Method Article

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tornaram-se uma poderosa ferramenta para a modelagem de doenças e o estudo do desenvolvimento embrionário humano in vitro. Anteriormente, apresentamos um protocolo de diferenciação para a derivação de neurônios autônomos com caráter simpático que tem sido aplicado a pacientes com neuropatia autônoma. No entanto, o protocolo foi construído sobre a Substituição de Soro Knock Out (KSR) e as condições de cultura baseadas em alimentadores, e para garantir alta eficiência de diferenciação, a classificação celular era necessária. Esses fatores causam alta variabilidade, alto custo e baixa reprodutibilidade. Além disso, não foram verificadas propriedades simpáticas maduras, incluindo a atividade elétrica. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado onde a cultura e a diferenciação do PSC são realizadas em condições culturais livres de alimentadores e quimicamente definidas. Marcadores genéticos que identificam a crista neural do tronco são identificados. Outra diferenciação em neurônios simpáticos pós-ganglionários é alcançada após 20 dias sem a necessidade de classificação celular. A gravação eletrofisiológica mostra ainda a identidade funcional do neurônio. O disparo detectado a partir de nossos neurônios diferenciados pode ser aprimorado pela nicotina e suprimido pelo antagonista do receptor adrenérgico propranolol. Progenitores neurais simpáticos intermediários neste protocolo podem ser mantidos como esferóides neurais por até 2 semanas, o que permite a expansão das culturas. Em suma, nosso protocolo de diferenciação de neurônios simpáticos atualizados mostra alta eficiência de diferenciação, melhor reprodutibilidade, mais flexibilidade e melhor maturação neural em comparação com a versão anterior. Este protocolo fornecerá aos pesquisadores as células necessárias para estudar os distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso autônomo.

Introduction

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Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataq....

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Protocol

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NOTA: A linha de repórteres H9 PHOX2B:GFP foi fornecida por Oh et al.19. Alguns primers qPCR utilizados neste artigo foram obtidos da OriGene Technologies, enquanto algumas seqüências são obtidas a partir de Frith et al.20,30.

1. Configuração para revestimento de pratos, preparação de mídia e manutenção de hPSC

  1. Revestimento de pratos
    1. Revestimento de Vitronectina (VTN)
      1. Coloque frascos de VTN em um banho de água de 37 °C até descongelamento total e misture bem.
      2. Para uma placa de Petri de 100 mm, misture....

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Results

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Neste protocolo, damos instruções sobre como gerar symNs a partir de hPSCs. As condições de cultura aqui demonstradas foram melhoradas de um protocolo publicadoanteriormente 23,24 (Figura 1A) para condições livres de alimentadores e quimicamente definidas(Figura 1B). Duas opções são fornecidas, uma em que os simns são feitos dentro de 20 dias, e outra onde os NCCs podem ser expandidos por 2 semanas para .......

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Discussion

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Publicamos recentemente duas revisões, uma discutindo o uso de symNs derivados do hPSC para modelagem de doenças31, bem como uma comparação aprofundada dos protocolos de diferenciação disponíveis22. Assim, aqui nos concentramos em solucionar problemas do protocolo atual para ajudar o pesquisador interessado a ter sucesso na fabricação de symNs. Durante todo o processo de diferenciação, a fim de obter dados consistentes, bem como células diferenciadas saudáveis, a contaminaç.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgements

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Gostaríamos de agradecer a Heidi Ulrichs pela leitura crítica e edição do manuscrito.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placas de cultura de células de 100 mmFalcon353003
Tubos cônicos de cultura de tecidos de 15 mLVWR/Corning89039-664
Placas de cultura de tecidos de 24 poçosFalcon353047
Placas de ultra-baixa fixação de 24 poçosCorning07 200 601 e 07 200 602
Incubadora de cultura de tecidos 5% CO2/20% O2Thermo Fisher/Life TecnologiasHeracell VIOS 160i
Tubos cônicos de cultura de tecidos de 50 mlVWR/Corning89039-656
Placas de cultura de tecidos de 6 poçosCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Solução de dissociação celular
Anticorpo anti-AP2aAbcamab108311Hospedeiro: Coelho; diluição
1:400Anticorpo anti-Ascl1BD Pharmingen556604Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:200
Anticorpo anti-CD49DBioLegend304313Hospedeiro: Camundongo IgG1; 5 μ l/milhão de células em 100 μ l volume
Anticorpo anti-CD49D (isotipo)BioLegend400125Hospedeiro: Camundongo IgG1; 5 μ l/milhão de células em 100 μ l volume
DAPI coranteSigmaD95421:1000 diluição
Anti-DBH anticorpoImmunostar22806Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500
Anticorpo anti-GFPAbcamab13970Hospedeiro: Frango; diluição 1:1000
Anticorpo Anti-HOXC9Abcamab50839Hospedeiro: Camundongo; diluição 1:100
Anticorpo anti-NET1MabNET17-1Hospedeiro: Camundongo; diluição 1:1000
Anticorpo anti-PRPHSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Hospedeiro: Camundongo IgG2a; diluição 1:200
Anticorpo anti-SOX10Santa Cruz Biotechnologysc-365692Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:100
Anticorpo anti-THPel-FreezP40101-150Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500
Ácido ascórbicoSigmaA8960-5GConcentração de estoque: 100 mM
Suplemento B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010Concentração de estoque: 50x
BDNFR& D Systems248-BDConcentração de estoque: 10 μ g/mL
BMP4R& D Systems314-BPConcentração de estoque: 6 mM
Contador de célulasThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Corrediças da câmara de contagem de célulasInvitrogenC10312
CentrífugaEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Concentração de estoque: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Concentração de estoque: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Concentração de estoque: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Concentração de estoque: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 gibco médioA15165-01
E8 gibco médioA15169-01Concentração de estoque: 1x
suplemento E8gibcoA15171-01Concentração de estoque: 50x
EDTASigmaED2SSConcentração de estoque: 0,5 M
Placas de eletrofisiologia (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
Beckman CoulterCytoFLEX (para FACS)
Máquina FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (para classificação)
Tubos FACS (tampa de filtro azul)Tubos Falcon352235
FACS (tampa branca)Falcon352063
Soro fetal bovino (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Concentração de estoque: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Matriz de membrana basal; Concentração de estoque: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina humana (FN)VWR/Corning47743-654Concentração de estoque: 1 mg/mL
de L-glutaminaThermo Fisher/Gibco25030-081Concentração de estoque: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA leitorAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse lamina I (LM)R & D Systems3400-010-01Concentração de estoque: 1 mg/mL
de suplemento de N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048Concentração de estoque: 100x
Meio neurobasalgibco21103-049Concentração de estoque: 1x
NGFPeproTech450-01Concentração de estoque: 25 μ g/mL
de solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco14190-136Concentração de estoque: 1x
bromidrato de poli-L-ornitina (PO)SigmaP3655Concentração de estoque: 15 mg/mL
Primocin (antibióticos)InvivoGenANTPM1Concentração de estoque: 50 mg/mL
de máquina de qPCRBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
placas de qPCRBio-Rad LaboratoriesHSP9601
FGF2 recombinanteR& D Systems233-FB/CFConcentração de estoque: 10 μ g/mL
Ácido retinóicoSigmaR2625Concentração de estoque: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Concentração de estoque: 10 mM
Azul de tripanoCorningMT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Concentração de estoque: 0,5 mg/mL
Banho-mariaVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Concentração de estoque: 10 mM
Máquina FACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

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