Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataques de vômito, hipertensão e ansiedade¹. Um exemplo de toxicidade é o tratamento quimioterápico, que tem sido relatado ter efeitos colaterais tóxicos nos neurônios autônomos². Sabe-se que a denervação autônoma e a hiper-inervação podem tanto levar, ou acompanhar, doenças como a doença de Parkinson ou a doença renal hipertensiva^3,4. Assim, poder realizar pesquisas e entender os mecanismos da biologia symN e defeitos no contexto da doença é benéfico para a busca de tratamentos novos e eficazes.

Anatomia
O sistema nervoso periférico se ramifica em divisões sensoriais e autônomas. Os nervos afetuosos do sistema nervoso sensorial são responsáveis pela sensação de dor e tato, enquanto a ANS é responsável por repassar informações de todos os órgãos para o cérebro. A ANS é dividida no sistema nervoso entérico, interiorizando o trato gastrointestinal, o sistema nervoso parassimpático, importante para o relaxamento, e o sistema nervoso simpático (SNS), importante para ativação/regulação dos órgãos. O SNS adapta um sistema de dois neurônios⁵. Axônios neurais simpáticos pré-ganglionic na medula espinhal primeiro projetam os gânglios simpáticos, onde os corpos de células símn pós-ganglionárias estão localizados. Esses neurônios então enviam projeções longas para inervar os tecidos alvo de cada órgão do corpo. Os sinais transmitidos por neurônios pré-ganglionics são colinérgicos, enquanto as símns pós-ganglionárias são adrenérgicas e, portanto, expressam a norepinefrina (NE) como seu principal neurotransmissor. Há poucas exceções notáveis de neurônios pós-ganglionários e simpáticos que são colinérgicos, incluindo os que inervam os vasos sanguíneos. Os neurônios pós-ganglionários adrenérgicos expressam as enzimas tyrosine hydroxylase (TH), aromático L-aminoácido decarboxylase (AAAD), dopamina β-hidroxilase (DBH) e monoamina oxidase (MAO-A), todas responsáveis pela geração e metabolização do NE. Além disso, expressam os transportadores de reciclagem ne e/ou receptores α-adrenérgicos receptor (ADRA2), receptor β-adrenérgico (ADR2B), transportador de norepinefrina (NET1) e transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).

Desenvolvimento
Durante o desenvolvimento embrionário, as simens são derivadas da crista neural (NC), que emerge entre o tubo neural e o ectoderme de sobreposição⁶, e pode se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, incluindo melanócitos, osteoblastos, adiócitos, glia, neurônios entéricos, neurônios sensoriais e neurônios autônomos⁷. Células de crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que tomam várias rotas através do embrião. Nesta fase inicial do desenvolvimento do NC, as células expressam os marcadores SNAIL1/2, FOXD3 e SOX10^8,9,10,11. A rota de migração, juntamente com o local axial que eles adotam, determina o subtipo NC no qual eles se desenvolverão. Esses subtipos NC podem ser distinguidos por sua expressão genética hox específica: NCCs cranianos não expressam genes HOX, NCCs vagal expressam HOX 1-5, NCCs tronco expressam HOX 6-9, e NCCs sacral expressam HOX 10-11¹². Entre eles, os NCCs tronco são reconhecidos como a principal fonte de symNs. Os precursores do SymN expressam o fator de transcrição MASH1/ASCL1¹³, que promove a expressão de PHOX2B¹⁴ e INSM1¹⁵. A família GATA de fatores de transcrição é expressa durante o desenvolvimento solidário tardio. GATA2 e GATA3 são expressos nos symNs, que por sua vez ativa o DBH¹⁶. O fator de transcrição HAND2 também é importante para a expressão e manutenção do DBH e th¹⁷.

Os HPSCs (por exemplo, células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) são uma poderosa ferramenta¹⁸ para recapitular paradigmas de desenvolvimento e gerar simns que podem ser empregados para a modelagem de doenças de vários distúrbios humanos. Assim, ao gerar symNs a partir de hPSCs, é fundamental seguir as diretrizes de desenvolvimento e avaliar a expressão de marcadores apropriados ao longo do processo de diferenciação.

