Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

Imagem Hiperespectral (HSI) é uma técnica que gera um mapa espacial onde cada coordenada x-y contém uma informação espectral que poderia ser baseada em qualquer tipo de espectroscopia, ou seja, fotoluminescência, absorção e espectroscopia de dispersão^1,2,3. Como resultado, um conjunto tridimensional de dados (também chamado de "cubo hiperespectral") é obtido, onde as coordenadas x-y são os eixos espaciais e a coordenada z é a informação espectral da amostra analisada. Portanto, o cubo hiperespectral contém informações espaciais e espectrais, proporcionando uma investigação espectroscópica mais detalhada da amostra do que a espectroscopia tradicional. Embora o HSI seja conhecido há anos no campo do sensoriamento remoto (porexemplo, geologia, indústrias alimentícias^4),recentemente emergiu como uma técnica inovadora para a caracterização de nanomateriais^2,,5 ou sondas para aplicações biomédicas^3,,6,7,8. De um modo geral, não se limita ao domínio UV/visível/infravermelho próximo (NIR), mas também pode ser estendido usando outras fontes de radiação, como raios-X – por exemplo, a fim de caracterizar a distribuição elementar em diferentes materiais⁹ – ou a radiação Terahertz, onde o HSI foi usado para realizar sensoriamento térmico em tecidos biológicos⁸. Além disso, o mapeamento da fotoluminescência foi combinado com o mapeamento de Raman para sondar as propriedades ópticas da monocamada MoS₂¹⁰. No entanto, entre as aplicações relatadas de HSI óptico, ainda existem apenas alguns exemplos de HSI de materiais à base de lantthanidas^{11,,12,,13,,14,,15,,16,17}. Por exemplo, podemos citar: detecção de câncer nos tecidos⁶, análise da profundidade de penetração da luz em tecidos biológicos⁷, imagem biológica multiplexada^3,análise de transferência de energia multicomponente em sistemas híbridos¹¹, e investigação de alterações induzidas por agregação nas propriedades espectroscópicas de nanopartículas de upconverter¹². Claramente, a atratividade do HSI decorre de sua adequação à geração de conhecimento sobre luminescência específica do ambiente, fornecendo informações espaciais e espectrais simultâneas sobre a sonda.

Aproveitando essa poderosa técnica, descrevemos um protocolo para investigar a anisotropia óptica da tb heterodinuclear Tb³⁺-Eu³⁺ cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆](Figura 1a)¹³. A anisotropia óptica observada resultou da embalagem molecular diferente dos íons^{Ln 3+} nas diferentes direções cristalográficas(Figura 1b),resultando em alguns rostos de cristal mostrando mais brilhante, outros mostrando fotoluminescência dimmer. Foi sugerido que o aumento da intensidade de luminescência em faces específicas do cristal estava correlacionado com uma transferência de energia mais eficiente ao longo dessas direções cristalográficas onde o Ln³⁺··· Em³⁺ distâncias de íons foram as mais curtas¹³.

Motivados por esses resultados, propomos o estabelecimento de uma metodologia detalhada para analisar a anisotropia óptica por meio do HSI, abrindo caminho para melhor compreensão dos processos de transferência de energia íon-íon e propriedades luminescentes ajustáveis decorrentes de arranjo molecular específico^18,19. Essas relações estrutura-propriedades têm sido reconhecidas como aspectos importantes para o design inovador de materiais ópticos, incluindo, mas não se limitando a sistemas de guias de ondas e dispositivos de armazenamento optomagnético em nano e microescala – atendendo à demanda por sistemas ópticos mais eficientes e miniaturizados²⁰.

ATENÇÃO: Recomenda-se usar óculos de segurança específicos para o comprimento de onda de excitação que seja usado em todos os momentos durante a operação do imager.

1. Configuração do microscópio hiperespectral

NOTA: Uma visão geral do sistema de imagem hiperespectral é dada na Figura 2a,com os principais componentes do imager sendo descritos. O sistema de imagem pode ser usado para a detecção da emissão visível ou infravermelha próxima (NIR) de uma amostra. Dependendo de qual detecção é desejada (visível ou NIR), a luz passa por dois caminhos de luz diferentes (Figura 2e). Uma combinação de diferentes cubos giradores de feixe e cubos de filtro dicoicos (cubos ópticos) deve ser posicionada em posições específicas no instrumento para selecionar o respectivo caminho.

