O protocolo apresenta um modelo completo de murina induzida por TNBS da doença de Crohn e métodos para visualização de receptores de estrogênio por imunohistoquímica usando imunofluorescência de seções de cólon fixas de formalina embutidas em parafina.
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Artigo de método
Visualização de receptores de estrogênio em cólons de camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS usando imunofluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença de Crohn é o tipo mais diagnosticado de doença inflamatória intestinal. A inflamação crônica que se desenvolve no intestino leva à desordem da peristalse e aos danos da mucosa intestinal e parece estar associada a um risco aumentado de transformação neoplásica do cólon. O acúmulo de evidências indica que os estrogênios e receptores de estrogênio afetam não apenas tecidos sensíveis a hormônios, mas também outros tecidos não diretamente relacionados a estrogênios, como os pulmões ou cólon. Aqui, descrevemos o protocolo para a bem sucedida coloração de imunofluorescência de receptores de estrogênio no cólon obtido susceptência de um modelo murina da doença de Crohn induzida pelo TNBS. Um protocolo detalhado para a indução da doença de Crohn em camundongos e preparação do intestino é fornecido, bem como um procedimento imunohistoquímico passo a passo usando seções de intestino parafina fixado formalina. Os métodos descritos não só são úteis para a detecção de receptores de estrogênio e a investigação de sinalização de estrogênio in vivo, mas também podem ser aplicados para outras proteínas que podem estar envolvidas no desenvolvimento de colite.
Introdução
A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória intestinal (DII) manifestada como inflamação crônica do intestino. A etiologia do CD é pouco compreendida, mas existem alguns fatores importantes que parecem ser responsáveis pelo desenvolvimento do CD, incluindo a microbiota intestinal, e fatores genéticos e ambientais, como dieta ou estresse1. Para uma melhor compreensão da patogênese da doença de Crohn, vários modelos de inflamação intestinal têm sido utilizados2,3,4,5,6,7. Neste artigo, apresentamos resultados obtidos a partir de um modelo de murina induzida por 2,4,6-trinitrobbenzeno (TNBS) do modelo de CD.
Foi documentado que os estrogênios são capazes de modular a inflamação intestinal crônica8,,9,10,11,12. A atividade biológica dos estrogênios é mediada por receptores cognatos, entre os quais estão receptores de estrogênio nuclear (ERs), ou seja, ERα (gene ESR1) e ERβ (gene ESR2),bem como receptor esgota do g acoplado à proteína, ou seja, GPER (gene GPER1),referido como ER13,14. Existem vários métodos para determinar o nível dos receptores de estrogênio, mas apenas alguns podem ser usados para visualizá-los no intestino.
A imunohistoquímica (IHC) é um método amplamente utilizado em estudos clínicos e básicos para a detecção de certos antígenos em células ou tecidos com anticorpos florocromos conjugados. O IHC parece ser um importante método na visualização da estrutura tecidual, bem como na identificação e localização de proteínas específicas, o que pode ser crucial para a compreensão do desenvolvimento da colite. Aqui, apresentamos um protocolo completo e validado para visualização imunohistoquímica de receptores de estrogênio no intestino usando imunofluorescência.
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Protocolo
Os estudos em animais foram realizados com o consentimento do Comitê Deética Local (28/ŁB29/2016) em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho de 22 de Setembro de 2010, e recomendações institucionais.
1. Modelo de murina induzida pelo TNBS da doença de Crohn
NOTA: Este protocolo utiliza camundongos machos BALB/C pesando 25-28 g. Os animais estão alojados a uma temperatura constante (22-24 °C) e, umidade relativa de 55 ± 5%, e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso livre a pelotas de chow padrão e água da torneira ad libitum.
- Coloque o mouse na câmara de indução e feche bem a tampa. Anestesiar o mouse brevemente com isoflurano (25% O2 com taxa de fluxo O2 a 1,5-2 L/min).
NOTA: A taxa respiratória deve permanecer rítmica e mais lenta do que o normal e não deve mudar em resposta a um estímulo nocivo. - Instill 4 mg de TNBS em 0,1 mL de 30% de etanol em 0,9% NaCl ou 0,1 mL de 30% de etanol em 0,9% NaCl como controle veicular no cólon distal através de um cateter.