Protocolo symN anterior
Poucos grupos de pesquisa relataram anteriormente a geração de symNs a partir de hPSCs^19,20,21. A comparação direta desses protocolos entre si e com o nosso foi revisada recentemente²². Em 2016²³, publicamos um protocolo de diferenciação para a geração de neurônios autônomos com caráter symN (Figura 1A). Este protocolo utilizou o meio baseado em KSR, que foi utilizado tanto na manutenção de hPSCs indiferenciados quanto na diferenciação celular. Além disso, os hPSCs foram mantidos em fibroblastos embrionários de camundongos (células alimentadoras de MEF). Utilizamos este protocolo e PSCs de pacientes com DF para modelar o transtorno²³. Em 2019, descrevemos uma versão mais detalhada deste protocolo mais antigo²⁴. Em resumo, o destino neural foi induzido pela inibição SMAD²⁵ para bloquear a sinalização TGF-β e BMP nos primeiros 2 dias. A ativação wnt usando CHIR99021 promoveu progenitores neurais para se tornarem células NC. No dia 11, as células foram classificadas pelo FACS para as populações CD49D⁺ ou SOX10^{+ 26,23}, que produziram cerca de 40% de eficiência de geração nc. Assim, a classificação foi necessária para garantir a eficiência e pureza para os próximos passos de diferenciação. Os NCCs foram mantidos e amplificados como esferóides com o tratamento combinado de FGF2 e CHIR. Após 4 dias, os esferóides NC de manutenção foram banhados e deram BDNF, GDNF e NGF para terminar a maturação symN. Embora esses simns expressem fortes marcadores de simegos como ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, os marcadores para simns mais maduros, incluindo a expressão do receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/CHRNB4) e transportador de vesícula (VMAT1/2), foram baixos mesmo após 70 dias de diferenciação. Os genes HOX neste protocolo não foram formalmente testados, e as propriedades neurais maduras, incluindo a atividade eletrofisiológica das células, não foram verificadas.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para gerar symNs(Figura 1B). Os HPSCs são mantidos em condições livres de alimentadores, em pratos revestidos de vitronectina (VTN), utilizando a mídia Essential 8 (E8)²⁷. A fórmula dos meios de diferenciação tem sido modificada a cada etapa, aumentando assim o percentual da população nc²⁸. A maturação symN pode ser feita em populações de NCC cd49D⁺/SOX10⁺ classificadas ou não classificadas em massa. Ambos mostram altos níveis de expressão de marcador symN até o dia 30. Além disso, os symNs gerados com este protocolo respondem ao registro eletrofisiológico e aos tratamentos com ativos e compostos inibidores symN.

NOTA: A linha de repórteres H9 PHOX2B:GFP foi fornecida por Oh et al.¹⁹. Alguns primers qPCR utilizados neste artigo foram obtidos da OriGene Technologies, enquanto algumas seqüências são obtidas a partir de Frith et al.^20,30.