1. Energia no computador que está conectado ao sistema de imagem. Ligue o monitor do computador.
2. Defina a configuração óptica adequada do cubo(Figura 2b,c).
   NOTA: Aqui, a configuração do imager(configuração do cubo óptico)para mapeamento de HSI usando excitação UV e detecção de emissões visíveis é descrita. No entanto, também é possível alterá-lo para excitação nir e detecção visível ou de emissão de NIR, dependendo da amostra analisada. Consulte a seção Resultados representativos, por exemplo.
   1. A partir do estágio do microscópio (1 na Figura 2a) e seguindo o caminho do feixe de emissão em direção aos detectores (3 na Figura 2a),deixe a primeira posição para um cubo óptico (4 na Figura 2b) vago e coloque o cubo óptico de microscópio confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 5 na Figura 2b,de modo que a emissão da amostra seja direcionada através do caminho de luz visível.
   2. Olhando ao longo do caminho óptico em direção ao detector, coloque o cubo óptico visível (CM1-P01), que contém o espelho dicórico e os filtros para direcionar a emissão visível para os caminhos de detecção, na posição indicada como 6 na Figura 2b.
   3. Continuando o caminho em direção ao detector, coloque o cubo óptico de pinhole confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 7 na Figura 2b para direcionar a luz através do caminho de detecção de luz visível. Em seguida, seguindo o caminho, coloque o cubo óptico espectrômetro confocal (DFM1-P01) na posição 8 na Figura 2c para que a luz emitida atinja o detector.
   4. Para o mapeamento do HSI, controle manualmente a abertura da fenda do detector (9 na Figura 2c)para combinar com o tamanho dos orifícios utilizados (cerca de 50 mm é ótimo).
   5. No software PHySpec, escolha a abertura do orifício (5 na Figura 3).
      NOTA: Quanto menor a abertura do orifício, melhor é a resolução do HSI, ao custo da intensidade do sinal.
3. Ligue a lâmpada de banda larga(Figura 2d,inset) posicionando o interruptor (10 na Figura 2d)na posição ON. Para controlar a intensidade da luz de excitação, gire o botão indicado por 11 (Figura 2d) para valores mais altos (32 – menor intensidade) ou menores (1 – maior intensidade). Mantenha o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2d) fechado durante a configuração.
   NOTA: Os valores mais elevados correspondem à maior atenuação da densidade de potência emitida pela lâmpada, enquanto valores mais baixos correspondem à menor atenuação.
4. Ligue o seguinte hardware na ordem dada abaixo, definindo seus switches na posição ON:
   1. Ligue o controlador de movimento ThorLabs.
   2. Ligue a fonte de energia Nikon.
   3. Ligue o controlador ASI.
   4. Ligue o controlador Galvo.
   5. Ligue o detector ProEm.
   6. Ligue o detector Bayspec.
5. No computador, abra o software PHySpec clicando duas vezes em seu ícone.
   1. Pressione a tecla F8 no teclado para inicializar o sistema de conversão IMA Upconversion e clique no botão OK na janela Conectar ao sistema.
      NOTA: Passo 1.5.1. também pode ser realizado clicando na guia Sistema e, em seguida, clicando em Conectar para chegar à janela Conectar ao sistema. Em seguida, o botão OK pode ser clicado para conectar o sistema de imagem ao software.
   2. Certifique-se de que todos os menus aparecem na interface(Câmera colorida, ProEm e Bayspec),bem como no painel de controle de instrumentos, no lado esquerdo da tela, conforme mostrado na Figura 3.

