Method Article

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tornaram-se uma poderosa ferramenta para a modelagem de doenças e o estudo do desenvolvimento embrionário humano in vitro. Anteriormente, apresentamos um protocolo de diferenciação para a derivação de neurônios autônomos com caráter simpático que tem sido aplicado a pacientes com neuropatia autônoma. No entanto, o protocolo foi construído sobre a Substituição de Soro Knock Out (KSR) e as condições de cultura baseadas em alimentadores, e para garantir alta eficiência de diferenciação, a classificação celular era necessária. Esses fatores causam alta variabilidade, alto custo e baixa reprodutibilidade. Além disso, não foram verificadas propriedades simpáticas maduras, incluindo a atividade elétrica. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado onde a cultura e a diferenciação do PSC são realizadas em condições culturais livres de alimentadores e quimicamente definidas. Marcadores genéticos que identificam a crista neural do tronco são identificados. Outra diferenciação em neurônios simpáticos pós-ganglionários é alcançada após 20 dias sem a necessidade de classificação celular. A gravação eletrofisiológica mostra ainda a identidade funcional do neurônio. O disparo detectado a partir de nossos neurônios diferenciados pode ser aprimorado pela nicotina e suprimido pelo antagonista do receptor adrenérgico propranolol. Progenitores neurais simpáticos intermediários neste protocolo podem ser mantidos como esferóides neurais por até 2 semanas, o que permite a expansão das culturas. Em suma, nosso protocolo de diferenciação de neurônios simpáticos atualizados mostra alta eficiência de diferenciação, melhor reprodutibilidade, mais flexibilidade e melhor maturação neural em comparação com a versão anterior. Este protocolo fornecerá aos pesquisadores as células necessárias para estudar os distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso autônomo.

Introduction

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Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataques de vômito, hipertensão e ansiedade1. Um exemplo de toxicidade é o tratamento quimioterápico, que tem sido relatado ter efeitos colaterais tóxicos nos neurônios autônomos2. Sabe-se que a denervação autônoma e a hiper-inervação podem tanto levar, ou acompanhar, doenças como a doença de Parkinson ou a doença renal hipertensiva3,4. Assim, poder realizar pesquisas e entender os mecanismos da biologia symN e defeitos no contexto da doença é benéfico para a busca de tratamentos novos e eficazes.

Anatomia
O sistema nervoso periférico se ramifica em divisões sensoriais e autônomas. Os nervos afetuosos do sistema nervoso sensorial são responsáveis pela sensação de dor e tato, enquanto a ANS é responsável por repassar informações de todos os órgãos para o cérebro. A ANS é dividida no sistema nervoso entérico, interiorizando o trato gastrointestinal, o sistema nervoso parassimpático, importante para o relaxamento, e o sistema nervoso simpático (SNS), importante para ativação/regulação dos órgãos. O SNS adapta um sistema de dois neurônios5. Axônios neurais simpáticos pré-ganglionic na medula espinhal primeiro projetam os gânglios simpáticos, onde os corpos de células símn pós-ganglionárias estão localizados. Esses neurônios então enviam projeções longas para inervar os tecidos alvo de cada órgão do corpo. Os sinais transmitidos por neurônios pré-ganglionics são colinérgicos, enquanto as símns pós-ganglionárias são adrenérgicas e, portanto, expressam a norepinefrina (NE) como seu principal neurotransmissor. Há poucas exceções notáveis de neurônios pós-ganglionários e simpáticos que são colinérgicos, incluindo os que inervam os vasos sanguíneos. Os neurônios pós-ganglionários adrenérgicos expressam as enzimas tyrosine hydroxylase (TH), aromático L-aminoácido decarboxylase (AAAD), dopamina β-hidroxilase (DBH) e monoamina oxidase (MAO-A), todas responsáveis pela geração e metabolização do NE. Além disso, expressam os transportadores de reciclagem ne e/ou receptores α-adrenérgicos receptor (ADRA2), receptor β-adrenérgico (ADR2B), transportador de norepinefrina (NET1) e transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).