NOTA: O cateter deve ser cuidadosamente introduzido aproximadamente 3 cm no ânus. - Monitore o camundongo diariamente do segundo ao oitavo dia para parâmetros clínicos, incluindo peso corporal, sangramento retal, consistência das fezes e mortalidade.
- No oitavo dia, eutanize o rato por luxação cervical.
Figura 1: Linha do tempo para o modelo de murina induzido por TNBS da doença de Crohn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Separação e avaliação macroscópica do cólon
NOTA: Um dia antes da separação do cólon, diluir 100 μL de antibiótico em 1 mL de salino tampão fosfato (PBS) e sair a 4 °C durante a noite.
- Limpe a pele sobre o abdômen usando 75% de etanol e gaze estéril.
- Corte a parede abdominal do osso do peito ao ânus usando tesouras e pinças estéreis.
- Corte o cólon o mais próximo possível do ânus e do ceco.
- Coloque o cólon na placa de Petri. Corte o cólon junto do ânus até a extremidade do ceco. Limpe e lave o cólon 2-4 vezes em solução de antibiótico-PBS frio.
- Realizar avaliação macroscópica usando uma pinça de acordo com a Tabela 1.
NOTA: Adesão ao tecido* e eritema/hemorragia#,sangue fecal# e diarreia# estão sujeitos à avaliação visual. * A adesão tecidual avalia utilizando uma escala de três pontos (0: cólon sem adesão tecidual, 1: cólon com adesão moderada do tecido, 2: cólon com extensa adesão tecidual); #baseado na ausência (0) ou presença (1) de eritema/hemorragia, sangue fecal e diarreia.
| Adesão* | Eritema/ hemorragia# | Sangue fecal# | Diarréia | Comprimento da úlcera | Espessura do cólon | Comprimento do cólon |
| pontos (0 – 2) | pontos (0 – 1) | pontos (0 – 1) | pontos (0 – 1) | cm/pontos | mm/pontos | cm/pontos |
| 0 – ausente | 0 – ausente | 0 – ausente | 0 – ausente | 0,5 cm = 0,5 ponto | n mm = n pontos | 0 – <10% menor que o controle |
| 1 – moderado | 1 – presente | 1 – presente | 0,5 – fezes leves/soltas | 1 – de 10 a 20% menor que o controle | ||
| 2 – presente | 1 – presente | 2 – mais de 20% mais curto que o controle |
Tabela 1: Pontuação macroscópica do intestino de camundongos com modelo induzido por TNBS da doença de Crohn.
- Converta o comprimento da úlcera em centímetros para uma escala de ponto, ou seja, cada 0,5 cm de úlcera é contado como 0,5 ponto. Converta a espessura do cólon em milímetros em uma escala de pontos, ou seja, cada n mm corresponde a n pontos.
- Converta o comprimento do cólon em centímetros em uma escala de três pontos. O comprimento do cólon obtido de cada rato com a doença de Crohn induzida pelo TNBS é avaliado em relação ao comprimento médio do cólon para o grupo controle (0: <10% menor que o controle, 1: de 10 a 20% menor que o controle, 2: mais de 20% mais curto que o controle).
- Calcular o escore macroscópico total de acordo com a equação: Escore macroscópico total = adesão (pontos) + eritema/hemorragia (pontos) + sangue fecal (pontos) + diarreia (pontos) + comprimento da úlcera (pontos) + espessura do cólon (pontos) + comprimento do cólon (pontos).
3. Preparação da amostra de cólon
- Corte o cólon em fragmentos de 1-2 cm e coloque cada um na esponja em um histológico devidamente rotulado.
NOTA: Esponjas para histológicas evitam a dobra do cólon durante a desidratação e a incubação na parafina líquida. - Coloque o fragmento do cólon em 4% de formaldeído e incubar por pelo menos 24 h a 4 °C.
- Preparar e programar o processador de tecidos para 1h de incubação em 50%, 70%, 90%, 95%, 100% etanol, xileno/100% etanol (1:1; v/v), e xileno apenas, bem como para pelo menos 3h de incubação em parafina líquida.
NOTA: A desidratação deve ser realizada no aumento das concentrações de etanol e xileno, mas a concentração de etanol pode ser modificada. A mistura de xileno/etanol é recomendada, mas não necessária. - Transfira o fragmento do cólon para uma caixa histológica e coloque no processador de tecido pré-programado.
- Execute o processador de tecido.