1. Configuração para revestimento de pratos, preparação de mídia e manutenção de hPSC

1. Revestimento de pratos
   1. Revestimento de Vitronectina (VTN)
      1. Coloque frascos de VTN em um banho de água de 37 °C até descongelamento total e misture bem.
      2. Para uma placa de Petri de 100 mm, misture 7 mL de 1x de solução salina tamponada de fosfato (PBS) com 0,5 mg/mL VTN, adicione a solução VTN ao prato e incuba r$ 1 h.
   2. Revestimento da matriz da membrana do porão
      1. Descongele frascos da matriz de membrana do porão (ver Tabela de Materiais) no gelo a 4 °C durante a noite.
      2. Para um poço de uma placa de 6 poços, misture 2 mL de DMEM/F12 com 20 μL de matriz de membrana de porão de 100x, adicione a solução de matriz de membrana do porão ao prato, enrole o prato com filme de parafina e armazene em um recipiente limpo a 4 °C durante a noite. Trabalhe o mais rápido possível. Os pratos revestidos podem ser armazenados em 4 °C por até 2 semanas.
   3. Revestimento poliornino (PO)/laminin (LM)/fibronectina (FN)
      1. No primeiro dia, para um poço de 24 bem, misture 15 μg/mL de PO com 1 mL de 1x PBS, incubar a 37 °C, 5% CO₂ durante a noite. Descongele tanto LM quanto FN a -20 °C durante a noite e armazene a 4 °C até descongelar totalmente.
      2. No segundo dia, solução PO aspirada, lave os poços 2x com 1x PBS, adicione 1 mL de 1x PBS contendo 2 μg/mL de LM e 2 μg/mL de FN e incubar a 37 °C em 5% DE CO₂ durante a noite. Neste ponto o prato com a solução LM/FN pode ser mantido na incubadora por meses, desde que não seque. Adicione mais 1x PBS para evitar que o prato seque.
2. Preparação da mídia
   1. Prepare o meio Essential 8 (E8) descongelando uma garrafa de suplemento E8 a 4 °C durante a noite. Misture o suplemento com 500 mL de meio E8 e antibióticos, se necessário.
      NOTA: A solução E8 de trabalho deve ser usada dentro de 2 semanas.
   2. Prepare o meio de congelamento hPSC misturando 90 mL de meio E8 completo com 10 mL de DMSO para um volume total de 100 mL. Filtrar.
   3. Prepare o meio de diferenciação dia 0 a dia 1 misturando 100 mL de médio essencial 6 (E6) com 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 e 10 μM Y27632 para um volume total de 100 mL.
   4. Prepare o meio de diferenciação do dia 2 ao dia 10 misturando 100 mL de Médio E6 com 10 μM SB e 0,75 μM CHIR99021 para um volume total de 100 mL.
   5. Prepare o dia 10 ao dia 14 meio esferoide misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 μM CHIR99021 e 10 ng/mL FGF2 para um volume total de 100 mL.
   6. Prepare o dia 14 ao dia 28 médio para manutenção de longo prazo esferoide adicionando 0,5 μM de RA fresco para o dia 10 a dia 14 meio esferóide para cada alimentação.
      NOTA: Mantenha sempre a RA a -80 °C.
   7. Prepare o meio de maturação SymN misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-glutamato, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM de ácido ascórbico e 0,2 mM dbcAMP para um volume total de 100 mL. A solução deve ser usada dentro de 2 semanas. Antes de cada alimentação, adicione 0,125 μM de RA fresco. Esta solução é utilizada a partir do dia 14 (opção 1) ou dia 28 (opção 2).
   8. Prepare o tampão FACS misturando DMEM com 2% de FBS, 2 mM L-glutamato e antibióticos, se necessário, para um volume total de 100 mL.
3. manutenção hPSC
   1. Descongelamento e manutenção de hPSCs
      1. Prepare um prato de 100 mm revestido de VTN.
      2. Para descongelar um frasco de hPSCs diretamente do nitrogênio líquido, coloque o frasco em um banho de água de 37 °C, balançando cuidadosamente o tubo na água até que ele descongele. Transfira os hPSCs descongelados para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS, e centrífuga a 200 x g por 4 min.
      3. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de meio E8 ao tubo. Pipeta algumas vezes para resuspender totalmente a pelota e, em seguida, adicionar outros 9 mL de meio E8 para atingir o total de 10 mL.
      4. Aspirar a solução VTN do prato de 100 mm.
      5. Transfira os hPSCs para um prato de 100 mm, agite suavemente (para cima e para a esquerda-direita, não em círculos) para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente no prato
      6. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂.
      7. No dia seguinte, aspirar todos os meios e alimentação com 10 mL de E8.
      8. Alimente-se todos os dias durante os próximos 3-4 dias e, em seguida, prepare-se para dividir.
   2. Divisão de hPSCs
      NOTA: os hPSCs no ponto de divisão devem ser de 80% a 90% de confluentes. Grandes colônias com bordas lisas e brilhantes devem ser observadas. No entanto, o contato entre cada colônia deve ser evitado (Figura 2B,dia 0 e Figura 6B).
      1. Prepare pratos de 100 mm revestidos com VTN, conforme necessário.
      2. Apire o E8 e lave o prato que precisa ser dividido em 1x com 1x PBS.
      3. Apirate o 1x PBS e adicione 4 mL de 0,25 M EDTA. Incubar por 2 min a 37 °C, 5% CO₂.
         NOTA: Os hPSCs devem ser divididos/rebobinados como pequenas colônias. Não trate com EDTA mais de 2 minutos para evitar a separação em células únicas. As células devem ser ainda anexadas à superfície do prato após o tratamento de 2 min.
      4. Apiratee o EDTA, desconecte as colônias com 10 mL de meio E8 na superfície do prato, e colete todos os meios e células em um tubo de 15 mL.
      5. Com hPSCs a 80%-90% de confluência, dividiu colônias por 1:15-1:20. Por exemplo, para dividir os hPSCs por 1:20 em um prato de 100 mm, pegue 500 μL de solução E8/hPSCs e misture com 9,5 mL de meio E8 fresco.
      6. Placa hPSCs em pratos de 100 mm revestidos com VTN.
         NOTA: É aconselhável estabelecer a razão de divisão ideal para cada pesquisador e linha celular de forma independente.
   3. Congelamento de hPSCs
      1. Para um prato de 100 mm de hPSCs que está pronto para ser dividido, prepare três crioviais e 3,5 mL de meio de congelamento.
         NOTA: A mídia e os frascos devem ser mantidos em 4 °C ou no gelo até o uso.
      2. Aspirar E8 e lavar o prato 2x com 1x PBS.
      3. Aspirar 1x PBS e adicionar 4 mL de 0,25 M EDTA, incubar por 2 min a 37 °C, em 5% de CO₂.
         NOTA: os hPSCs devem ser congelados como pequenas colônias no momento em que seriam divididos. Não trate as células com EDTA por mais de 2 minutos para evitar a separação em células individuais. As células devem ser fixadas na superfície do prato após o tratamento de 2 min.
      4. Aspire o EDTA, desconecte as colônias com 10 mL de 1x PBS na superfície do prato, e colete todos os meios e células em um tubo de 50 mL.
      5. Adicione 20 mL de 1x PBS e centrífuga a 200 x g por 4 min para lavar o EDTA restante.
      6. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota em 3 mL de meio de congelamento.
      7. Distribua hPSCs uniformemente nos três crioviais, 1 mL cada.
      8. Armazene a -80 °C durante a noite em uma caixa de congelamento controlada ou um sanduíche de isopor para garantir uma queda de temperatura lenta e, em seguida, transfira para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

2. Semeamento de hPSCs para iniciar a diferenciação (dia 0)

NOTA: os hPSCs devem estar prontos para diferenciação após serem estabilizados (ou seja, sendo divididos 2-3x após o descongelamento). Certifique-se de que as colônias são saudáveis, com bordas lisas e brilhantes e diferenciação mínima(Figura 2B).

