Name: Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a realizar imagem hiperespectral luminescente para analisar anisotropia óptica em cristais únicos baseados em lantanídeos. Este protocolo combina aquisição de dados espectrais e espaciais para investigação detalhada.

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Os autores agradecem ao Sr. Dylan Errulat e ao Prof. Muralee Murugesu do Departamento de Química e Ciências Biomoleculares da Universidade de Ottawa pelo fornecimento de cristais únicos [TbEu(bpm)(tfaa)6] E.M.R, N.R., e E.H. reconhecem com gratidão o apoio financeiro fornecido pela Universidade de Ottawa, pela Fundação Canadense para a Inovação (CFI) e pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC).

ATENÇÃO: Recomenda-se usar óculos de segurança específicos para o comprimento de onda de excitação que seja usado em todos os momentos durante a operação do imager.
1. Configuração do microscópio hiperespectral
NOTA: Uma visão geral do sistema de imagem hiperespectral é dada na Figura 2a,com os principais componentes do imager sendo descritos. O sistema de imagem pode ser usado para a detecção da emissão visível ou infravermelha próxima (NIR) de uma amostra. Dependendo de qual detecção é desejada (visível ou NIR), a luz passa por dois caminhos de luz diferentes (Figura 2e). Uma combinação de diferentes cubos giradores de feixe e cubos de filtro dicoicos (cubos ópticos) deve ser posicionada em posições específicas no instrumento para selecionar o respectivo caminho.
<ol><li>Energia no computador que está conectado ao sistema de imagem. Ligue o monitor do computador.</li>
	<li>Defina a configuração óptica adequada do cubo(Figura 2b,c). NOTA: Aqui, a configuração do imager(configuração do cubo óptico)para mapeamento de HSI usando excitação UV e detecção de emissões visíveis é descrita. No entanto, também é possível alterá-lo para excitação nir e detecção visível ou de emissão de NIR, dependendo da amostra analisada. Consulte a seção Resultados representativos, por exemplo.<ol>
<li>A partir do estágio do microscópio (1 na Figura 2a) e seguindo o caminho do feixe de emissão em direção aos detectores (3 na Figura 2a),deixe a primeira posição para um cubo óptico (4 na Figura 2b) vago e coloque o cubo óptico de microscópio confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 5 na Figura 2b,de modo que a emissão da amostra seja direcionada através do caminho de luz visível.</li>
		<li>Olhando ao longo do caminho óptico em direção ao detector, coloque o cubo óptico visível (CM1-P01), que contém o espelho dicórico e os filtros para direcionar a emissão visível para os caminhos de detecção, na posição indicada como 6 na Figura 2b.</li>
		<li>Continuando o caminho em direção ao detector, coloque o cubo óptico de pinhole confocal (DFM1-P01) na posição indicada como 7 na Figura 2b para direcionar a luz através do caminho de detecção de luz visível. Em seguida, seguindo o caminho, coloque o cubo óptico espectrômetro confocal (DFM1-P01) na posição 8 na Figura 2c para que a luz emitida atinja o detector.</li>
		<li>Para o mapeamento do HSI, controle manualmente a abertura da fenda do detector (9 na Figura 2c)para combinar com o tamanho dos orifícios utilizados (cerca de 50 mm é ótimo).</li>
		<li>No software PHySpec, escolha a abertura do orifício (5 na Figura 3). NOTA: Quanto menor a abertura do orifício, melhor é a resolução do HSI, ao custo da intensidade do sinal.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligue a lâmpada de banda larga(Figura 2d,inset) posicionando o interruptor (10 na Figura 2d)na posição ON. Para controlar a intensidade da luz de excitação, gire o botão indicado por 11 (Figura 2d) para valores mais altos (32 – menor intensidade) ou menores (1 – maior intensidade). Mantenha o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2d) fechado durante a configuração. NOTA: Os valores mais elevados correspondem à maior atenuação da densidade de potência emitida pela lâmpada, enquanto valores mais baixos correspondem à menor atenuação.</li>
	<li>Ligue o seguinte hardware na ordem dada abaixo, definindo seus switches na posição ON:<ol>
<li>Ligue o controlador de movimento ThorLabs.</li>
		<li>Ligue a fonte de energia Nikon.</li>
		<li>Ligue o controlador ASI.</li>
		<li>Ligue o controlador Galvo.</li>
		<li>Ligue o detector ProEm.</li>
		<li>Ligue o detector Bayspec.</li>
	</ol></li>
	<li>No computador, abra o software PHySpec clicando duas vezes em seu ícone.<ol>
<li>Pressione a tecla F8 no teclado para inicializar o sistema de conversão IMA Upconversion e clique no botão OK na janela Conectar ao sistema. NOTA: Passo 1.5.1. também pode ser realizado clicando na guia Sistema e, em seguida, clicando em Conectar para chegar à janela Conectar ao sistema. Em seguida, o botão OK pode ser clicado para conectar o sistema de imagem ao software.</li>
		<li>Certifique-se de que todos os menus aparecem na interface(Câmera colorida, ProEm e Bayspec),bem como no painel de controle de instrumentos, no lado esquerdo da tela, conforme mostrado na Figura 3.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imagem hiperespectral de um cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)6]
<ol><li>Para preparar a amostra, coloque o cristal em uma lâmina de vidro de microscopia. Caso seja necessário usar uma ampliação mais elevada, cubra o cristal com um vidro de cobertura fina e fixe-o com fita adesiva, para que a amostra possa ser colocada com o vidro de cobertura fina voltado para a lente objetiva.</li>
	<li>Coloque o slide de vidro no qual a amostra foi preparada no estágio do microscópio e fixe-a usando os braços metálicos(Figura 4a,b).</li>
