Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo

Summary

O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Receptor Complementar tipo 1 para C3b/C4b) é uma glicoproteína de membrana de alto peso molecular de cerca de 200 kDa que controla a ativação complementar, transporta complexos imunológicos e participa de respostas imunes humorais e celulares. CR1 está presente na superfície de muitos tipos de células, incluindo eritrócitos, e exibe polimorfismos em comprimento, estrutura (Knops, ou KN, grupo sanguíneo) e densidade. A densidade média de CR1 por eritrócito (CR1/E) é de 500 moléculas por eritrócito. Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Apresentamos aqui um método robusto de citometria de fluxo para medir a densidade de CR1/E, inclusive em sujeitos que expressam baixa densidade, com a ajuda de um sistema de imunocoloração amplificador. Este método nos permitiu mostrar a redução da expressão eritrócito cr1 em doenças como a doença de Alzheimer (DA), lúpus eritematoso sistêmico (LE), AIDS ou malária.

Introduction

CR1 (receptor complementar tipo 1, CD35) é uma glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente na superfície de muitos tipos de células, tais como eritrócitos¹, Linfócitos B^2,células monocíticas, algumas células T, células dendríticas foliculares³, ostrócitos fetais⁴, e podocitos glomerulares⁵. CR1 interferindo com seus ligantes C3b, C4b, C3bi^6,7,8,9, uma subunidade do primeiro componente complementar, C1q^....

Protocol

O protocolo de coleta e manuseio de sangue humano foi revisado e aprovado pelo Comitê Regional de Ética (CPP Est II), e o número do protocolo é 2011-A00594-37. Como o protocolo a seguir descreve o manuseio do sangue humano, devem ser seguidas as diretrizes institucionais para o descarte de material bioperigoso. Equipamentos de segurança de laboratório, como jalecos e luvas, devem ser usados.

1. Lavagem de eritrócitos

NOTA: Um dia antes do manuseio, prepare um tampão PBS-BSA com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,15% de albumina de soro bovino (BSA) e coloque-o na geladeira a 4 °C. Este tampão ser....

Results

Os eritrócitos de três sujeitos cuja densidade de CR1 é conhecida (sujeito "baixo" [180 CR1/E], sujeito "médio" [646 CR1/E], e "alto" sujeito [966 CR1/E]), e de dois sujeitos cuja densidade cr1 precisava ser determinada foram imunostados por um anticorpo anti-CR1 acoplado a um sistema de amplificação usando o ficoeritrinor No início, a densidade cr1 dos sujeitos da faixa baixa-alta foi determinada pelo método Scatchard²⁹ usando anticorpos rotulados por radiorótulo. As normas (baixa, média e alta) .......

Discussion

Várias técnicas estão disponíveis para determinar a densidade do eritrócito CR1 (CR1/E). As primeiras técnicas utilizadas foram a aglutinação de glóbulos vermelhos por anticorpos anti-CR1³¹ e a formação de rosetas na presença de eritrócitos revestidos com C3b³². Estas técnicas rudimentares foram rapidamente substituídas por métodos de imunocoloração usando anticorpos anti-CR1 radiorotulados^1,33. Também é possível me.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ponta de Barreira 1000E	Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, França	2079E	pipetagem de amostra
1-100 µ L chanfrado, ponta de filtro	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemanha	S1120-1840	pipetagem de amostra
Anticorpo monoclonal anti-CR1 biotinilado (J3D3)	Produção doméstica de anticorpo monoclonal não comercial, cortesia do Dr. J. Cook		imunocoloração
blusa
Albumina sérica Bovin (7,5%)	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França	Centrífuga de	citometria
	Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, França	11176917	centrifugação
Solução limpa	BD, F-38801 Le Pont de Claix, França	340345	citometria
Comorack-96	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	944060P	rack
Cytometer Setup & Kit de Contas de Rastreamento	BD, F-38801 Le Pont de Claix, França	655051	citometria
Solução de formaldeído 36,5 %	Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, França	F8775-25ML	Fixação
10 µ L Graduado, ponta de filtro	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemanha	S1121-3810	pipetagem de amostra
LSRFORTESSA Citômetro de fluxo	BD, F-38801 Le Pont de Claix, França	647788	citometria
Pistões capilares Microman	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	067494	pipetagem de amostra
Micronic 1,40 mL tubos de fundo redondo	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	MP32051	mistura
Micropipeta Microman - tipo M25 -	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	066379	pipetagem de amostra
Tamponamento de fosfato Salino (PBS)	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França	Pipeta de	citometria
PS 325 mm, 10 mL	Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath	391952	amostra pipetagem
sem pó Exame de nitrilo luvas	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, EUA	486802	proteção de amostras
Referência 2 pipeta, 0,5-10 µ L	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França	pipetagem de amostra	de 4920000024
Referência 2 pipeta, 20-100 µ L	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França	4920000059	pipeta de amostra de pipetagem
Referência 2, 100-1000 µ L	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França	4920000083	pipetagem de amostra
Solução de enxágue	BD, F-38801 Le Pont de Claix, França	340346	citometria
Tubo inferior redondo	Sarstedt, F-70150 Marnay, França	55.1579	citometria
Tubos Safe-Lock, 1,5 mL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França	0030120086	mix
estreptavidina R-PE	Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, França	AS-60669	imunocoloração
Tubos de centrífuga cônicos 50 mL	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França		10203001 mistura
Vector anti estreptavidina biotina	Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, França	BA-0500	imunocoloração
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, EUA	Mistura SI-0236