Desenvolvimento
Durante o desenvolvimento embrionário, as simens são derivadas da crista neural (NC), que emerge entre o tubo neural e o ectoderme de sobreposição6, e pode se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, incluindo melanócitos, osteoblastos, adiócitos, glia, neurônios entéricos, neurônios sensoriais e neurônios autônomos7. Células de crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que tomam várias rotas através do embrião. Nesta fase inicial do desenvolvimento do NC, as células expressam os marcadores SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. A rota de migração, juntamente com o local axial que eles adotam, determina o subtipo NC no qual eles se desenvolverão. Esses subtipos NC podem ser distinguidos por sua expressão genética hox específica: NCCs cranianos não expressam genes HOX, NCCs vagal expressam HOX 1-5, NCCs tronco expressam HOX 6-9, e NCCs sacral expressam HOX 10-1112. Entre eles, os NCCs tronco são reconhecidos como a principal fonte de symNs. Os precursores do SymN expressam o fator de transcrição MASH1/ASCL113, que promove a expressão de PHOX2B14 e INSM115. A família GATA de fatores de transcrição é expressa durante o desenvolvimento solidário tardio. GATA2 e GATA3 são expressos nos symNs, que por sua vez ativa o DBH16. O fator de transcrição HAND2 também é importante para a expressão e manutenção do DBH e th17.

Os HPSCs (por exemplo, células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) são uma poderosa ferramenta18 para recapitular paradigmas de desenvolvimento e gerar simns que podem ser empregados para a modelagem de doenças de vários distúrbios humanos. Assim, ao gerar symNs a partir de hPSCs, é fundamental seguir as diretrizes de desenvolvimento e avaliar a expressão de marcadores apropriados ao longo do processo de diferenciação.

Protocolo symN anterior
Poucos grupos de pesquisa relataram anteriormente a geração de symNs a partir de hPSCs19,20,21. A comparação direta desses protocolos entre si e com o nosso foi revisada recentemente22. Em 201623, publicamos um protocolo de diferenciação para a geração de neurônios autônomos com caráter symN (Figura 1A). Este protocolo utilizou o meio baseado em KSR, que foi utilizado tanto na manutenção de hPSCs indiferenciados quanto na diferenciação celular. Além disso, os hPSCs foram mantidos em fibroblastos embrionários de camundongos (células alimentadoras de MEF). Utilizamos este protocolo e PSCs de pacientes com DF para modelar o transtorno23. Em 2019, descrevemos uma versão mais detalhada deste protocolo mais antigo24. Em resumo, o destino neural foi induzido pela inibição SMAD25 para bloquear a sinalização TGF-β e BMP nos primeiros 2 dias. A ativação wnt usando CHIR99021 promoveu progenitores neurais para se tornarem células NC. No dia 11, as células foram classificadas pelo FACS para as populações CD49D+ ou SOX10+ 26,23, que produziram cerca de 40% de eficiência de geração nc. Assim, a classificação foi necessária para garantir a eficiência e pureza para os próximos passos de diferenciação. Os NCCs foram mantidos e amplificados como esferóides com o tratamento combinado de FGF2 e CHIR. Após 4 dias, os esferóides NC de manutenção foram banhados e deram BDNF, GDNF e NGF para terminar a maturação symN. Embora esses simns expressem fortes marcadores de simegos como ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, os marcadores para simns mais maduros, incluindo a expressão do receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/CHRNB4) e transportador de vesícula (VMAT1/2), foram baixos mesmo após 70 dias de diferenciação. Os genes HOX neste protocolo não foram formalmente testados, e as propriedades neurais maduras, incluindo a atividade eletrofisiológica das células, não foram verificadas.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para gerar symNs(Figura 1B). Os HPSCs são mantidos em condições livres de alimentadores, em pratos revestidos de vitronectina (VTN), utilizando a mídia Essential 8 (E8)27. A fórmula dos meios de diferenciação tem sido modificada a cada etapa, aumentando assim o percentual da população nc28. A maturação symN pode ser feita em populações de NCC cd49D+/SOX10+ classificadas ou não classificadas em massa. Ambos mostram altos níveis de expressão de marcador symN até o dia 30. Além disso, os symNs gerados com este protocolo respondem ao registro eletrofisiológico e aos tratamentos com ativos e compostos inibidores symN.