1. Prepare os pratos revestidos de matriz de membrana do porão (24 pratos de poço ou 6 bem) um dia antes do dia 0, conforme necessário. Leve os pratos para RT no início da diferenciação.
2. Faça o dia 0-1 meio de diferenciação conforme necessário.
3. Aspirar o E8 do confluente, pronto para dividir hPCSs, e lavar o prato 2x com 1x PBS.
4. Adicione 7 mL de 0,25 M EDTA por prato de 100 mm, incubar a 37 °C, 5% CO₂, por 15 min.
   NOTA: Neste ponto, o tratamento EDTA é prolongado para dispersar-se em células únicas.
5. Pipet fora de todos os hPSCs (eles devem estar flutuando) e transferir para um tubo de 50 mL. Adicione a mesma quantidade ou mais de 1x PBS como solução EDTA para diluir o EDTA.
6. Centrífuga a 200 x g por 4 min.
7. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL do dia 0-1 meio de diferenciação e pipeta para homogeneizar as células. Siga adicionando mais meio e depois misture para diluir a solução celular a uma concentração ideal para contar as células.
   NOTA: Não diluir demais a solução celular. As células de um prato completo de 100 mm devem ser diluídas em 5 mL de meio para iniciar.
8. Conte o número do celular usando um contador de celular automatizado ou hemocytometer.
9. Diluir a solução celular conforme necessário para atingir 125.000 células/cm² em um volume final baixo (por exemplo, 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 500 μL por poço para um prato de 24 poços).
   NOTA: Um volume baixo ajuda as células a se conectarem mais rapidamente.
10. Atribua toda a solução da matriz de membrana do porão dos pratos revestidos e emplacre a solução celular nos poços.
11. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂.

3. Indução de células da crista neural (dia 1 ao dia 10, Figura 2A)

1. No dia 1 alimentam as células com o meio de diferenciação do dia 0-1 (3 mL por poço para 6 pratos de poço e 1 mL por poço para 24 pratos de poço).
2. No dia 2 alimentam as células com o meio de diferenciação dia 2-dia 10 (3 mL por poço para 6 pratos de poço e 1 mL por poço para 24 pratos de poço).
3. A partir de agora, as células devem ser alimentadas dia não, dia não, até o dia 10 (ou seja, o próximo dia de alimentação será o dia 4).
   NOTA: A partir do dia 6, devem ser detectados cumes NC(Figura 2B). Para verificar se a diferenciação está ocorrendo, é aconselhável levar uma cultura de diferenciação paralela em poços menores (ou seja, 24 poços), que podem ser manchadas para SOX10/AP2a e usadas para expressão genética de marcadores ao longo do tempo de diferenciação(Figura 2B,C).
4. Se as células de triagem, prossigam para a seção 4. Caso contrário, vá para a seção 5.

4. Classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para marcador de crista neural CD49D e agregação de células NC em esferóides

NOTA: Para a classificação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e não expostas à luz após a coloração até a triagem.

1. Prepare o buffer FACS se as células estiverem classificadas.
2. Prepare o dia 10-14 meio esferóide.
3. No dia 10, retire o meio e lave 1x com 1x PBS.
4. Adicione a solução de dissociação (ver Tabela de Materiais) a 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 1 mL por poço para um prato de 24 poços, e incubar a 37 °C, 5% CO₂ por 20 min.
5. Pipet fora de todos os hPSCs e transferir para um tubo de 50 mL.
6. Encha o resto do tubo com tampão FACS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
   NOTA: Cada tubo de 50 mL pode acomodar até 20 mL ou menos de solução celular. O volume do buffer FACS deve ser alto o suficiente para neutralizar a solução de dissociação.
7. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com a quantidade apropriada de tampão FACS (~2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
8. Prepare as seguintes amostras.
   1. Amostra 1 (controle não manchado): 1 x 10⁶ células em 400 μL de tampão FACS. Filtre as células através de uma tampa de filtro de 20 μm e mantenha o tubo no gelo.
   2. Amostra 2 (controle somente DAPI): 1 x 10⁶ células em 400 μL de tampão FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI. Filtre as células através de um tubo FACS com uma tampa de coador e mantenha o tubo no gelo.
   3. Amostra 3 (etiquetac49d): Suspender o resto das células com tampão FACS contendo anticorpo CD49D conjugado com PE/Cy7 (5 μL para 1 x 10⁶ células por 100 μL de tampão FACS) em um tubo de 15 mL e incubar no gelo por 20 min.
9. Encha os tubos com tampão FACS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
10. Descarte o sobrenadante e resuspenda todas as células 5-10 x 10⁶ em 1 mL de buffer FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI de acordo com as instruções do fabricante.
11. Filtre as células através do tubo FACS com a tampa do coador e mantenha o tubo no gelo.
12. Preparar tubos FACS de coleta contendo 2 mL de tampão FACS.
13. Classifique através da máquina FACS com lasers que podem detectar DAPI e PE-Cy7 para isolar a população CD49D^+.
14. Depois de classificar, conte as células classificadas.
15. Centrifugação todas as células classificadas e resuspender no dia 10-14 meio esferóide para uma concentração final de 0,5 x 10⁶ células por 500 μL de meio.
16. Placa 0,5 x 10⁶ células por poço em anexo ultra-baixo 24 placas de poço.
17. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO₂.

5. Agregando células NC em esferóides

1. Se não usar facs para isolar as células NC e, em vez disso, agregá-las diretamente em esferóides, primeiro prepare as células conforme descrito nas etapas 4.2-4.5.
2. Encha o resto do tubo com 1x PBS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
3. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com uma quantidade apropriada do dia 10-14 meio esferóide (por exemplo, ~2 mL de meio por poço para uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
4. Diluir as células no meio esferóide do dia 10-14 para 0,5 x 10⁶ células por 500 μL de meio.
5. Placa de 500 μL da suspensão celular por poço em fixação ultra-baixa 24 placas de poço.
6. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO₂.