2. Imagem hiperespectral de um cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)₆]

1. Para preparar a amostra, coloque o cristal em uma lâmina de vidro de microscopia. Caso seja necessário usar uma ampliação mais elevada, cubra o cristal com um vidro de cobertura fina e fixe-o com fita adesiva, para que a amostra possa ser colocada com o vidro de cobertura fina voltado para a lente objetiva.
2. Coloque o slide de vidro no qual a amostra foi preparada no estágio do microscópio e fixe-a usando os braços metálicos(Figura 4a,b).
3. Mova a amostra usando o joystick(Figura 4c)do controlador ASI para posicionar a amostra sobre os objetivos em uso.
4. Posicione manualmente o cubo do filtro direito na roda sob os objetivos (3 na Figura 5) para selecionar a excitação UV da lâmpada e deixar passar a emissão visível em direção ao detector.
   NOTA: Cubos de filtro adicionais estão disponíveis para usar excitação de luz verde ou azul, portanto, ter o cubo de filtro certo no lugar é importante para o comprimento de onda de excitação apropriado.
5. Posicione manualmente o objetivo 20X (indicado por 5 na Figura 5) sob a amostra e pressione o botão branco (6 na Figura 5) no lado esquerdo do microscópio para acender a luz branca.
   1. Ajuste o brilho girando o botão sob o botão de energia da luz branca (7 na Figura 5).
6. No software PHySpec, pressione o botão Play (vídeo) na janela da câmera colorida, o que causará a aquisição de uma varredura ao vivo.
   1. Se a janela da câmera colorida mostrar uma imagem preta, aumente o Tempo de Exposição (2 na Figura 3) e/ou o Valor de Ganho (3 na Figura 3) encontrado no painel de controle do instrumento, sob a guia Câmera Colorida. Se a imagem visualizada for muito brilhante, diminua o tempo de exposição e/ou ganhe valor.
   2. Certifique-se de que o botão dianteiro no lado direito do microscópio (2 na Figura 5) está configurado como R, a fim de enviar 20% do sinal para a câmera/binóculos e 80% do sinal para o detector.
7. Concentre-se na amostra ajustando a distância entre o objetivo e o estágio(Figura 4b). Isso é feito girando os botões mostrados na Figura 4d no lado direito do microscópio.
   NOTA: O botão maior é usado para ajustes grosseiros, enquanto o botão menor é para mudanças mais delicadas e pequenas de foco.
8. Certifique-se de que o objetivo escolhido manualmente também seja selecionado no software. Primeiro, clique no botão Exibir na barra superior do menu e, em seguida, clique em uma barra de escala Show/hide para exibir a barra de escala na imagem (1 na Figura 3). Em seguida, vá para a guia Galvanometer no painel de controle de instruções e selecione o Objetivo utilizado (4 na Figura 3). Certifique-se de que a barra de escala exibida está correta selecionando o objetivo adequado no software.
9. No software, selecione o detector apropriado indo para a guia Desvior (ProEM – 6 na Figura 3) e grades indo para a aba Filtro (1200 gr/mm no caso do ProEM – 7 na Figura 3) sob a guia SpectraPro SP-2300 .
10. Abra o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2) para permitir que ocorra a excitação UV da amostra. Gire o botão de intensidade (11 na Figura 2d) para a posição desejada (por exemplo, 8 – intensidade intermediária) para controlar a intensidade da excitação da lâmpada de banda larga (UV).
    1. Para escolher entre iluminação de campo largo (abertura aberta) ou uma iluminação de ponto menor (abertura mais fechada), controle o tamanho da abertura do campo da lâmpada UV usando a vara e os botões mostrados em 4 na Figura 5.
11. Na guia SpectraPro SP-2300, selecione um comprimento de onda para observar a emissão da amostra.
12. Se os comprimentos de onda de emissão da amostra forem desconhecidos, adquira um espectro de emissões.
    1. No sequenciador, clique no sinal + para adicionar uma nova seqüência ("nó") para a aquisição de um espectro de emissões.