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Protocol

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NOTA: A linha de repórteres H9 PHOX2B:GFP foi fornecida por Oh et al.19. Alguns primers qPCR utilizados neste artigo foram obtidos da OriGene Technologies, enquanto algumas seqüências são obtidas a partir de Frith et al.20,30.

1. Configuração para revestimento de pratos, preparação de mídia e manutenção de hPSC

  1. Revestimento de pratos
    1. Revestimento de Vitronectina (VTN)
      1. Coloque frascos de VTN em um banho de água de 37 °C até descongelamento total e misture bem.
      2. Para uma placa de Petri de 100 mm, misture 7 mL de 1x de solução salina tamponada de fosfato (PBS) com 0,5 mg/mL VTN, adicione a solução VTN ao prato e incuba r$ 1 h.
    2. Revestimento da matriz da membrana do porão
      1. Descongele frascos da matriz de membrana do porão (ver Tabela de Materiais) no gelo a 4 °C durante a noite.
      2. Para um poço de uma placa de 6 poços, misture 2 mL de DMEM/F12 com 20 μL de matriz de membrana de porão de 100x, adicione a solução de matriz de membrana do porão ao prato, enrole o prato com filme de parafina e armazene em um recipiente limpo a 4 °C durante a noite. Trabalhe o mais rápido possível. Os pratos revestidos podem ser armazenados em 4 °C por até 2 semanas.
    3. Revestimento poliornino (PO)/laminin (LM)/fibronectina (FN)
      1. No primeiro dia, para um poço de 24 bem, misture 15 μg/mL de PO com 1 mL de 1x PBS, incubar a 37 °C, 5% CO2 durante a noite. Descongele tanto LM quanto FN a -20 °C durante a noite e armazene a 4 °C até descongelar totalmente.
      2. No segundo dia, solução PO aspirada, lave os poços 2x com 1x PBS, adicione 1 mL de 1x PBS contendo 2 μg/mL de LM e 2 μg/mL de FN e incubar a 37 °C em 5% DE CO2 durante a noite. Neste ponto o prato com a solução LM/FN pode ser mantido na incubadora por meses, desde que não seque. Adicione mais 1x PBS para evitar que o prato seque.
  2. Preparação da mídia
    1. Prepare o meio Essential 8 (E8) descongelando uma garrafa de suplemento E8 a 4 °C durante a noite. Misture o suplemento com 500 mL de meio E8 e antibióticos, se necessário.
      NOTA: A solução E8 de trabalho deve ser usada dentro de 2 semanas.
    2. Prepare o meio de congelamento hPSC misturando 90 mL de meio E8 completo com 10 mL de DMSO para um volume total de 100 mL. Filtrar.
    3. Prepare o meio de diferenciação dia 0 a dia 1 misturando 100 mL de médio essencial 6 (E6) com 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 e 10 μM Y27632 para um volume total de 100 mL.
    4. Prepare o meio de diferenciação do dia 2 ao dia 10 misturando 100 mL de Médio E6 com 10 μM SB e 0,75 μM CHIR99021 para um volume total de 100 mL.
    5. Prepare o dia 10 ao dia 14 meio esferoide misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 μM CHIR99021 e 10 ng/mL FGF2 para um volume total de 100 mL.
    6. Prepare o dia 14 ao dia 28 médio para manutenção de longo prazo esferoide adicionando 0,5 μM de RA fresco para o dia 10 a dia 14 meio esferóide para cada alimentação.
      NOTA: Mantenha sempre a RA a -80 °C.
    7. Prepare o meio de maturação SymN misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-glutamato, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM de ácido ascórbico e 0,2 mM dbcAMP para um volume total de 100 mL. A solução deve ser usada dentro de 2 semanas. Antes de cada alimentação, adicione 0,125 μM de RA fresco. Esta solução é utilizada a partir do dia 14 (opção 1) ou dia 28 (opção 2).
    8. Prepare o tampão FACS misturando DMEM com 2% de FBS, 2 mM L-glutamato e antibióticos, se necessário, para um volume total de 100 mL.
  3. manutenção hPSC
    1. Descongelamento e manutenção de hPSCs
      1. Prepare um prato de 100 mm revestido de VTN.
