de alto peso molecular de cerca de 200 kDa que controla a ativação complementar, transporta complexos imunológicos e participa de respostas imunes humorais e celulares. CR1 está presente na superfície de muitos tipos de células, incluindo eritrócitos, e exibe polimorfismos em comprimento, estrutura (Knops, ou KN, grupo sanguíneo) e densidade. A densidade média de CR1 por eritrócito (CR1/E) é de 500 moléculas por eritrócito. Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Apresentamos aqui um método robusto de citometria de fluxo para medir a densidade de CR1/E, inclusive em sujeitos que expressam baixa densidade, com a ajuda de um sistema de imunocoloração amplificador. Este método nos permitiu mostrar a redução da expressão eritrócito cr1 em doenças como a doença de Alzheimer (DA), lúpus eritematoso sistêmico (LE), AIDS ou malária.
Introdução
CR1 (receptor complementar tipo 1, CD35) é uma glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente na superfície de muitos tipos de células, tais como eritrócitos1, Linfócitos B2,células monocíticas, algumas células T, células dendríticas foliculares3, ostrócitos fetais4, e podocitos glomerulares5. CR1 interferindo com seus ligantes C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, uma subunidade do primeiro componente complementar, C1q....
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Protocolo
O protocolo de coleta e manuseio de sangue humano foi revisado e aprovado pelo Comitê Regional de Ética (CPP Est II), e o número do protocolo é 2011-A00594-37. Como o protocolo a seguir descreve o manuseio do sangue humano, devem ser seguidas as diretrizes institucionais para o descarte de material bioperigoso. Equipamentos de segurança de laboratório, como jalecos e luvas, devem ser usados.
1. Lavagem de eritrócitos
NOTA: Um dia antes do manuseio, prepare um tampão PBS-BSA com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,15% de albumina de soro bovino (BSA) e coloque-o na geladeira a 4 °C. Este tampão ser....
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Resultados
Os eritrócitos de três sujeitos cuja densidade de CR1 é conhecida (sujeito "baixo" [180 CR1/E], sujeito "médio" [646 CR1/E], e "alto" sujeito [966 CR1/E]), e de dois sujeitos cuja densidade cr1 precisava ser determinada foram imunostados por um anticorpo anti-CR1 acoplado a um sistema de amplificação usando o ficoeritrinor No início, a densidade cr1 dos sujeitos da faixa baixa-alta foi determinada pelo método Scatchard29 usando anticorpos rotulados por radiorótulo. As normas (baixa, média e alta) .......
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Discussão
Várias técnicas estão disponíveis para determinar a densidade do eritrócito CR1 (CR1/E). As primeiras técnicas utilizadas foram a aglutinação de glóbulos vermelhos por anticorpos anti-CR131 e a formação de rosetas na presença de eritrócitos revestidos com C3b32. Estas técnicas rudimentares foram rapidamente substituídas por métodos de imunocoloração usando anticorpos anti-CR1 radiorotulados1,33. Também é possível me.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros da URCACyt, plataforma técnica de citometria de fluxo, equipe do Departamento de Imunologia, e a equipe do Departamento de Medicina Interna e Geriatria, que contribuíram para otimizar e validar o protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Reims University Hospitals (número de subvenção AOL11UF9156).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ponta de Barreira 1000E | Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, França | 2079E | pipetagem de amostra |
| 1-100 µ L chanfrado, ponta de filtro | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemanha | S1120-1840 | pipetagem de amostra |
| Anticorpo monoclonal anti-CR1 biotinilado (J3D3) | Produção doméstica de anticorpo monoclonal não comercial, cortesia do Dr. J. Cook | imunocoloração | |
| blusa | |||
| Albumina sérica Bovin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França | Centrífuga de | citometria |
| Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, França | 11176917 | centrifugação | |
| Solução limpa | BD, F-38801 Le Pont de Claix, França | 340345 | citometria |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Kit de Contas de Rastreamento | BD, F-38801 Le Pont de Claix, França | 655051 | citometria |
| Solução de formaldeído 36,5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, França | F8775-25ML | Fixação |
| 10 µ L Graduado, ponta de filtro | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemanha | S1121-3810 | pipetagem de amostra |
| LSRFORTESSA Citômetro de fluxo | BD, F-38801 Le Pont de Claix, França | 647788 | citometria |
| Pistões capilares Microman | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | pipetagem de amostra |
| Micronic 1,40 mL tubos de fundo redondo | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mistura |
| Micropipeta Microman - tipo M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | pipetagem de amostra |
| Tamponamento de fosfato Salino (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França | Pipeta de | citometria |
| PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | amostra pipetagem |
| sem pó Exame de nitrilo luvas | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, EUA | 486802 | proteção de amostras |
| Referência 2 pipeta, 0,5-10 µ L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França | pipetagem de amostra | de 4920000024 |
| Referência 2 pipeta, 20-100 µ L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França | 4920000059 | pipeta de amostra de pipetagem |
| Referência 2, 100-1000 µ L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França | 4920000083 | pipetagem de amostra |
| Solução de enxágue | BD, F-38801 Le Pont de Claix, França | 340346 | citometria |
| Tubo inferior redondo | Sarstedt, F-70150 Marnay, França | 55.1579 | citometria |
| Tubos Safe-Lock, 1,5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França | 0030120086 | mix |
| estreptavidina R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, França | AS-60669 | imunocoloração |
| Tubos de centrífuga cônicos 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França | 10203001 mistura | |
| Vector anti estreptavidina biotina | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, França | BA-0500 | imunocoloração |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, EUA | Mistura SI-0236 |
Referências
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.
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Reimpressões e permissões