	<li>Mova a amostra usando o joystick(Figura 4c)do controlador ASI para posicionar a amostra sobre os objetivos em uso.</li>
	<li>Posicione manualmente o cubo do filtro direito na roda sob os objetivos (3 na Figura 5) para selecionar a excitação UV da lâmpada e deixar passar a emissão visível em direção ao detector. NOTA: Cubos de filtro adicionais estão disponíveis para usar excitação de luz verde ou azul, portanto, ter o cubo de filtro certo no lugar é importante para o comprimento de onda de excitação apropriado.</li>
	<li>Posicione manualmente o objetivo 20X (indicado por 5 na Figura 5) sob a amostra e pressione o botão branco (6 na Figura 5) no lado esquerdo do microscópio para acender a luz branca.<ol>
<li>Ajuste o brilho girando o botão sob o botão de energia da luz branca (7 na Figura 5).</li>
	</ol></li>
	<li>No software PHySpec, pressione o botão Play (vídeo) na janela da câmera colorida, o que causará a aquisição de uma varredura ao vivo.<ol>
<li>Se a janela da câmera colorida mostrar uma imagem preta, aumente o Tempo de Exposição (2 na Figura 3) e/ou o Valor de Ganho (3 na Figura 3) encontrado no painel de controle do instrumento, sob a guia Câmera Colorida. Se a imagem visualizada for muito brilhante, diminua o tempo de exposição e/ou ganhe valor.</li>
		<li>Certifique-se de que o botão dianteiro no lado direito do microscópio (2 na Figura 5) está configurado como R, a fim de enviar 20% do sinal para a câmera/binóculos e 80% do sinal para o detector.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentre-se na amostra ajustando a distância entre o objetivo e o estágio(Figura 4b). Isso é feito girando os botões mostrados na Figura 4d no lado direito do microscópio. NOTA: O botão maior é usado para ajustes grosseiros, enquanto o botão menor é para mudanças mais delicadas e pequenas de foco.</li>
	<li>Certifique-se de que o objetivo escolhido manualmente também seja selecionado no software. Primeiro, clique no botão Exibir na barra superior do menu e, em seguida, clique em uma barra de escala Show/hide para exibir a barra de escala na imagem (1 na Figura 3). Em seguida, vá para a guia Galvanometer no painel de controle de instruções e selecione o Objetivo utilizado (4 na Figura 3). Certifique-se de que a barra de escala exibida está correta selecionando o objetivo adequado no software.</li>
	<li>No software, selecione o detector apropriado indo para a guia Desvior (ProEM – 6 na Figura 3) e grades indo para a aba Filtro (1200 gr/mm no caso do ProEM – 7 na Figura 3) sob a guia SpectraPro SP-2300 .</li>
	<li>Abra o obturador da lâmpada de banda larga (12 na Figura 2) para permitir que ocorra a excitação UV da amostra. Gire o botão de intensidade (11 na Figura 2d) para a posição desejada (por exemplo, 8 – intensidade intermediária) para controlar a intensidade da excitação da lâmpada de banda larga (UV).<ol>
<li>Para escolher entre iluminação de campo largo (abertura aberta) ou uma iluminação de ponto menor (abertura mais fechada), controle o tamanho da abertura do campo da lâmpada UV usando a vara e os botões mostrados em 4 na Figura 5.</li>
	</ol></li>
	<li>Na guia SpectraPro SP-2300, selecione um comprimento de onda para observar a emissão da amostra.</li>
	<li>Se os comprimentos de onda de emissão da amostra forem desconhecidos, adquira um espectro de emissões.<ol>
<li>No sequenciador, clique no sinal + para adicionar uma nova seqüência ("nó") para a aquisição de um espectro de emissões.<ol>
<li>Clique no Espectrômetro e, em seguida, aquisição de espectro (com varredura espectral).</li>
			<li>Insira um comprimento de onda mínimo (ou seja, 400 nm) e um comprimento de onda máximo (ou seja, 700 nm) e clique em OK para definir a faixa espectral na qual o espectro será gravado.</li>
			<li>Escolha o Tempo de Exposição adequado no menu do lado esquerdo do software. Escolha tempos mais curtos (por exemplo, 0,1 s) para amostras muito brilhantes e tempos mais longos (por exemplo, 2 s) para emissores dim.</li>
			<li>Ajuste a potência de excitação em caso de excitação da lâmpada de banda larga (UV) (ver passo 1.3 acima). NOTA: No caso de excitação de diodo NIR, pode ser ajustado a partir do menu suspenso de densidade neutra no lado esquerdo do software PHySpec.</li>
		</ol>
</li>
		<li>No sequenciador, clique no botão de reprodução dupla para executar toda a seqüência. Uma vez mostrado o espectro, observe as regiões de interesse para a detecção da emissão amostral (por exemplo, 580 a 640 nm no caso de amostras baseadas em Tb3+- eEu 3+).</li>
		<li>Conforme necessário, otimize a detecção de sinais alterando o foco da amostra ou ajustando o Tempo de Exposição no software PHySpec. Obter uma otimização adicional da detecção de sinal através do aumento da intensidade de emissão da amostra alterando a potência da fonte de excitação (lâmpada de banda larga), conforme descrito acima.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste o Tempo de Exposição ( porexemplo, 0,5 s – 2 na Figura 3) e Ganhe (3 na Figura 3) da Câmera Colorida em conformidade, para obter uma imagem de boa qualidade. Se necessário, adicione a barra de escala à imagem clicando na barra de escala Show/hide no botão Mostrar/ocultar a barra na segunda linha do menu na parte superior da janela do software PHySpec. </li>
	<li>Recomendação: Antes de adquirir o cubo hiperespectral, grave uma imagem de microscopia óptica de campo brilhante do cristal sob luz branca (Figura 6a) e/ou UV full(Figura 6b)ou confinada(Figura 6c) (Figura 6c)iluminação (iluminação UV controlada pela abertura do obturador, mostrada como 4 na Figura 5). Para isso, com a amostra em foco, clique no botão de reprodução da câmera colorida.</li>