      2. Para descongelar um frasco de hPSCs diretamente do nitrogênio líquido, coloque o frasco em um banho de água de 37 °C, balançando cuidadosamente o tubo na água até que ele descongele. Transfira os hPSCs descongelados para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS, e centrífuga a 200 x g por 4 min.
      3. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de meio E8 ao tubo. Pipeta algumas vezes para resuspender totalmente a pelota e, em seguida, adicionar outros 9 mL de meio E8 para atingir o total de 10 mL.
      4. Aspirar a solução VTN do prato de 100 mm.
      5. Transfira os hPSCs para um prato de 100 mm, agite suavemente (para cima e para a esquerda-direita, não em círculos) para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente no prato
      6. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2.
      7. No dia seguinte, aspirar todos os meios e alimentação com 10 mL de E8.
      8. Alimente-se todos os dias durante os próximos 3-4 dias e, em seguida, prepare-se para dividir.
    2. Divisão de hPSCs
      NOTA: os hPSCs no ponto de divisão devem ser de 80% a 90% de confluentes. Grandes colônias com bordas lisas e brilhantes devem ser observadas. No entanto, o contato entre cada colônia deve ser evitado (Figura 2B,dia 0 e Figura 6B).
      1. Prepare pratos de 100 mm revestidos com VTN, conforme necessário.
      2. Apire o E8 e lave o prato que precisa ser dividido em 1x com 1x PBS.
      3. Apirate o 1x PBS e adicione 4 mL de 0,25 M EDTA. Incubar por 2 min a 37 °C, 5% CO2.
        NOTA: Os hPSCs devem ser divididos/rebobinados como pequenas colônias. Não trate com EDTA mais de 2 minutos para evitar a separação em células únicas. As células devem ser ainda anexadas à superfície do prato após o tratamento de 2 min.
      4. Apiratee o EDTA, desconecte as colônias com 10 mL de meio E8 na superfície do prato, e colete todos os meios e células em um tubo de 15 mL.
      5. Com hPSCs a 80%-90% de confluência, dividiu colônias por 1:15-1:20. Por exemplo, para dividir os hPSCs por 1:20 em um prato de 100 mm, pegue 500 μL de solução E8/hPSCs e misture com 9,5 mL de meio E8 fresco.
      6. Placa hPSCs em pratos de 100 mm revestidos com VTN.
        NOTA: É aconselhável estabelecer a razão de divisão ideal para cada pesquisador e linha celular de forma independente.
    3. Congelamento de hPSCs
      1. Para um prato de 100 mm de hPSCs que está pronto para ser dividido, prepare três crioviais e 3,5 mL de meio de congelamento.
        NOTA: A mídia e os frascos devem ser mantidos em 4 °C ou no gelo até o uso.
      2. Aspirar E8 e lavar o prato 2x com 1x PBS.
      3. Aspirar 1x PBS e adicionar 4 mL de 0,25 M EDTA, incubar por 2 min a 37 °C, em 5% de CO2.
        NOTA: os hPSCs devem ser congelados como pequenas colônias no momento em que seriam divididos. Não trate as células com EDTA por mais de 2 minutos para evitar a separação em células individuais. As células devem ser fixadas na superfície do prato após o tratamento de 2 min.
      4. Aspire o EDTA, desconecte as colônias com 10 mL de 1x PBS na superfície do prato, e colete todos os meios e células em um tubo de 50 mL.
      5. Adicione 20 mL de 1x PBS e centrífuga a 200 x g por 4 min para lavar o EDTA restante.
      6. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota em 3 mL de meio de congelamento.
      7. Distribua hPSCs uniformemente nos três crioviais, 1 mL cada.
      8. Armazene a -80 °C durante a noite em uma caixa de congelamento controlada ou um sanduíche de isopor para garantir uma queda de temperatura lenta e, em seguida, transfira para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

2. Semeamento de hPSCs para iniciar a diferenciação (dia 0)

NOTA: os hPSCs devem estar prontos para diferenciação após serem estabilizados (ou seja, sendo divididos 2-3x após o descongelamento). Certifique-se de que as colônias são saudáveis, com bordas lisas e brilhantes e diferenciação mínima(Figura 2B).