       1. Clique no Espectrômetro e, em seguida, aquisição de espectro (com varredura espectral).
       2. Insira um comprimento de onda mínimo (ou seja, 400 nm) e um comprimento de onda máximo (ou seja, 700 nm) e clique em OK para definir a faixa espectral na qual o espectro será gravado.
       3. Escolha o Tempo de Exposição adequado no menu do lado esquerdo do software. Escolha tempos mais curtos (por exemplo, 0,1 s) para amostras muito brilhantes e tempos mais longos (por exemplo, 2 s) para emissores dim.
       4. Ajuste a potência de excitação em caso de excitação da lâmpada de banda larga (UV) (ver passo 1.3 acima).
          NOTA: No caso de excitação de diodo NIR, pode ser ajustado a partir do menu suspenso de densidade neutra no lado esquerdo do software PHySpec.
    2. No sequenciador, clique no botão de reprodução dupla para executar toda a seqüência. Uma vez mostrado o espectro, observe as regiões de interesse para a detecção da emissão amostral (por exemplo, 580 a 640 nm no caso de amostras baseadas em Tb³⁺- e^{Eu 3+).}
    3. Conforme necessário, otimize a detecção de sinais alterando o foco da amostra ou ajustando o Tempo de Exposição no software PHySpec. Obter uma otimização adicional da detecção de sinal através do aumento da intensidade de emissão da amostra alterando a potência da fonte de excitação (lâmpada de banda larga), conforme descrito acima.
13. Ajuste o Tempo de Exposição ( porexemplo, 0,5 s – 2 na Figura 3) e Ganhe (3 na Figura 3) da Câmera Colorida em conformidade, para obter uma imagem de boa qualidade. Se necessário, adicione a barra de escala à imagem clicando na barra de escala Show/hide no botão Mostrar/ocultar a barra na segunda linha do menu na parte superior da janela do software PHySpec.
14. Recomendação: Antes de adquirir o cubo hiperespectral, grave uma imagem de microscopia óptica de campo brilhante do cristal sob luz branca (Figura 6a) e/ou UV full(Figura 6b)ou confinada(Figura 6c) (Figura 6c)iluminação (iluminação UV controlada pela abertura do obturador, mostrada como 4 na Figura 5). Para isso, com a amostra em foco, clique no botão de reprodução da câmera colorida.
15. Clique em 'Arquivo' e, em seguida, Exportar janela de exportação,escolha o formato desejado para exportar a imagem obtida e salve o arquivo com a extensão desejada (.h5, . JPEG).
16. Antes de adquirir a imagem hiperespectral, desligue a iluminação da luz branca, bem como a luz do quarto.
17. Para obter o cubo hiperespectral, escreva uma nova sequência. Portanto, no sequenciador, clique no sinal + para adicionar um novo nó.
    1. Clique em Confocal Imager.
       1. Clique em Aquisição multi-espectro. Aqui, o campo de visão desejado é definido pelo número de pontos a serem adquiridos nas direções x e y e pelo tamanho da etapa. Por exemplo, use 100 pontos em x e 100 pontos em y com um tamanho de passo de 5 μm para obter uma imagem de 500 por 500 μm.
          Nota: O número total de pontos de aquisição e o tempo de integração em cada ponto afetarão diretamente o tempo total de aquisição do cubo hiperespectral.
          1. Insira a posição X desejada (por exemplo, 100) e a posição Y (por exemplo, 100) conta, bem como o tamanho do passo desejado (por exemplo, 5 μm). Selecione a opção Hardware para a sincronização da câmera, para mapeamento de emissões visíveis (e opção de software em caso de detecção de NIR). Clique em OK.
18. No sequenciador, clique na recém-adicionada linha de aquisição multi-espectro para destacar o nó.
19. Clique no botão Reproduzir para executar o nó selecionado.
    NOTA: O tempo restante que a aquisição levará aparecerá ao lado do nó (em minutos, por exemplo, 28 min).
20. Uma vez concluída a aquisição, salve o cubo hiperespectral no formato de arquivo apropriado (.h5).