	<li>Clique em 'Arquivo' e, em seguida, Exportar janela de exportação,escolha o formato desejado para exportar a imagem obtida e salve o arquivo com a extensão desejada (.h5, . JPEG).</li>
	<li>Antes de adquirir a imagem hiperespectral, desligue a iluminação da luz branca, bem como a luz do quarto.</li>
	<li>Para obter o cubo hiperespectral, escreva uma nova sequência. Portanto, no sequenciador, clique no sinal + para adicionar um novo nó.<ol>
<li>Clique em Confocal Imager.<ol>
<li>Clique em Aquisição multi-espectro. Aqui, o campo de visão desejado é definido pelo número de pontos a serem adquiridos nas direções x e y e pelo tamanho da etapa. Por exemplo, use 100 pontos em x e 100 pontos em y com um tamanho de passo de 5 μm para obter uma imagem de 500 por 500 μm. Nota: O número total de pontos de aquisição e o tempo de integração em cada ponto afetarão diretamente o tempo total de aquisição do cubo hiperespectral.<ol>
<li>Insira a posição X desejada (por exemplo, 100) e a posição Y (por exemplo, 100) conta, bem como o tamanho do passo desejado (por exemplo, 5 μm). Selecione a opção Hardware para a sincronização da câmera, para mapeamento de emissões visíveis (e opção de software em caso de detecção de NIR). Clique em OK.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>No sequenciador, clique na recém-adicionada linha de aquisição multi-espectro para destacar o nó.</li>
	<li>Clique no botão Reproduzir para executar o nó selecionado. NOTA: O tempo restante que a aquisição levará aparecerá ao lado do nó (em minutos, por exemplo, 28 min).</li>
	<li>Uma vez concluída a aquisição, salve o cubo hiperespectral no formato de arquivo apropriado (.h5).</li>
</ol>3. Análise de dados hiperespectrais
<ol><li>Logo após a aquisição, se o cubo hiperespectral salvo não abrir automaticamente no software, recuperar o cubo hiperespectral, que foi salvo como arquivo .h5, clicando no Arquivo na barra superior do menu e, em seguida, pairando o cursor e clique em Abrir arquivo.... Quando a janela intitulada Selecionar dados(s) para abrir aparece, escolha a pasta onde o arquivo .h5 é salvo e clique duas vezes no arquivo para abri-lo.</li>
	<li>Uma vez que o arquivo do cubo hiperespectral seja importado, modifique a imagem do cubo hiperespectral exibido para mostrar a intensidade de um comprimento de onda espectral específico movendo a barra na parte superior da imagem do cubo para a esquerda (comprimento de onda inferior, por exemplo, 580 nm) ou direita (comprimento de onda mais alto, por exemplo, 638 nm). NOTA: O comprimento de onda selecionado é exibido no lado esquerdo desta barra superior (1 na Figura 7).</li>
	<li>Após a escolha do comprimento de onda de interesse para a análise (por exemplo,a intensidade máxima, que no caso de [TbEu(bpm)(tfaa)6] é de 613,26 nm), faça um (ou todos) dos três tipos possíveis de análise espectral: (A) a distribuição espectral em forma de imagem (2 na Figura 7); (B) um perfil de intensidade de emissões em uma região de interesse (3 na Figura 7); c Extração de espectro em um ponto ou região de interesse específico (4 na Figura 7).<ol>
<li>No caso da distribuição espectral de uma imagem, use a função Crop e Bin para aumentar a relação sinal-ruído na imagem. Para fazer isso, clique no menu superior Processamento e escolha Data e, em seguida, a opção Crop e Bin.</li>
		<li>Para um perfil de intensidade de emissão, na imagem do cubo, clique com o botão direito do mouse e selecione o perfil Criar destino ou Criar X ou Criar perfil Y, dependendo se apenas um ponto (Alvo - 5 e 6 na Figura 7) ou uma linha (Perfil - 7 e 8 na Figura 7) precisar ser analisado. Selecione a área de análise arrastando o alvo, o perfil de linha horizontal ou vertical com o cursor e mova-o através do cubo.<ol>
<li>Uma vez que o perfil tenha sido devidamente selecionado, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar destino a gráfico. Escolheu a opção de criar um novo gráfico para exibir a intensidade de emissão (eixoy) em função da posição física do alvo (eixox). O espectro aparecerá no novo gráfico que foi inserido (6 e 7 na Figura 7). NOTA: Vários alvos podem ser criados, e estes aparecerão como diferentes perfis de emissões coloridas (5 e 6 na Figura 7).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alternativamente, obter um espectro de emissão de uma área específica da amostra (9 na Figura 7). Para começar, gire o cursor sobre a imagem do cubo e clique com o botão direito do mouse. Clique nas opções Seleção de Retângulo ou Seleção de Elipse na guia que aparece.<ol>
<li>Desenhe a forma de seleção (por exemplo, um retângulo) sobre a região desejada clicando e arrastando o cursor através do cubo. Uma vez que a área tenha sido devidamente selecionada, clique com o botão direito do mouse na região e selecione o Adicionar seleção ao gráfico.</li>
			<li>Na janela de agregação Adicionar ao gráfico,selecione Criar um novo gráfico para exibir o espectro de emissões do destino e clique em OK. NOTA: Uma nova linha colorida (8 na Figura 7) aparecerá no gráfico em que a emissão de destino está sendo mostrada, com a intensidade de emissão como o eixo y e o comprimento de onda no eixo x. Este espectro corresponde à intensidade média da área selecionada para cada comprimento de onda.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que o espectro é obtido, salve-o antes de selecionar uma nova região porque apenas uma região pode ser selecionada por vez. Para isso, selecione a janela em que contém o gráfico. No menu Arquivo, selecione Salvar como e escolha salvar o gráfico na pasta de escolha, usando o nome de escolha, seja no formato .h5, que pode ser aberto no software PHySpec, ou no formato .csv, que pode ser importado no Excel.</li>
</ol>