  1. Prepare os pratos revestidos de matriz de membrana do porão (24 pratos de poço ou 6 bem) um dia antes do dia 0, conforme necessário. Leve os pratos para RT no início da diferenciação.
  2. Faça o dia 0-1 meio de diferenciação conforme necessário.
  3. Aspirar o E8 do confluente, pronto para dividir hPCSs, e lavar o prato 2x com 1x PBS.
  4. Adicione 7 mL de 0,25 M EDTA por prato de 100 mm, incubar a 37 °C, 5% CO2, por 15 min.
    NOTA: Neste ponto, o tratamento EDTA é prolongado para dispersar-se em células únicas.
  5. Pipet fora de todos os hPSCs (eles devem estar flutuando) e transferir para um tubo de 50 mL. Adicione a mesma quantidade ou mais de 1x PBS como solução EDTA para diluir o EDTA.
  6. Centrífuga a 200 x g por 4 min.
  7. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL do dia 0-1 meio de diferenciação e pipeta para homogeneizar as células. Siga adicionando mais meio e depois misture para diluir a solução celular a uma concentração ideal para contar as células.
    NOTA: Não diluir demais a solução celular. As células de um prato completo de 100 mm devem ser diluídas em 5 mL de meio para iniciar.
  8. Conte o número do celular usando um contador de celular automatizado ou hemocytometer.
  9. Diluir a solução celular conforme necessário para atingir 125.000 células/cm2 em um volume final baixo (por exemplo, 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 500 μL por poço para um prato de 24 poços).
    NOTA: Um volume baixo ajuda as células a se conectarem mais rapidamente.
  10. Atribua toda a solução da matriz de membrana do porão dos pratos revestidos e emplacre a solução celular nos poços.
  11. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2.

3. Indução de células da crista neural (dia 1 ao dia 10, Figura 2A)

  1. No dia 1 alimentam as células com o meio de diferenciação do dia 0-1 (3 mL por poço para 6 pratos de poço e 1 mL por poço para 24 pratos de poço).
  2. No dia 2 alimentam as células com o meio de diferenciação dia 2-dia 10 (3 mL por poço para 6 pratos de poço e 1 mL por poço para 24 pratos de poço).
  3. A partir de agora, as células devem ser alimentadas dia não, dia não, até o dia 10 (ou seja, o próximo dia de alimentação será o dia 4).
    NOTA: A partir do dia 6, devem ser detectados cumes NC(Figura 2B). Para verificar se a diferenciação está ocorrendo, é aconselhável levar uma cultura de diferenciação paralela em poços menores (ou seja, 24 poços), que podem ser manchadas para SOX10/AP2a e usadas para expressão genética de marcadores ao longo do tempo de diferenciação(Figura 2B,C).
  4. Se as células de triagem, prossigam para a seção 4. Caso contrário, vá para a seção 5.

4. Classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para marcador de crista neural CD49D e agregação de células NC em esferóides

NOTA: Para a classificação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e não expostas à luz após a coloração até a triagem.

