Um protocolo de mineração de genoma guiado por espectrometria em massa é estabelecido e descrito aqui. Baseia-se em informações de seqüência de genomas e análise sustal e tem como objetivo facilitar a identificação de moléculas de extratos microbianos e vegetais complexos.
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Artigo de método
Mineração de genoma guiada por espectrometria em massa como ferramenta para descobrir novos produtos naturais
Neste artigo
Resumo
Resumo
O espaço químico coberto por produtos naturais é imenso e amplamente não reconhecido. Portanto, são desejadas metodologias convenientes para realizar uma avaliação abrangente de suas funções na natureza e potenciais benefícios humanos (por exemplo, para aplicações de descoberta de medicamentos). Este protocolo descreve a combinação de mineração de genoma (GM) e rede molecular (MN), duas abordagens contemporâneas que combinam anotações codificadas por genes em sequenciamento de genoma inteiro com assinaturas de estrutura química a partir de extratos metabólicos brutos. Este é o primeiro passo para a descoberta de novas entidades naturais. Esses conceitos, quando aplicados em conjunto, são definidos aqui como mineração de genoma guiada por MS. Neste método, os principais componentes são previamente designados (usando MN), e novos candidatos estruturalmente relacionados estão associados a anotações de seqüência de genoma (usando GM). A combinação de GM e MN é uma estratégia lucrativa para atingir novos backbones de moléculas ou perfis metabólicos de colheita, a fim de identificar análogos de compostos já conhecidos.
Introdução
As investigações do metabolismo secundário consistem frequentemente na triagem de extratos brutos para atividades biológicas específicas seguidas de purificação, identificação e caracterização dos constituintes pertencentes a frações ativas. Esse processo tem se mostrado eficiente, promovendo o isolamento de diversas entidades químicas. No entanto, hoje em dia isso é visto como inviável, principalmente devido às altas taxas de redescoberta. Como a indústria farmacêutica revolucionou sem o conhecimento dos papéis e funções dos metabólitos especializados, sua identificação foi realizada em condições laboratoriais que não representavam com precisão a natureza
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Protocolo
1. Mineração de genoma para aglomerados genéticos biossintéticos
- Realizar o sequenciamento de genomainteiro (WGS) como o primeiro passo para eleger um cluster genético biossintético (BCG) para a mineração de genoma suscitado por MS. Todo o esboço de genoma da cepa de interesse (bactérias) pode ser obtido pela tecnologia Illumina MiSeq usando o seguinte com DNA genômico de alta qualidade: shotgun TruSeq PCR-Free library prep e Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.
NOTA: Após o sequenciamento, a biblioteca de espingardas Illumina e a biblioteca do par de companheiros de Illumina podem ser montadas usando o Newbler v3.0 (Roche,....
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Resultados
O protocolo foi exemplificado com sucesso usando uma combinação de mineração de genoma, expressão heteróloga e abordagens guiadas por MS/código para acessar novas moléculas análogas especializadas de valinomicina. O fluxo de trabalho genoma-molécula para o alvo, valinomicina (VLM), está representado na Figura 8. Estreptomices sp. CBMAI 2042 foram analisados em sílico, e o aglomerado genético VLM foi então identificado e transferido para um hospedeiro heterólogo. Cepas heterostióloga.......
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Discussão
A maior vantagem deste protocolo é sua capacidade de dispor rapidamente perfis metabólicos e unir informações genômicas com dados de MS, a fim de elucidar as estruturas de novas moléculas, especialmente análogos estruturais2. Com base em informações genômicas, diferentes quimiotipos de produtos naturais podem ser investigados, como poliketidas (PK), peptídeos não ribossômicos (NRP) e produtos naturais glicosilados (GNP), bem como BGCs enigmáticos. A triagem metabolômica produz evidências de perfis.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
O apoio financeiro para este estudo foi fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 e 2014/50249-8 para L.G.O; 2013/12598-8 e 2015/01013-4 para R.S.; e 2019/08853-9 para C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A., e L.G.O. receberam bolsas do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 e 313492/2017-4). L.G.O. também agradece pelo apoio à bolsa do programa Para Mulheres na Ciência (2008, Edição Brasileira). Todos os autores reconhecem a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) por apoiar os programas de pós-graduação no Brasil.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetonitrila | Tedia | AA1120-048 | HPLC grau |
| Agar | Oxoid | LP0011 | NA |
| Apramicina | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Carpenicilina | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Centrífuga | Eppendorf | NA | 5804 |
| Cloranfenicol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Coluna C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µ m, limite de pressão de 1200 bar P/N 757700-902 |
| Kanamycin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Microcentrífuga | Eppendorf | NA | 5418 |
| Ácido nalidíxico | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash PCR de alta fidelidade Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF espectrômetro de massa | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | Synth | NA | |
| NA Shaker/Incubadora | Marconi | MA420 | NA |
| Cloreto de Sódio | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Extrato de soja | NA | NA | NA |
| Sacarose | Synth | NA P | . A. - ACS |
| Thermal Cycles | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Triptona | Oxóide | LP0042 | NA |
| Triptona Caldo de Soja | Oxóide | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC Sistema |
| Extrato de levedura | Oxóide | LP0021 | NA |
Referências
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
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Reimpressões e permissões