- Após os passos de incubação, coloque o fragmento de cólon em um molde metálico para que as duas extremidades do cólon estejam em posição vertical e preencha um terço do molde com parafina líquida.
- Coloque o molde na área de resfriamento (-5 °C) por alguns segundos e, em seguida, mova o molde para a área de aquecimento (70 °C). Coloque na parte inferior da caixa histológica e cubra todo o fragmento de cólon com parafina líquida.
- Deixe o molde metálico com o fragmento de cólon na parafina por alguns minutos na área de resfriamento. Retire o molde metálico do bloco de parafina e incuba por pelo menos 24 h a 4 °C.
- Remova o excesso de parafina do bloco e insira-o em um microtome rotativo totalmente automatizado.
NOTA: O bloco de parafina pode ser armazenado a -20 °C por alguns minutos antes desta etapa. - Corte o fragmento do cólon em seções de 5 μm.
- Transfira a seção do cólon para um banho de água pré-aquecido a 40 °C.
- Use a lâmina de vidro etiquetada para remover a seção de cólon do banho de água.
NOTA: As seções de cólon flutuam sobre a água. Coloque a lâmina de vidro etiquetada na água a seção do cólon e retire cuidadosamente a lâmina de vidro. - Deixe a lâmina de vidro por 24 h em temperatura ambiente. Para armazenamento a longo prazo, mantenha a lâmina de vidro a 4 °C após 24 h de incubação à temperatura ambiente.
4. Imunohistoquímica com coloração de imunofluorescência
NOTA: Não permita que a seção do cólon seque em nenhuma etapa durante o procedimento.
- Remova a parafina incubando o deslizamento de vidro em xileno por 5 min. Repita este passo três vezes.
- Coloque a lâmina de vidro em xileno/100% etanol (1:1; v/v) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.
- Reidratar a seção de cólon em uma série de concentrações de etanol decrescentes, ou seja, 70%, 50%, 30% e 10% etanol por 5 min. Repita cada passo três vezes.
- Enxágüe a lâmina de vidro em água corrente por 5 min.
- Tampão de recuperação de antígeno pré-aquecimento (citrato de sódio de 10 mM; 0,05% Tween 20, pH 6.0) a 95-98 °C e aqueça a lâmina de vidro em solução de recuperação de antígeno fervente por 10 min.
NOTA: A etapa de recuperação de antígenos é opcional, mas recomendada. A solução de desmascaramento deve ser otimizada dependendo do anticorpo usado no experimento. - Desenhe um círculo ao redor da seção de cólon usando uma caneta hidrofóbica.
NOTA: Esta etapa é opcional, mas recomendada. A caneta hidrofóbica evita o desperdício de reagentes mantendo o líquido agrupado em um pequeno volume dentro marcado pelo círculo. - Incubar a seção em 3% de solução de água de peroxidase de hidrogênio por 10 min.
- Lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) por 5 min.
- Incubar na solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) por 1h à temperatura ambiente.
NOTA: Na solução de bloqueio, o soro normal deve ser da mesma espécie do anticorpo secundário. Nos estágios em que a incubação é necessária, coloque o deslizamento de vidro em uma câmara de umidade para evitar evaporação excessiva. - Remova a solução de bloqueio e adicione 20-50 μL de anticorpo primário contra ERα, ERβ ou GPER diluído em albumina de soro bovino de 1% com 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100.
NOTA: As diluições recomendadas dos anticorpos primários são mostradas na Tabela 2.
| Tipo de anticorpo | Anticorpo contra | Clonalidade | Espécies hospedeiras | Reatividade de espécies | Diluição |
| Primária | ERα | Polyclonal | Coelho | Humano | 1:100 |
| Mouse | |||||
| Tartaruga | |||||
| Capivara | |||||
| ERβ | Polyclonal | Coelho | Humano | ||
| Macaco | |||||
| Rato | |||||
| Mouse | |||||
| Ovelhas | |||||
| Porco | |||||
| GPER | Polyclonal | Coelho | Humano | ||
| Rato | |||||
| Mouse | |||||
| Secundário | DyLight 650 | Polyclonal | Cabra | Coelho | 1:250 |
Tabela 2: Características dos anticorpos.
- Incubar com anticorpo primário durante a noite a 4 °C na escuridão.
- Remova a solução de anticorpos e lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.
- Adicione 20-50 μL de anticorpo secundário DyLight 650 diluído em albumina de soro bovino de 1% (contendo 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Incubar com anticorpo secundário conjugado com tintura por 1 h à temperatura ambiente na escuridão.