  1. Prepare o buffer FACS se as células estiverem classificadas.
  2. Prepare o dia 10-14 meio esferóide.
  3. No dia 10, retire o meio e lave 1x com 1x PBS.
  4. Adicione a solução de dissociação (ver Tabela de Materiais) a 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 1 mL por poço para um prato de 24 poços, e incubar a 37 °C, 5% CO2 por 20 min.
  5. Pipet fora de todos os hPSCs e transferir para um tubo de 50 mL.
  6. Encha o resto do tubo com tampão FACS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
    NOTA: Cada tubo de 50 mL pode acomodar até 20 mL ou menos de solução celular. O volume do buffer FACS deve ser alto o suficiente para neutralizar a solução de dissociação.
  7. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com a quantidade apropriada de tampão FACS (~2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
  8. Prepare as seguintes amostras.
    1. Amostra 1 (controle não manchado): 1 x 106 células em 400 μL de tampão FACS. Filtre as células através de uma tampa de filtro de 20 μm e mantenha o tubo no gelo.
    2. Amostra 2 (controle somente DAPI): 1 x 106 células em 400 μL de tampão FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI. Filtre as células através de um tubo FACS com uma tampa de coador e mantenha o tubo no gelo.
    3. Amostra 3 (etiquetac49d): Suspender o resto das células com tampão FACS contendo anticorpo CD49D conjugado com PE/Cy7 (5 μL para 1 x 106 células por 100 μL de tampão FACS) em um tubo de 15 mL e incubar no gelo por 20 min.
  9. Encha os tubos com tampão FACS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
  10. Descarte o sobrenadante e resuspenda todas as células 5-10 x 106 em 1 mL de buffer FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI de acordo com as instruções do fabricante.
  11. Filtre as células através do tubo FACS com a tampa do coador e mantenha o tubo no gelo.
  12. Preparar tubos FACS de coleta contendo 2 mL de tampão FACS.
  13. Classifique através da máquina FACS com lasers que podem detectar DAPI e PE-Cy7 para isolar a população CD49D+.
  14. Depois de classificar, conte as células classificadas.
  15. Centrifugação todas as células classificadas e resuspender no dia 10-14 meio esferóide para uma concentração final de 0,5 x 106 células por 500 μL de meio.
  16. Placa 0,5 x 106 células por poço em anexo ultra-baixo 24 placas de poço.
  17. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO2.

5. Agregando células NC em esferóides

  1. Se não usar facs para isolar as células NC e, em vez disso, agregá-las diretamente em esferóides, primeiro prepare as células conforme descrito nas etapas 4.2-4.5.
  2. Encha o resto do tubo com 1x PBS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
  3. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com uma quantidade apropriada do dia 10-14 meio esferóide (por exemplo, ~2 mL de meio por poço para uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
  4. Diluir as células no meio esferóide do dia 10-14 para 0,5 x 106 células por 500 μL de meio.
  5. Placa de 500 μL da suspensão celular por poço em fixação ultra-baixa 24 placas de poço.
  6. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO2.

6. Manutenção esferóide NC e indução progenitora simpática (dia 10 ao dia 14, Figura 4A)

  1. Opção 1: Cultura esferóide mínima
    1. No dia 11, adicione 500 μL do dia 10-14 meio esferóide sem aspirar meio existente a partir do dia 10. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2.
    2. No dia 12, incline a placa para acumular os esferóides NC em um lado dos poços. Averie cuidadosamente e descarte o máximo de meio possível e alimente-se com 1 mL do dia 10-14 meio esferoide.
    3. Continue alimentando as células todos os dias até o dia 14.
    4. Opcional: Se os esferóides agregarem e gerarem uma grande moita, use uma pipeta para quebrar os aglomerados esferóides. Isso também garante que os esferóides individuais não fique muito grande.
      NOTA: A faixa de tamanho esferóide ideal deve ser em torno de 100-500 μm. Dentro desse intervalo, o tamanho dos esferóides individuais não é crítico. No entanto, a morfologia, como uma borda lisa e clara (Figura 3 e Figura 6) é importante para mais sucesso. No dia 14, cada placa de 24 poços contém idealmente cerca de 50-60 esferóides de diferentes tamanhos dentro da faixa de tamanho acima mencionada.
  2. Opção 2: Cultura esferóide expandida
    1. No dia 15, para manter os esferóides NC, alimente-se com 1,5 mL do dia 10-14 meio esferóide contendo 0,5 μM RA. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: A RA deve ser adicionada fresca para cada alimentação e ser sempre armazenada a -80 °C.
    2. A partir de agora, alimente-se a cada dois dias até o dia 28 e, em seguida, continue com o revestimento dos esferóides (seção 7.1).
      NOTA: Os esferóides em crescimento são divididos aproximadamente 1x por semana, pipetando-os com uma pipeta de 1 mL para separá-los. Eles são divididos em uma proporção aproximada de 1:2-1:4. Dentro do período de expansão de 2 semanas, as células devem quadruplicar em número.

