Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.
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Artigo de método
Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência
Neste artigo
Resumo
Resumo
Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), compostas de DNA livre de células (cfDNA) e proteínas como histonas e elastase de neutrófilos (NE), são liberadas por neutrófilos em resposta a inflamações sistêmicas ou patógenos. Embora os NETs tenham sido mostrados anteriormente para aumentar a formação de coágulos e inibir a fibrinolise em humanos e cães, o papel dos NETs em gatos com tromboembolismo arterial cardiogênico (CATE), uma complicação de risco de vida secundária à cardiomiopatia hipertrófica , é desconhecido. Um método padronizado para identificar e quantificar os NETs em trombos arteriais cardiogênicos em gatos avançará nossa compreensão de seu papel patológico no CATE. Aqui, descrevemos uma técnica para identificar NETs em trombos fixados em formaldeído e parafina dentro da bifurcação aórtica, extraídos durante a necropsia. Após a deparafinação com xileno, as seções aórticas foram submetidas à recuperação indireta de antígenos induzidos pelo calor. As seções foram então bloqueadas, permeabilizadas e ex-vivo NETs foram identificadas por colocalização de DNA livre de células (cfDNA), histona citrubilada H3 (citH3) e elastase neutrófilo (NE) utilizando microscopia de imunofluorescência. Para otimizar a imunodetecção de NETs em trombos, a autofluorescência dos elementos teciduais foi limitada por meio de um processo de saciedade de autofluorescência antes da microscopia. Essa técnica pode ser uma ferramenta útil para estudar NETs e trombose em outras espécies e oferece novas percepções sobre a fisiopatologia dessa condição complexa.
Introdução
Gatos com cardiomiopatia hipertrófica correm o risco de complicações tromboembólicas com risco de vida1,2. Apesar da alta morbidade e mortalidade associada ao tromboembolismo arterial cardiogênico felino (CATE), a fisiopatologia subjacente da CATE em gatos é mal compreendida. Existem também ferramentas diagnósticas e terapêuticas limitadas para tratar e identificar gatos em risco desta condição devastadora3.
Além de seu papel na imunidade inata, os neutrófilos têm mostrado desempenhar um papel na trombose, liberando armadilhas extracelulares de neutrófilos (N....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram executados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis. Necropsias e biópsias de tecidos foram realizadas com o consentimento dos proprietários.
1. Fixação de tecidos, incorporação e secção
- Dissecar a bifurcação aórtica, incluindo a aorta descendente, a artéria femoral e as artérias ilíacas comuns(Figura 1A),logo após a eutanásia humana ou a morte. Dissecar a fáscia(Figura 1B)antes de submergir completamente em formalina tamponada neutra por um mínimo de 24 h e ....
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Resultados
Usando este protocolo para deparafinação, recuperação de antígenos induzidos pelo calor e dupla imunorotulagem de trombos embutidos em parafina, identificamos NETs em CATE felino pela primeira vez. O trombo dentro da bifurcação aórtica foi localizado por microscopia de fluorescência e microscopia de campo brilhante utilizando a coloração padrão de H&E e microscopia de contraste de fase. Na microscopia de campo brilhante, o trombo arterial felino consistia de glóbulos vermelhos, leucócitos, fibrina e plaquetas
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Discussão
Descrevemos um protocolo para identificar NETs em trombos arteriais cardiogênicos felinos fixos usando um protocolo de imunorotulagem dupla e microscopia de imunofluorescência. Embora apenas trombos arterials cardiogênicos estivessem manchados, em teoria este protocolo poderia ser usado para outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias. A identificação de NETs dentro do trombo arterial felino sugere que os NETs podem desempenhar um papel na trombose em gatos.
A detecção de NETs po.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kevin Woolard pelo uso do microscópio de fluorescência.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4,6-Diamidino-2-fenilina (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Conjugado de estreptavidina | ThermoFisher Catálogo Científico | # S11227 | |
| Anticorpo anti-citrulinado histona H3 | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging Objetiva do sistema 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 anticorpo | ThermoFisher Scientific | Catálogo # A32723 | |
| Soro de cabra | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Parte do fabricante # 005-000-121 | |
| Anticorpo elastase de neutrófilos | Anticorpos Bioss | Bs-6982R-Biotina | Coelho anticorpo policlonal, conjugado com biotina |
| NP40 | Pierce | Produto # 28324. Lote # EJ64292 | |
| Lâminas de microscópio carregadas positivas | Thomas Scientific Fabricante | No. 1354W-72 | |
| Soro de coelho | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Solução de Recuperação de Alvo | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| Kit de Têmpera de Autofluorescência TrueVIEW | Vector Laboratories | SP-8400 |
Referências
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al.
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Reimpressões e permissões