3. Análise de dados hiperespectrais

1. Logo após a aquisição, se o cubo hiperespectral salvo não abrir automaticamente no software, recuperar o cubo hiperespectral, que foi salvo como arquivo .h5, clicando no Arquivo na barra superior do menu e, em seguida, pairando o cursor e clique em Abrir arquivo.... Quando a janela intitulada Selecionar dados(s) para abrir aparece, escolha a pasta onde o arquivo .h5 é salvo e clique duas vezes no arquivo para abri-lo.
2. Uma vez que o arquivo do cubo hiperespectral seja importado, modifique a imagem do cubo hiperespectral exibido para mostrar a intensidade de um comprimento de onda espectral específico movendo a barra na parte superior da imagem do cubo para a esquerda (comprimento de onda inferior, por exemplo, 580 nm) ou direita (comprimento de onda mais alto, por exemplo, 638 nm).
   NOTA: O comprimento de onda selecionado é exibido no lado esquerdo desta barra superior (1 na Figura 7).
3. Após a escolha do comprimento de onda de interesse para a análise (por exemplo,a intensidade máxima, que no caso de [TbEu(bpm)(tfaa)₆] é de 613,26 nm), faça um (ou todos) dos três tipos possíveis de análise espectral: (A) a distribuição espectral em forma de imagem (2 na Figura 7); (B) um perfil de intensidade de emissões em uma região de interesse (3 na Figura 7); c Extração de espectro em um ponto ou região de interesse específico (4 na Figura 7).
   1. No caso da distribuição espectral de uma imagem, use a função Crop e Bin para aumentar a relação sinal-ruído na imagem. Para fazer isso, clique no menu superior Processamento e escolha Data e, em seguida, a opção Crop e Bin.
   2. Para um perfil de intensidade de emissão, na imagem do cubo, clique com o botão direito do mouse e selecione o perfil Criar destino ou Criar X ou Criar perfil Y, dependendo se apenas um ponto (Alvo - 5 e 6 na Figura 7) ou uma linha (Perfil - 7 e 8 na Figura 7) precisar ser analisado. Selecione a área de análise arrastando o alvo, o perfil de linha horizontal ou vertical com o cursor e mova-o através do cubo.
      1. Uma vez que o perfil tenha sido devidamente selecionado, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar destino a gráfico. Escolheu a opção de criar um novo gráfico para exibir a intensidade de emissão (eixoy) em função da posição física do alvo (eixox). O espectro aparecerá no novo gráfico que foi inserido (6 e 7 na Figura 7).
         NOTA: Vários alvos podem ser criados, e estes aparecerão como diferentes perfis de emissões coloridas (5 e 6 na Figura 7).
   3. Alternativamente, obter um espectro de emissão de uma área específica da amostra (9 na Figura 7). Para começar, gire o cursor sobre a imagem do cubo e clique com o botão direito do mouse. Clique nas opções Seleção de Retângulo ou Seleção de Elipse na guia que aparece.
      1. Desenhe a forma de seleção (por exemplo, um retângulo) sobre a região desejada clicando e arrastando o cursor através do cubo. Uma vez que a área tenha sido devidamente selecionada, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar seleção ao gráfico.
      2. Na janela de agregação Adicionar ao gráfico,selecione Criar um novo gráfico para exibir o espectro de emissões do destino e clique em OK.
         NOTA: Uma nova linha colorida (8 na Figura 7) aparecerá no gráfico em que a emissão de destino está sendo mostrada, com a intensidade de emissão como o eixo y e o comprimento de onda no eixo x. Este espectro corresponde à intensidade média da área selecionada para cada comprimento de onda.
4. Uma vez que o espectro é obtido, salve-o antes de selecionar uma nova região porque apenas uma região pode ser selecionada por vez. Para isso, selecione a janela em que contém o gráfico. No menu Arquivo, selecione Salvar como e escolha salvar o gráfico na pasta de escolha, usando o nome de escolha, seja no formato .h5, que pode ser aberto no software PHySpec, ou no formato .csv, que pode ser importado no Excel.

Para ilustrar a configuração do microscópio hiperespectral para a aquisição de dados em um cristal único molecular baseado em Ln (ou seja, [TbEu(bpm)(tfaa)6], Figura 1a), a Figura 2 mostra uma visão geral do sistema, bem como a colocação correta dos cubos ópticos na configuração. A Figura 3 mostra uma captura de tela do software PHySpec contendo os menus usados durante a aquisição do HSI. A Figura 4 e a Figura 5 mostram o estágio do microscópio com mais detalhes, incluindo a colocação do slide de vidro contendo a amostra a ser analisada. A iluminação UV selecionada foi ligada para mostrar a luminescência vermelha visível do cristal (Figura 4a e 1 na Figura 5). A figura 6a mostra uma imagem de campo brilhante do cristal gravado após ajustar a amostra no foco adequado. A morfologia semelhante à agulha do cristal pode ser claramente vista. A figura 6b,c mostra a imagem do mesmo cristal sob excitação UV com visão completa(Figura 6b) ou iluminação localmente confinada(Figura 6c). Sob a ampla iluminação UV, as diferenças de brilho de emissão das diferentes faces do cristal são imediatamente visíveis. A iluminação confinada pode ser usada como uma opção, principalmente para investigar quaisquer efeitos de energia ou transferência de luz no cristal, o que pode desencadear um comportamento semelhante a um guia de ondas. Neste caso, uma emissão forte é detectada em um ponto não diretamente sob excitação. Isso sugere que a migração eficiente de energia ocorre através do cristal13 (5 e 6 na Figura 7).