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<li>Koyama, H., Fauchet, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+polarization+memory+in+thermally+oxidized+porous+silicon%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Anisotropic polarization memory in thermally oxidized porous silicon.</a> Applied Physics Letters. 77 (15), 2316-2318 (2000).</li>
<li>Kushida, T., Takushi, E., Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memories+of+photon+energy%2C+polarization+and+phase+in+luminescence+of+rare+earth+ions+under+resonant+light+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Luminescence%22%5BJournal%5D)">Memories of photon energy, polarization and phase in luminescence of rare earth ions under resonant light excitation.</a> Journal of Luminescence. 12-13, 723-727 (1976).</li>
<li>Onuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+ellipsometry+studies+on+%CE%B2-Ga2O3+films+and+single+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic ellipsometry studies on β-Ga2O3 films and single crystal.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 55 (12), (2016).</li>
<li>Favreau, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-scanning+hyperspectral+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo de imagem hiperespectral descrito fornece uma abordagem simples que permite obter informações espectroscópicas em locais precisos da amostra. Utilizando a configuração descrita, a resolução espacial(mapeamento x e y) pode chegar até 0,5 μm, enquanto a resolução espectral pode ser de 0,2 nm para o mapeamento na faixa visível e 0,6 nm para a faixa NIR.
Para realizar o mapeamento hiperespectral em um único cristal, a preparação da amostra segue um procedimento fácil:...

