Knockdown estável de genes codificando proteínas matrizes extracelulares na linha célula do mioblasto C2C12 usando pequeno-hairpin (sh)RNA

Nandaraj Taye; Sarah Stanley; Dirk Hubmacher

doi:10.3791/60824

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Artigo de método

Knockdown estável de genes codificando proteínas matrizes extracelulares na linha célula do mioblasto C2C12 usando pequeno-hairpin (sh)RNA

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DOI:

10.3791/60824

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12 de fevereiro de 2020

Nandaraj Taye¹ , Sarah Stanley¹ , Dirk Hubmacher¹

¹Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

Fornecemos um protocolo para derrubar genes que codificam proteínas de matriz extracelular (ECM) em mioblastos C2C12 usando rNA de pino pequeno (sh). Visando o ADAMTSL2 como exemplo, descrevemos os métodos para a validação da eficiência de knockdown no nível mRNA, proteína e celular durante o mioblasto C2C12 à diferenciação do miotubo.

Resumo

As proteínas de matriz extracelular (ECM) são cruciais para o desenvolvimento muscular esquelético e homeostase. A derrubada estável da codificação de genes para proteínas ECM em mioblastos C2C12 pode ser aplicada para estudar o papel dessas proteínas no desenvolvimento muscular esquelético. Aqui, descrevemos um protocolo para esgotar a proteína ECM ADAMTSL2 como exemplo, usando rna de pino pequeno (sh) em células C2C12. Após a transfecção de plasmídeos shRNA, as células estáveis foram selecionadas em lote usando puromicina. Descrevemos ainda a manutenção dessas linhas celulares e a análise penópeica via expressão mRNA, expressão proteica e diferenciação C2C12. As vantagens do método são a geração relativamente rápida de células de knockdown C2C12 estáveis e a diferenciação confiável das células C2C12 em miotubos multinucleados após o esgotamento do soro no meio da cultura celular. A diferenciação das células C2C12 pode ser monitorada por microscopia de campo brilhante e medindo os níveis de expressão de genes marcadores canônicos, como MioD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC) indicando a progressão da diferenciação do mioblasto C2C12 em miotubos. Em contraste com a derrubada transitória de genes com RNA de pequeno interferção (si), genes que são expressos mais tarde durante a diferenciação do C2C12 ou durante o amadurecimento do miotubo podem ser alvo de forma mais eficiente, gerando células C2C12 que expressam shRNA. Limitações do método são uma variabilidade nas eficiências de knockdown, dependendo da shRNA específica que pode ser superada usando estratégias de nocaute genético baseadas no CRISPR/Cas9, bem como potenciais efeitos fora do alvo do shRNA que devem ser considerados.

Introdução

As proteínas de matriz extracelular (ECM) fornecem suporte estrutural para todos os tecidos, mediam a comunicação celular-célula e determinam o destino celular. A formação e remodelação dinâmica do ECM são, portanto, fundamentais para manter a homeostase tecidual e órgão¹^,². Variantes patológicas em vários genes codificando proteínas ECM dão origem a distúrbios musculoesqueléticos com fenótipos que vão desde distrofias musculares até construção pseudomouscular³^,⁴. Por exemplo, variantes patogênicas em ADAMTSL2 causam a desordem musculoesquelét....