A partir do cubo hiperespectral adquirido, é possível obter ainda a distribuição espectral na forma de uma imagem representando um comprimento de onda específico, o perfil de intensidade de um comprimento de onda de emissão específica, bem como o espectra de emissão em qualquer pixel ou área do cubo hiperespectral adquirido. Como exemplo, os espectros de emissão dados na Figura 7 (painel 4) mostram as bandas de emissão mais características do íonEu 3+: a banda observada a 590 nm é atribuída ao dipolo magnético (DM) 5D0→7F1 transição de Eu3+, enquanto os picos de emissão na região de 610 a 630 nm decorrem do dipolo elétrico forçado hipersensível (ED) 5D0→7F2 Eu3+ transição. A razão entre a intensidade integrada dessas duas transições é bem conhecida por ser uma excelente sonda do ambiente químico ao redor do íonLn 3+ na estrutura do cristal único21: quanto menor a simetria em torno do íonLn 3+, maior é a razão ED/MD. Isso permite tirar conclusões sobre o caráter simetria do ambiente químico do ÍonIn 3+. Além disso, a divisão Stark da transição 5D0→7F2 também pode ser correlacionada com a simetria em torno do Ln3+ em seu ambiente cristalográfico – quanto menor a simetria, maior é o número de subníveis Stark. No caso do polimorfo em forma de agulha cristalizado no sistema de cristal triclínico simétrico baixo, a transição 5D0→7F2 se divide em quatro subpicos (espectros mostrados na Figura 7, painel 4). Tal análise é particularmente atraente quando comparaas as propriedades ópticas de vários polimorfos de um cristal luminescente. Anteriormente, demonstramos que as informações sobre o ambiente químico deduzidas da análise óptica correlacionaram-se bem com a estrutura de cristal molecular obtida pela análise de raios-X de cristal único13. Além disso, o perfil espectral ao longo das diferentes faces cristalinas mostradas na Figura 7 (painel 3), indicando emissão mais brilhante na ponta e nas faces laterais, também pode ser correlacionado com o Ln3+··· Em3+ distâncias de íons nas três direções espaciais (Figura 1b): a embalagem mais densa Em3+ ao longo dos eixos perpendiculares à ponta e faces laterais, respectivamente, favorecem a transferência de energia íon-íon. Assim, observa-se o aprimoramento das emissões nas respectivas faces, assim, a anisotropia óptica.

No geral, as diversas opções de análise de dados, mostradas na Figura 7 e na Figura 8,constituem as características mais importantes das informações espectroscópicas e espaciais combinadas, que é possível ser explorada pela análise do HSI de amostras luminescentes.