Imagem Hiperespectral (HSI) é uma técnica que gera um mapa espacial onde cada coordenada x-y contém uma informação espectral que poderia ser baseada em qualquer tipo de espectroscopia, ou seja, fotoluminescência, absorção e espectroscopia de dispersão1,2,3. Como resultado, um conjunto tridimensional de dados (também chamado de "cubo hiperespectral") é obtido, onde as coordenadas x-y são os eixos espaciais e a coordenada z é a informação espectral da amostra analisada. Portanto, o cubo hiperespectral contém informações espaciais e espectrais, proporcionando uma investigação espectroscópica mais detalhada da amostra do que a espectroscopia tradicional. Embora o HSI seja conhecido há anos no campo do sensoriamento remoto (porexemplo, geologia, indústrias alimentícias4),recentemente emergiu como uma técnica inovadora para a caracterização de nanomateriais2,,5 ou sondas para aplicações biomédicas3,,6,7,8. De um modo geral, não se limita ao domínio UV/visível/infravermelho próximo (NIR), mas também pode ser estendido usando outras fontes de radiação, como raios-X – por exemplo, a fim de caracterizar a distribuição elementar em diferentes materiais9 – ou a radiação Terahertz, onde o HSI foi usado para realizar sensoriamento térmico em tecidos biológicos8. Além disso, o mapeamento da fotoluminescência foi combinado com o mapeamento de Raman para sondar as propriedades ópticas da monocamada MoS210. No entanto, entre as aplicações relatadas de HSI óptico, ainda existem apenas alguns exemplos de HSI de materiais à base de lantthanidas11,,12,,13,,14,,15,,16,17. Por exemplo, podemos citar: detecção de câncer nos tecidos6, análise da profundidade de penetração da luz em tecidos biológicos7, imagem biológica multiplexada3,análise de transferência de energia multicomponente em sistemas híbridos11, e investigação de alterações induzidas por agregação nas propriedades espectroscópicas de nanopartículas de upconverter12. Claramente, a atratividade do HSI decorre de sua adequação à geração de conhecimento sobre luminescência específica do ambiente, fornecendo informações espaciais e espectrais simultâneas sobre a sonda.
Aproveitando essa poderosa técnica, descrevemos um protocolo para investigar a anisotropia óptica da tb heterodinuclear Tb3+-Eu3+ cristal único [TbEu(bpm)(tfaa)6](Figura 1a)13. A anisotropia óptica observada resultou da embalagem molecular diferente dos íonsLn 3+ nas diferentes direções cristalográficas(Figura 1b),resultando em alguns rostos de cristal mostrando mais brilhante, outros mostrando fotoluminescência dimmer. Foi sugerido que o aumento da intensidade de luminescência em faces específicas do cristal estava correlacionado com uma transferência de energia mais eficiente ao longo dessas direções cristalográficas onde o Ln3+··· Em3+ distâncias de íons foram as mais curtas13.
Motivados por esses resultados, propomos o estabelecimento de uma metodologia detalhada para analisar a anisotropia óptica por meio do HSI, abrindo caminho para melhor compreensão dos processos de transferência de energia íon-íon e propriedades luminescentes ajustáveis decorrentes de arranjo molecular específico18,19. Essas relações estrutura-propriedades têm sido reconhecidas como aspectos importantes para o design inovador de materiais ópticos, incluindo, mas não se limitando a sistemas de guias de ondas e dispositivos de armazenamento optomagnético em nano e microescala – atendendo à demanda por sistemas ópticos mais eficientes e miniaturizados20.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de vidro para microscópio</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td>Lâminas de vidro usadas para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Imager Confocal Hiperespectral Visível e Infravermelho Próximo</td><td>PhotonETC</td><td></td><td>Microscópio usado para a análise, construído de acordo com as necessidades do usuário, portanto, não é número de catálogo</td></tr></tbody></table>

imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para uma nova aplicação de imagens hiperespectrais (HSI) na análise de cristais únicos moleculares luminescentes(Ln 3+). Como exemplo representativo, escolhemos um único cristal do complexo heterodinuclear baseado em Ln [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm=2,2'-bipirimidina, tfaa– =1,1,1-trifluoroaaceylacetonato) exibindo emissão visível brilhante sob excitação UV. O HSI é uma técnica emergente que combina imagens espaciais bidimensionais de uma estrutura luminescente com informações espectrais de cada pixel da imagem obtida. Especificamente, o HSI sobre cristais únicos do complexo [Tb-Eu] forneceu informações espectrais locais revelando a variação da intensidade da luminescência em diferentes pontos ao longo dos cristais estudados. Essas mudanças foram atribuídas à anisotropia óptica presente no cristal, que resulta da embalagem molecular diferente deÍons Ln 3+ em cada uma das direções da estrutura cristalina. O HSI aqui descrito é um exemplo da adequação dessa técnica para investigações espectro-espaciais de materiais moleculares. No entanto, é importante que este protocolo possa ser facilmente estendido para outros tipos de materiais luminescentes (como cristais moleculares de tamanho micron, micropartículas inorgânicas, nanopartículas em tecidos biológicos, ou células rotuladas, entre outros), abrindo muitas possibilidades para uma investigação mais profunda das relações estruturais-propriedade. Em última análise, tais investigações fornecerão conhecimento a ser aproveitado na engenharia de materiais avançados para uma ampla gama de aplicações, desde bioimagem até aplicações tecnológicas, como guias de onda ou dispositivos optoeletrônicos.