6. Manutenção esferóide NC e indução progenitora simpática (dia 10 ao dia 14, Figura 4A)

1. Opção 1: Cultura esferóide mínima
   1. No dia 11, adicione 500 μL do dia 10-14 meio esferóide sem aspirar meio existente a partir do dia 10. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂.
   2. No dia 12, incline a placa para acumular os esferóides NC em um lado dos poços. Averie cuidadosamente e descarte o máximo de meio possível e alimente-se com 1 mL do dia 10-14 meio esferoide.
   3. Continue alimentando as células todos os dias até o dia 14.
   4. Opcional: Se os esferóides agregarem e gerarem uma grande moita, use uma pipeta para quebrar os aglomerados esferóides. Isso também garante que os esferóides individuais não fique muito grande.
      NOTA: A faixa de tamanho esferóide ideal deve ser em torno de 100-500 μm. Dentro desse intervalo, o tamanho dos esferóides individuais não é crítico. No entanto, a morfologia, como uma borda lisa e clara (Figura 3 e Figura 6) é importante para mais sucesso. No dia 14, cada placa de 24 poços contém idealmente cerca de 50-60 esferóides de diferentes tamanhos dentro da faixa de tamanho acima mencionada.
2. Opção 2: Cultura esferóide expandida
   1. No dia 15, para manter os esferóides NC, alimente-se com 1,5 mL do dia 10-14 meio esferóide contendo 0,5 μM RA. Incubar a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: A RA deve ser adicionada fresca para cada alimentação e ser sempre armazenada a -80 °C.
   2. A partir de agora, alimente-se a cada dois dias até o dia 28 e, em seguida, continue com o revestimento dos esferóides (seção 7.1).
      NOTA: Os esferóides em crescimento são divididos aproximadamente 1x por semana, pipetando-os com uma pipeta de 1 mL para separá-los. Eles são divididos em uma proporção aproximada de 1:2-1:4. Dentro do período de expansão de 2 semanas, as células devem quadruplicar em número.

7. Diferenciação e maturação do SymN (Opção 1: após o dia 14; Opção 2: após o dia 28)

1. Chapeamento esferóides em pratos regulares
   1. Prepare 24 placas de poço revestidas de PO/LM/FM.
   2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicionar fresco cada ração) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
   3. No dia 14, incline a placa para acumular esferóides NC em um lado dos poços. Aspirar cuidadosamente e descartar o máximo de meio possível, e alimentar com 1 mL de meio symN.
   4. Remova LM/FN das placas revestidas.
   5. Divida e emplacre cada um dos poços da placa de 24 poços em 4 poços separados do novo, revestido 24 bem. Cada poço original terá 1 mL, contendo ~50-60 esferóides. Isso rende 250 μL, contendo aproximadamente 10-15 esferóides para cada poço na nova placa.
   6. Adicione 250 μL de meio adicional por poço.
      NOTA: Esta é uma divisão de 1:4; certifique-se de que os esferóides sejam distribuídos corretamente dentro da solução para que a divisão seja relativamente uniforme. O número de esferóides não é contado porque o número final não afeta o sucesso da geração de symNs.
   7. Incubar a 37 °C, 5% CO₂.
   8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), alimente-se substituindo todos os meios por 1 mL de meio symN contendo 0,125 μM RA. A partir de agora, os neurônios devem ser alimentados a cada 2 dias até o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
   9. Após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2), os neurônios devem ser alimentados substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente (500 μL). De agora em diante, alimente-se toda semana, a menos que o meio fique amarelo rapidamente.
   10. Continue se alimentando semanalmente até o ponto de tempo desejado.
       NOTA: simns tendem a agregar em estruturas semelhantes a gânglios e são propensos a se desprender dos pratos culturais. Para evitar isso, recomenda-se meia-alimentação e manuseio mínimo.
2. Células de chapeamento para gravação eletrofisiológica
   1. Prepare as placas de eletrofisiologia de 96 poços revestidas de PO/LM/FM.
   2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicionar fresco cada ração) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
   3. No dia 14, pegue todos os esferóides, depois centrifuga-los a 200 x g por 4 min.
   4. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de solução de dissociação e transfira a mistura de volta para um dos poços da placa de fixação ultra-baixa. Incubar a 37 °C, em 5% de CO₂ por 20-45 min.
      NOTA: Dependendo do tamanho dos esferóides, o período de dissociação pode ser maior que 20 min. Verifique a dissociação da célula a cada 10 min até 45 min. Opcionalmente, 0,1 mg/mL de DNase pode ser adicionado com solução de dissociação para evitar dna livre de células mortas tornando a solução pegajosa. Isso é opcional neste protocolo porque os esferóides não se agregam uma vez que estão totalmente dissociados.
   5. Pipet para dissociar totalmente os esferóides, em seguida, centrífuga a 200 x g por 4 min.
   6. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com a quantidade apropriada de meio symN e conte o número da célula.
   7. Emplacaas as células a 100.000/cm² em poços de eletrofisiologia revestidos de PO/LM/FN em volume total de 200 μL por poço.
   8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), siga os mesmos processos de alimentação da seção 7.1. O volume total após o dia 15 (ou dia 29 para a opção 2) deve ser de 300 μL por poço.
   9. Meça os sinais elétricos usando uma máquina de matriz multieletrodo após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
      NOTA: Na opção 2, os esferóides podem ser banhados a qualquer momento entre o dia 14 e o dia 28. As primeiras medições de sinais elétricos podem ser realizadas 1 semana após o revestimento dos esferóides.