Figura 1: Estrutura molecular e arranjo cristalográfico. (a) Estrutura do complexo heterodinuclear baseado em Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6], onde Ln1 e Ln2 são Tb3+ e Eu3+ íons. Grupos desordenados e átomos de hidrogênio são omitidos para clareza. Código de cor: Eu: ciano escuro; C: cinza; O: vermelho; N: azul; F: verde limão. (b) Representação da embalagem molecular no cristal: (i) vista superior e (ii) visão de ponta da estrutura de cristal único semelhante à agulha com Ln··· Em distâncias (subunidades tfaa e átomos de hidrogênio são omitidos para clareza). (iii) Arranjo de embalagem cristalina dos dimers [TbEu(bmp)(tfaa)6] (átomos de hidrogênio são omitidos para clareza). (iv) Diagrama das faces de crescimento cristalino do dimer revelando o menor Ln··· Em distâncias nas direções cristalográficas (0 1 0) e (2 -1 1). A figura foi modificada a partir da referência 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral do Sistema de Imagem Hiperespectral. Mostrada é a configuração necessária para o mapeamento de luminescência na região espectral visível usando excitação UV. (a) Visão geral do sistema, onde 1 é o estágio do microscópio, 2 é a seção que contém a configuração óptica, e 3 é o espectrômetro com os detectores visíveis e NIR. (b) Visão aberta da configuração óptica perto do estágio do microscópio (lado direito de a) mostrando a configuração óptica para o experimento: a posição do cubo óptico 4 permanece vazia e o cubo de microscópio confocal é colocado na posição 5, a fim de direcionar a luz através do caminho visível, o cubo visível é colocado na posição 6, a fim de direcionar a luz visível para o caminho de detecção, e o cubo de pinhole confocal é colocado na posição 7, a fim de direcionar a luz para a detecção do caminho visível. (c) Visão aberta da configuração óptica mais próxima dos detectores (lado esquerdo de a), mostrando a posição 8, onde o cubo espectrômetro confocal é colocado para refletir a luz para o espectrômetro e a câmera visível. A inset 9 mostra o parafuso para ajustar a largura de abertura da fenda do espectrômetro. (d) Vista do estágio do microscópio, do computador e da lâmpada de banda larga (usada para excitação UV). No inset, o controlador da lâmpada de banda larga é mostrado com mais detalhes: 10 é o botão liga/desliga, 11 é o botão para controlar a intensidade da lâmpada, e 12 é o botão do obturador. (e) Esquema que mostra o caminho óptico visível/NIR do estágio do microscópio até os detectores, incluindo as posições do cubo óptico de 4 a 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Captura de tela do software PHySpec mostrando o menu com os parâmetros a serem ajustados para o HSI. 1 permite inserir a barra de escala na imagem da câmera colorida; 2 e 3 permitem controlar o tempo de exposição e ganhar valor da câmera colorida, respectivamente; a lente objetiva adequada deve ser selecionada em 4; 5 permite a seleção da abertura do orifício; 6 (Desviador) e 7 (Filtro) permitem escolher o detector e a grade, respectivamente; o tempo de exposição do detector visível é definido em 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visão geral do estágio do microscópio. (a)Colocação do slide de vidro contendo a amostra no estágio, com a iluminação UV ON mostrando a luminescência vermelha da amostra (pequeno ponto vermelho no centro do escorregador de vidro). (b) Vista do estágio do microscópio com o condensador de iluminação de luz branca na parte superior. (c) Controlador de palco mostrando o joystick que controla o movimento do palco nas direções indicadas por setas laranja e amarela (também mostradas em (a). (d) Visão detalhada do botão de foco, que move o palco nas direções indicadas pela seta vermelha (também mostrada em (b)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Os componentes do estágio do microscópio. 1 estágio de microscópio com a amostra no slide de vidro colocada no estágio amostral em cima das lentes objetivas; 2 rodas para ajustar o foco (roda grande) e para direcionar a emissão capturada (roda pequena) apenas para o detector (L), parcialmente para o detector e parcialmente para a câmera (R), ou apenas para as lentes binóculos (olho); 3 roda de filtros de excitação/emissão usada para escolher a faixa de comprimento de onda de excitação. O detalhe à direita mostra o cubo do filtro segurando o filtro UV e o filtro de passagem longa usado neste experimento; 4 na parte superior/inferior são mostrados os botões para mover o feixe de excitação através da amostra, enquanto no meio, o controle de abertura de campo circular; 5 lentes objetivas; 6 Botão ON/OFF da iluminação de luz branca; 7 botão para ajustar o brilho da lâmpada de luz branca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagens de microscopia óptica do cristal único analisado. Estas imagens foram obtidas sob(a)iluminação de luz branca, (b) iluminação UV de visão total, utilizando a abertura circular de excitação completamente aberta, e (c) iluminação UV localmente confinada (marcada pelo círculo branco), usando uma abertura circular de excitação mais próxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Captura de tela do software PHySpec mostrando o processo de análise de dados do cubo hiperespectral. Diversos métodos de análise espectrais podem ser aplicados no cubo hiperespectral adquirido: 1 mostra o comprimento de onda escolhido para a distribuição de imagem espectral mostrada em 2; 3 mostra os perfis de intensidade horizontal (7) e vertical (8) de 613,26 nm; 4 mostra o espectro de emissão extraído dos alvos 5 e 6, bem como da área destacada em 9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Aplicação alternativa do HSI sondando a sinergia entre nanopartículas de upconverter e complexos de lantânio. Este exemplo mostra a análise hiperespectral de um sistema híbrido composto por cristais moleculares ([Tb2(bpm)(tfaa)6]) combinados com nanopartículas upconverter (NaGdF4:Tm3+, Yb3+). (a) Fotomicrografos sob iluminação de luz branca e UV, juntamente com a região de interesse (ROI) utilizada para imagens hiperespectrais sob irradiação de luz de 980 nm. (b) Emissões de Tm3+ e Tb3+ indiretas monitoradas em uma área de 20 x 20 μm2. ( c) A variação da intensidade absoluta das bandas de emissão oscilou em todo o sistema híbrido, indicando alguma variabilidade na quantidade total de material distribuída sobre a superfície. (d) A constância da razão entre a emissão integrada do complexo vs. Tm3+: 1G4→3H6 (quadrados) e Tm3+: 1G4→3F4 (círculos) confirmou a presença simultânea das duas moieties em todo o sistema híbrido e a interação homogênea entre eles. As barras de escala são de 20 μm nos fotomicrografos e 5 μm em ROIs e mapas espectrais. Fotomicrografias são apresentadas em cores reais. A Figura foi modificada a partir da referência 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para revelar. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.