Para ilustrar a configuração do microscópio hiperespectral para a aquisição de dados em um cristal único molecular baseado em Ln (ou seja, [TbEu(bpm)(tfaa)6], Figura 1a), a Figura 2 mostra uma visão geral do sistema, bem como a colocação correta dos cubos ópticos na configuração. A Figura 3 mostra uma captura de tela do software PHySpec contendo os menus usados durante a aquisição do HSI. A Figura 4</...

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de imagem hiperespectrais luminescentes e analisar características de anisotropia óptica de cristais únicos baseados em lantanoide usando um Sistema de Imagem Hiperespectral.

Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based ...

A imagem hiperespectral permite a aquisição de informações espectroscópicas em locais precisos dentro de uma amostra. Por exemplo, para a revelação de anisotropia óptica em um único nível de cristal. A geração de dados espectrais e espaciais de uma amostra permite uma investigação mais detalhada da amostra do que é possível apenas por espectroscopia ou microscopia de fluorescência.Um grande número de parâmetros ajustáveis que afetam a resolução pode parecer esmagador no início. No entanto, fazer uma lista de verificação pode ajudar a se familiarizar com o sistema. Esta técnica requer ajuste manual do hardware de imagem, bem como manipulação de software.É essencial ilustrar ambos os aspectos visualmente para mostrar como ambos os métodos se complementam. Demonstrando o procedimento com Nelson Rutajoga estará Emily Rodrigues, bolsista de pós-doutorado do meu laboratório. Para configurar a configuração do imager para mapeamento de imagens hiperespectrais, partindo do estágio do microscópio e seguindo a via do feixe de emissão em direção aos detectores, deixe a posição para um cubo óptico ao lado do microscópio óptico vago e coloque o cubo óptico do microscópio confocal nessa posição que direciona a emissão da amostra através do caminho da luz visível.Olhando ao longo do caminho óptico em direção ao detector, coloque o cubo óptico visível contendo o espelho dicroico e filtros para direcionar a emissão visível para o caminho de detecção em sua posição. Continuando o caminho em direção ao detector, coloque o cubo óptico confocal pinhole na posição certa para direcionar a luz através do caminho de detecção de luz visível e seguindo esse caminho, coloque o cubo óptico do espectrômetro confocal na posição apropriada para que a luz emitida chegue ao detector. Quando todos os cubos estiverem no lugar, ajuste manualmente a abertura da fenda do detector para combinar com o tamanho do orifício selecionado.Em seguida, no software PHySpec, selecione a abertura do pinhole. Para mapeamento de imagens hiperespectrais do trifluoroacetilado trifluoroacetiladotonato de trifluoroacetilação de terbium, posicione manualmente o objetivo de 20 vezes do microscópio óptico sob a amostra e pressione o botão branco no lado esquerdo do microscópio para acender a luz branca. Gire o botão sob o botão para ajustar o brilho.Defina o botão dianteiro no lado direito do microscópio para R para enviar 20% do sinal para a câmera e 80% do sinal para o detector. Pressione play na janela da câmera colorida no software PHySpec para iniciar uma varredura ao vivo. Se a janela da câmera colorida mostrar uma imagem muito escura ou preta, aumente o tempo de exposição e/ou o valor de ganho sob a aba da câmera colorida.Se a imagem estiver muito brilhante, diminua o tempo de exposição e/ou ganhe valor. Para focar na amostra, gire os botões do microscópio para ajustar a distância entre o objetivo no estágio e abrir o obturador de lâmpada de banda larga para permitir a excitação UV da amostra. Em seguida, gire o botão de intensidade para a posição desejada para controlar a intensidade da excitação da lâmpada de banda larga.Clique na barra de escala Show/Hide para adicionar uma barra de escala à imagem de microscopia óptica de campo brilhante do cristal e observar uma imagem do cristal sob iluminação completa ou confinada. Para selecionar entre a iluminação confinada ou uma iluminação de campo amplo, use a vara e os botões para ajustar o tamanho da abertura do campo da lâmpada UV. Sob a guia SpectraPro SP 2300, selecione um comprimento de onda para observar a emissão da amostra e ajuste o tempo de exposição do detector.Para obter o cubo hiperespectral no sequenciador, clique em adicionar um novo nó e clique em Confocal Imager. Clique em Aquisição multi-espectro e insira as contagens desejadas de posição X e Y, bem como o tamanho da etapa desejada. Selecione a opção de hardware para a sincronização da câmera e para mapeamento de emissões visíveis e clique em ok.No sequenciador, clique na linha de aquisição de vários espectros recém-adicionada para destacar o nó e clique em Reproduzir para executar o nó selecionado. Para análise dos dados de imagem hiperespectral capturados, por exemplo, para uma distribuição espectral de uma imagem, no menu Processamento, selecione Dados e Crop e Bend para aumentar a relação sinal/ruído da imagem. Para obter um perfil de intensidade de emissão, clique com o botão direito do mouse na imagem do cubo e selecione Criar Perfil X para a análise de uma linha.Arraste para selecionar a área e clique com o botão direito do mouse na região de interesse. Para selecionar Adicionar ao gráfico. Para exibir a intensidade de emissão em função da posição física do alvo.O perfil de intensidade aparecerá no novo gráfico. Para obter um espectro de emissão de uma área específica da amostra, passe o cursor sobre a imagem do cubo, clique com o botão direito do mouse e clique em Seleção de Retângulo. Arraste e clique para desenhar a forma de seleção sobre a região desejada.Em seguida, clique com o botão direito do mouse na região de interesse e selecione Adicionar seleção ao gráfico. Na janela Adicionar ao Gráfico, selecione Criar um novo gráfico para exibir o espectro de emissão do alvo e clique em ok. Em seguida, salve o espectro adquirido antes de selecionar uma nova região.Aqui, uma imagem de campo brilhante de um cristal registrado após ajustar a amostra no foco adequado é mostrada. A morfologia semelhante à agulha do cristal pode ser claramente observada. Aqui, podem ser observadas imagens do mesmo cristal sob excitação UV com iluminação total ou iluminação localmente confinada.A iluminação confinada pode ser usada para investigar os efeitos da transferência de energia ou luz dentro do cristal que pode desencadear um comportamento semelhante a guia de ondas. Por exemplo, nesta imagem, uma forte emissão é detectada em um ponto não diretamente sob excitação, sugerindo que a migração eficiente de energia ocorre através do cristal. A partir do cubo hiperespectral adquirido, também é possível obter a distribuição espectral na forma de uma imagem, representando um comprimento de onda específico.O perfil de intensidade de um comprimento de onda de emissão específico e o espectro de emissões em qualquer pixel ou área do cubo hiperespectral adquirido. Por exemplo, o espectro de emissões para esta análise mostra as faixas de emissão mais características do íon europium. Além disso, o perfil espacial ao longo das diferentes faces cristalinas indica uma emissão mais brilhante na ponta e nas faces laterais e pode ser correlacionado com as distâncias de íons de lantano/lantano nas três direções espaciais.Para obter um bom sinal em um tempo razoável de gravação do cubo hiperespectral, é importante ajustar as configurações do microscópio, o foco e o tempo de exposição do detector. Excitação UV e emissão visível, essa técnica pode ser realizada usando excitação infravermelha próxima e detecção de emissões infravermelhas próximas. Isso permite que seja aplicável para uma grande variedade de materiais luminescentes.A correlação de sinais ópticos com uma série de características dependentes torna essa técnica muito interessante para a investigação de relações estruturais/propriedades, incluindo avaliação in vitro de interações nano-bio.