Neste protocolo, damos instruções sobre como gerar symNs a partir de hPSCs. As condições de cultura aqui demonstradas foram melhoradas de um protocolo publicadoanteriormente 23,24 (Figura 1A) para condições livres de alimentadores e quimicamente definidas(Figura 1B). Duas opções são fornecidas, uma em que os simns são feitos dentro de 20 dias, e outra onde os NCCs podem ser expandidos por 2 semanas para gerar mais células que podem então ser diferenciadas em simns(Figura 1B,Opção 1 e 2).

Para monitorar adequadamente as características simmN de células diferenciadas, a linha de repórteres PHOX2B-eGFP WA09 e a linha de PSCs WA09 pai19. Todas as diferenciações foram conduzidas em pelo menos três repetições biológicas, definidas como experimentos de diferenciação independenteapós pelo menos uma passagem e/ou derivadas de um frasco recém-descongelado de células. A diferenciação foi induzida quando a confluência de hPSCs indiferenciados atingiu 80%-90%. As colônias hPSC eram redondas, com bordas brilhantes e lisas e pouco ou nenhuma diferenciação. As colônias não devem se tocar(Figura 2B, dia 0). Em vez da inibição típica de SMAD duplo25, que foi anteriormente usada para indução de neurectoderme, a inibição TGF-β combinada com a sinalização WNT e BMP4 nos primeiros 2 dias levou a uma expressão robusta do marcador de crista neural inicial AP2a. O marcador de crista neural SOX10 foi expresso do dia 4 ao dia 10(Figura 2B). NcCs emergiram em cumes densos e escurecidos visíveis a partir do dia 6. Estes cumes expressam SOX10 (Figura 2B, setas). Foi mostrado anteriormente que sox10 no estágio NCC se correlaciona com o marcador de superfície celular CD49D23,26 e, portanto, CD49D pode ser utilizado para classificar células NC que não estão relatando nenhum fluoróforo do lócus SOX10. A Figura 2C mostra a expressão dos genes marcadores NCC ao longo do tempo. A Figura 2D indica que nossa eficiência de diferenciação foi superior a 80%. Para determinar a identidade das células remanescentes, qRT-PCR foi usado para testar tipos de células contaminantes, incluindo mesoderme expresso por BryT, endoderme expressor a SOX17 e neuroectoderm expressado por PAX6; todos foram encontrados ausentes ou expressos em níveis muito baixos (dados não mostrados; ver Tabela Suplementar 1 para todos os primers). No entanto, foi detectado algum placode SIX1/EYA1+ (dados não mostrados) que podem ser a fonte dos demais tipos de células. Além disso, é possível que os demais tipos de células sejam derivados de NCC que já estão mais diferenciados. O código HOX dos NCCs foi avaliado nesta fase (Figura 2E). No entanto, neste estágio inicial os sinais HOX eram muito baixos (note a escala), sugerindo que esses NCCs eram de caráter cranial-NC ou ainda não tinham adotado nenhum caractere de subtipo NCC.

No dia 10 os NCCs poderiam ser purificados usando facs, que renderam cerca de 80% CD49D+ NCCs(Figura 2D). Um exemplo de uma estratégia típica de gating é indicado na Figura 2D. Após a classificação, as células foram agregadas como esferóides NC(Figura 3A). Para expandir os NCCs e induzir propriedades semelhantes ao tronco-NC, as células foram tratadas com uma combinação de FGF2 e CHIR. Testamos se a classificação para a população cd49D+ rendeu culturas melhores ou mais puras de simns mais tarde. A Figura 3B compara-se unsorted versus CD49D+ classificada versus CD49D- populações de células classificadas. À esquerda, pode-se ver que as populações classificadas positivas e as não classificadas fizeram esferóides NC de forma semelhante, enquanto as células classificadas negativas não se agregaram adequadamente, não fizeram esferóides redondos, suaves e saudáveis e morreram dentro de 3-4 dias. Além disso, quando os esferóides NC foram comparados no dia 14 via qRT-PCR para marcadores progenitores NC e symN, não foram detectadas diferenças significativas entre células classificadas e não classificadas. Notavelmente, neste ponto a expressão de marcadores progenitores simpáticos ainda era baixa e os níveis sox10 permaneceram altos, sugerindo que os esferóides ainda eram compostos de células com propriedades NC. Um dia após o revestimento (dia 15), tanto os esferóides não classificados quanto os CD49D+ bem ligados aos pratos PO/LM/FN e o crescimento neurite poderia ser claramente observado(Figura 3B,D15 e Figura 3C, D29). As culturas não classificadas e classificadas foram levadas adiante até o dia 35 em paralelo, mas não foram observadas grandes diferenças (dados não mostrados). Assim, pode-se concluir que a etapa de classificação não foi essencial para a geração de simetrias e, portanto, é um passo opcional neste protocolo. No entanto, para diferenciações menos eficientes que não produzem 80% de células CD49D+, recomendamos o procedimento de classificação.