NOTA: A diluição recomendada do anticorpo secundário é mostrada na Tabela 2. - Remova a solução de anticorpos e lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.
- Adicione 2% de DiOC6(3) diluído em 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl e incubar por 10 min à temperatura ambiente na escuridão.
- Remova a solução e lave na solução de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) por 5 min. Repita esta etapa três vezes.
- Adicione algumas gotas de líquido à base de glicerol com DAPI diretamente na seção do cólon e cubra cuidadosamente com um slide de cobertura. Incubar a seção de cólon por pelo menos 24 h a 4 °C.
NOTA: Evite bolhas de ar ao cobrir o tecido com a lâmina da tampa. - Analise a seção de cólon microscópio confocal com objetivos de 20x ou 63x e imersão em óleo usando software dedicado.
NOTA: A Tabela 3 lista características dos fluorocromos utilizados neste estudo.
| Tipo fluorochome | Comprimento de onda (nm) | Tintura | |
| Excitação | Emissão | ||
| DAPI | 405 | 460 – 480 | Azul |
| DioC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Verde |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | Vermelho |
Tabela 3: Características dos fluorocromos.
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Resultados
Características macroscópicas de cólons em camundongos com doença de Crohn induzida pelo TNBS
Imagens representativas de cólons retirados do controle e camundongos tratados com TNBS são mostradas na Figura 2. Em camundongos com um modelo induzido por TNBS da doença de Crohn, o comprimento do cólon é reduzido enquanto a largura do cólon é aumentada.
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Discussão
Existem inúmeros modelos animais para o exame de fisiopatologia do IBD, incluindo modelos genéticos, imunológicos ou espontâneos, bem como modelos quimicamente induzidos15. Entre os vários tipos de modelos animais de colite, modelos quimicamente induzidos, como o modelo induzido pelo TNBS descrito neste protocolo, são relativamente baratos e fáceis de obter. O modelo de murina induzida pelo TNBS tem vários sintomas clínicos relacionados à base patológica do CD. Animais com colite induzida são cara...
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
O trabalho foi publicado graças ao apoio financeiro das autoridades da Universidade de Lodz: Vice-Reitor de Pesquisa Científica, Vice-Reitor de Cooperação Nacional e Internacional e Reitor da Faculdade de Biologia e Proteção Ambiental. Damian Jacenik foi apoiado por subsídios (2017/24/T/NZ5/00045 e 2015/17/N/NZ5/00336) do National Science Centre, Polônia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Animais | |||
| BALB/C camundongos | Universidade de Lodz | NA | |
| strong>Equipamento | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Bloco de papelão | NA | NA | |
| Microscópio confocal - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Micrótomo rotativo totalmente automatizado - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Lâmina de vidro | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Módulo de Incorporação de Parafina Aquecida - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Caixa histológica | Marfour | LN.138747 | |
| Caneta hidrofóbica | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Balança de laboratório | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Molde metálico | Marfour | CP.5105 | |
| Gaze estéril | NA | NA | |
| Tesoura estéril | NA | NA | |
| Pinça estéril | NA | NA | |
| Processador de tecidos - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| strong>Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzeno sulfônico | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 anticorpo secundário | Abcam | ab96886 | |
| ER &alfa; anticorpo primário | Abcam | ab75635 | |
| ER β anticorpo primário | Abcam | ab3576 | |
| Etanol | Avantor Performance Materials Polônia | 396480111 | |
| Formaldeído | Avantor Performance Materials Polônia | 432173111 | |
| GPER anticorpo primário | Abcam | ab39742 | |
| Ácido clorídrico | Avantor Performance Materials Polônia | 575283421 | |
| Peroxidase | de hidrogênio Avantor Performance Materials Polônia | 885193111 | |
| isoflurano (forano) | Baxter | 1001936040 | |
| Soro de cabra normal | Gibco | 16210064 | |
| Parafina | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Placa de Petrie | Nest Scientific | 705001 | |
| Tampão fosfato solução salina | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Solução salina fisiológica | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiótico) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant com DAPI (líquido à base de glicerol com DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Cloreto de sódio | Chempur | WE / 231-598-3 | |
| Citrato de sódio | Avantor Performance Materials Polônia | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Polônia | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materiais Polônia | BA0860119 |
Referências
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Reimpressões e permissões