hyperspectral-imaging-as-tool-to-study-optical-anisotropy-lanthanide

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

O manuscrito descreve um método de espectroscopia de fluorescência quase-ressonante assistida por fônons que incorpora espectroscopia de resolução limitada a laser e espectroscopia de fotoluminescência (PL). Este método utiliza fônons ópticos para fornecer espectros de resolução limitada por largura de linha de estruturas semicondutoras semelhantes a átomos no domínio da energia. O método também é facilmente realizado com uma configuração de espectroscopia óptica de espectrômetro único.

-Ressonância Quasi alta resolução Phonon assistida espectroscopia de fluorescência

espectros de raios-X fornecem uma riqueza de informações sobre plasmas de alta temperatura. Este manuscrito apresenta o funcionamento de uma alta resolução de comprimento de onda espacialmente Imaging Spectrometer de raios-X utilizado para visualizar os íons a hidrogénio e hélio-como de elementos de número atómico médio em um plasma de tokamak.

Aplicando raios-X de imagem de cristal Spectroscopy para uso como uma alta temperatura do plasma de diagnóstico

Aqui, apresentamos os protocolos de análises de diferencial-deteção de tempo-resolvido infravermelho vibracional espectroscopia e elétron difração que permitem observações das deformações de estruturas locais ao redor de moléculas de photoexcited em um colunar cristal líquido, dando uma perspectiva atômica, sobre a relação entre a estrutura e a dinâmica deste material fotoativa.

Novas técnicas para observar a dinâmica estrutural de cristais líquidos de Photoresponsive

Nós descrevemos uma configuração de trajetória para realizar mapeamento de microdiffraction fluorescência e raio-x rápida radiografia bidimensional do único cristal ou pó amostras usando Laue (radiação policromática) ou difração (radiação monocromática). Os mapas resultantes fornecem informações sobre tensão, orientação, distribuição de fase e deformação plástica.

Síncrotron Microdiffraction de raio-x e imagem latente de fluorescência das amostras de rocha e minerais

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Caracterização magneto-óptica espectral e de ângulo-resolvido de nanoestruturas fotônicas

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Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

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Aprenda a realizar imagem hiperespectral luminescente para analisar anisotropia óptica em cristais únicos baseados em lantanídeos. Este protocolo combina aquisição de dados espectrais e espaciais para investigação detalhada.

Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

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