Em seguida, testamos se esses esferóides NC poderiam ser mantidos sem perder sua identidade NC(Figura 3A, opção 2). Os NCCs foram cultivados como esferóides por até 2 semanas(Figura 3C). A morfologia do dia 28 esferóides e células banhadas no dia 29 foram semelhantes quando comparadas com as células do dia 14 e 15 na opção 1. No dia 28, a expressão SOX10 foi mantida em níveis semelhantes aos do dia 14. No entanto, a expressão dos marcadores progenitores simpáticos precoces (ou seja, ASCL1, PHOX2B e GATA3) aumentou (Figura 3C, à direita), sugerindo que a cultura estendida na sinalização FGF2, WNT e RA levou à maturação e posteriorização(Figura 4C e F). Efeitos semelhantes foram relatados anteriormente por Kirino et al21.

Após a expansão do NC (opção 1 ou opção 2), os esferóides foram banhados em pratos revestidos de PO/LM/FN e fornecidos com múltiplos fatores neurais para amadurecer as simns(Figura 4A). Nos dias 20 e 35 (1 semana após o emplacamento nas opções 1 e 2, respectivamente), os neurites foram observados em um padrão radial que se estende dos esferóides anexados(Figura 4A,à direita). Além disso, foram expressos marcadores relacionados à síntese e transporte de norepinefrina (NE) (i.e., TH, AAAD, DBH)(Figura 4B). A presença de tipos de células contaminantes foi novamente examinada aqui, e a expressão de ChAT, que pode indicar neurônios parassimpáticos, foi encontrada (Figura 4B,E). No entanto, o ChAT também é expresso em symNs colinérgicos. Foram detectados níveis muito baixos de VIP, outro marcador parassimpático (dados não mostrados). Além disso, foram detectados baixos níveis de BRN3A, ISL1 e RUNX1 (Figura 4B,E),o que poderia indicar neurônios sensoriais ou neurônios trigêmeos, ou seja, derivados de placode. Foram detectados EDNRB mínimos (marcando neurônios entéricos) e OLIG2 (marcação de neurônios motorizados) (dados não mostrados). A identidade das células não neuronais ainda não está clara. No entanto, com base nos resultados do nosso protocolo symN anterior23, eles eram provavelmente αSMA+ miofibroblastos. A expressão dos genes HOX foi reexaminada, e verificou-se que hox5-9 foram expressos, sugerindo uma identidade tronco. HOX10 (indicativo de sacral-NC) não foi expresso(Figura 4C, F). Por último, foram expressos marcadores maduros, incluindo receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/4) e receptores relacionados com NE, incluindo receptores adrenérgicos (ADRA2A/B2)Figure 4DtransportadorGNE (NET, SCL6A2) e transportador de vesícula (VMAT1) Não foi encontrada diferença significativa na expressão desses genes em células derivadas da opção 2 em comparação com a opção 1 (Figura 4E-G).

Confirmamos ainda nossos resultados realizando este protocolo na linha de repórteres H9-PHOX2B:GFP(Figura 5). No dia 20, as células formavam um gramado denso de neurônios e agregavam-se em aglomerados de densidade ainda maior, indicando uma eficiência de diferenciação muito alta(Figura 5A,linha superior). A coloração mostrou que a maioria das simetrias se aglomeram nesses aglomerados, o que dificultou a avaliação e quantificação da eficiência geral de diferenciação. Para destacar a coloração e a colocalização de marcadores symN específicos, focamos nas áreas menos densas nos arredores dos clusters (ver caixa amarela na Figura 5A, à direita). Foi também onde a maioria das células contaminantes estava localizada, por isso não era uma boa área para julgar a eficiência geral. No entanto, marcadores típicos de symN; incluindo periferia (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH e NET1 (expresso em pontoao longo de corpos e axônios, Figura 5A, fundo); foram detectados. Uma abordagem de matriz multieletroda (MEA) foi empregada para medir a atividade elétrica, e foi encontrado naquele dia 20 simns disparados em cerca de 3-5 picos por segundo em comparação com o controle negativo de hPSCs indiferenciados(Figura 5B). É importante que as células sejam distribuídas uniformemente no poço para que cada eletrodo (pontos pretos na Figura 5B,campo brilhante) registre corretamente. Dia 20 a dia 30 symNs também foram estimulados com 1 μM de nicotina, que imita a sinalização pré-ganglionária de símNs in vivo e aumentou a taxa média de disparo nas células. A inibição dos neurônios também foi medida. β2-adrenérgico receptor (ADRB2), localizado em terminais de axônio symN, cria um ciclo de feedback positivo para a secreção NE29. Tratar os simns com propranolol de 1 μM (um antagonista do receptor β2-adrenérgico) inibiu sua atividade(Figura 5C,direita). Esses resultados sugerem que os simns gerados por este protocolo estavam funcionalmente ativos.

Figura 1: Ilustração esquemática e comparação de protocolos de diferenciação symN. (A) Protocolo anterior de Zeltner et al.23. (B)Protocolo otimizado. A opção 1 tem 20 dias de duração e contém apenas 4 dias de cultura esferóide NC. A opção 2 tem 35 dias de duração e contém um estágio de expansão esferóide NC de 2 semanas que permite a produção de mais células NC. VTN = vitronectina, PO = poli-L-ornithine, LM = laminin, FN = fibronectina, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = ácido retinóico, AA = ácido ascórbico, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: indução de NC. (A) Cronograma e tratamentos para indução de NC do dia 0 ao dia 10. (B) A morfologia e a formação de cristas NC foram monitoradas a cada 2 dias por microscopia de campo brilhante. As células em cada ponto de tempo após o dia 2 foram co-manchadas para AP2A (vermelho) e SOX10 (verde). Todas as imagens de imunofluorescência foram contrariadas com DAPI. Flechas vermelhas indicam as estruturas dos cumes. (C) análise qRT-PCR para o perfil de expressão dos marcadores NC do dia 2-10. (D) Parcela representativa da classificação FACS no dia 10 para as populações de CD49D+ NC (esquerda). Uma estratégia típica de gating e controle de isótipo é indicada nas quatro primeiras parcelas. Também foi realizada quantificação do Percentual de CD49D+ celular no dia 10. (E) análise qRT-PCR para o perfil de expressão dos genes HOX do dia 2-10. NC = crista neural. As barras de erro provêm de dados de n ≥ 3 repetições biológicas, definidas como experimentos de diferenciação independentes realizados em dias separados das culturas de PSC que foram pelo menos um separado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Manutenção e expansão da crista neural. (A) Cronograma e tratamentos para expansão nc durante o dia 10 ao dia 14 cultura para a opção 1 ou dia 10 ao dia 28 cultura para a opção 2. (B) A formação esferóide NC foi monitorada por microscopia de campo brilhante do dia 11 (1 dia após a formação esferóide) até o dia 14 (ou seja, o dia do revestimento). Foram comparadaspopulações não classificadas, CD49D+e CD49D. As células banhadas no dia 15 também são mostradas. As células não conseguiram formar esferóides adequadamente no CD49D- grupo e morreram após o revestimento. As células do dia 14 foram examinadas pela análise qRT-PCR (à direita) para o perfil de expressão dos progenitores de symN. Foram comparadas populações não classificadas e CD49D+ (n ≥ 3). (C) Os esferóides NC podem ser mantidos por até 2 semanas. Os esferóides foram monitorados por microscopia de campo brilhante do dia 15 ao dia 28 (dia do pouso). As células banhadas no dia 29 também são mostradas. Os esferóides do dia 28 foram examinados pela análise qRT-PCR para o perfil de expressão dos progenitores symN (à direita). As populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas (n ≥ 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Diferenciação e maturação de SymN. (A) Cronograma e tratamentos após o emplacamento no dia 14 para a opção 1 ou dia 28 para a opção 2. Fotos de microscopia de campo brilhante (à direita) mostram symNs no dia 20 e dia 35, respectivamente (1 semana após o revestimento para ambas as opções). (B-D) Opção 1 qRT-PCR análise para o perfil de expressão das propriedades symN entre os dias 20 e 30. As populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas. (E-G) Opção 2 qRT-PCR análise para o perfil de expressão das propriedades symN após o dia 35. As populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas (n ≥ 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Caracterização funcional de simegos. (A,linha superior) Imagem de campo brilhante de clusters symN no dia 20 e imagem manchada mostrando PRPH e TH células positivas duplas localizadas principalmente nos clusters. (A,fundo) Múltiplos marcadores de símn (canais separados) foram verificados por coloração de imunofluorescência no dia 20. O transportador de norepinefrina (NET1) foi localizado tanto na superfície dos corpos celulares quanto ao longo dos axônios e dendritos. Ele apareceu como pontuações nesta ampliação. Todas as imagens de imunofluorescência foram contrariadas com DAPI. (B) Mapas de calor representativos da análise de matriz multieletroda (MEA) para symNs no dia 20 (topo). A imagem de campo brilhante (inferior) mostra a densidade de simns e a distribuição de eletrodos (oito pontos pretos). Populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas aqui. (C) Quantificação das taxas médias de disparo para o dia 20-30 simns sob tratamentos de 1 μM de nicotina e 1 μM propranolol por 5 minutos, respectivamente (à direita). Os resultados das populações não classificadas e CD49d-positivas foram agrupados (n ≥ 3). Teste t de duas caudas sem par com correção de Welch, p-value:*<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Exemplo de células em condições inadequadas para proceder com a diferenciação. (A) Cronograma da diferenciação com cada ponto de verificação para morfologias celulares indicadas como em B–E. (B) hPSCs (a) com colônias saudáveis e muitas células diferenciadas, e (b) fronteiras mescladas e diferenciadas entre algumas colônias no dia 0. As setas vermelhas indicam as áreas fundidas. (C) NCCs no dia 10 com bolhas semelhantes a bolhas nos cumes. As setas vermelhas indicam as bolhas na linha superior. A linha inferior representa uma ampliação maior. Não conseguimos identificar a identidade celular das bolhas. No entanto, a presença de mais bolhas parece correlacionar-se com a menor expressão SOX10/CD49D. (D) Esferóides de aparência irregular sem bordas lisas e forma redonda no dia 14. (E)Symns insalubres e moribundos no dia 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para revelar.