7. Diferenciação e maturação do SymN (Opção 1: após o dia 14; Opção 2: após o dia 28)

  1. Chapeamento esferóides em pratos regulares
    1. Prepare 24 placas de poço revestidas de PO/LM/FM.
    2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicionar fresco cada ração) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
    3. No dia 14, incline a placa para acumular esferóides NC em um lado dos poços. Aspirar cuidadosamente e descartar o máximo de meio possível, e alimentar com 1 mL de meio symN.
    4. Remova LM/FN das placas revestidas.
    5. Divida e emplacre cada um dos poços da placa de 24 poços em 4 poços separados do novo, revestido 24 bem. Cada poço original terá 1 mL, contendo ~50-60 esferóides. Isso rende 250 μL, contendo aproximadamente 10-15 esferóides para cada poço na nova placa.
    6. Adicione 250 μL de meio adicional por poço.
      NOTA: Esta é uma divisão de 1:4; certifique-se de que os esferóides sejam distribuídos corretamente dentro da solução para que a divisão seja relativamente uniforme. O número de esferóides não é contado porque o número final não afeta o sucesso da geração de symNs.
    7. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), alimente-se substituindo todos os meios por 1 mL de meio symN contendo 0,125 μM RA. A partir de agora, os neurônios devem ser alimentados a cada 2 dias até o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
    9. Após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2), os neurônios devem ser alimentados substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente (500 μL). De agora em diante, alimente-se toda semana, a menos que o meio fique amarelo rapidamente.
    10. Continue se alimentando semanalmente até o ponto de tempo desejado.
      NOTA: simns tendem a agregar em estruturas semelhantes a gânglios e são propensos a se desprender dos pratos culturais. Para evitar isso, recomenda-se meia-alimentação e manuseio mínimo.
  2. Células de chapeamento para gravação eletrofisiológica
    1. Prepare as placas de eletrofisiologia de 96 poços revestidas de PO/LM/FM.
    2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicionar fresco cada ração) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
    3. No dia 14, pegue todos os esferóides, depois centrifuga-los a 200 x g por 4 min.
    4. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de solução de dissociação e transfira a mistura de volta para um dos poços da placa de fixação ultra-baixa. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2 por 20-45 min.
      NOTA: Dependendo do tamanho dos esferóides, o período de dissociação pode ser maior que 20 min. Verifique a dissociação da célula a cada 10 min até 45 min. Opcionalmente, 0,1 mg/mL de DNase pode ser adicionado com solução de dissociação para evitar dna livre de células mortas tornando a solução pegajosa. Isso é opcional neste protocolo porque os esferóides não se agregam uma vez que estão totalmente dissociados.
    5. Pipet para dissociar totalmente os esferóides, em seguida, centrífuga a 200 x g por 4 min.
    6. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com a quantidade apropriada de meio symN e conte o número da célula.
    7. Emplacaas as células a 100.000/cm2 em poços de eletrofisiologia revestidos de PO/LM/FN em volume total de 200 μL por poço.
    8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), siga os mesmos processos de alimentação da seção 7.1. O volume total após o dia 15 (ou dia 29 para a opção 2) deve ser de 300 μL por poço.
    9. Meça os sinais elétricos usando uma máquina de matriz multieletrodo após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
      NOTA: Na opção 2, os esferóides podem ser banhados a qualquer momento entre o dia 14 e o dia 28. As primeiras medições de sinais elétricos podem ser realizadas 1 semana após o revestimento dos esferóides.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, damos instruções sobre como gerar symNs a partir de hPSCs. As condições de cultura aqui demonstradas foram melhoradas de um protocolo publicadoanteriormente 23,24 (Figura 1A) para condições livres de alimentadores e quimicamente definidas(Figura 1B). Duas opções são fornecidas, uma em que os simns são feitos dentro de 20 dias, e outra onde os NCCs podem ser expandidos por 2 semanas para ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publicamos recentemente duas revisões, uma discutindo o uso de symNs derivados do hPSC para modelagem de doenças31, bem como uma comparação aprofundada dos protocolos de diferenciação disponíveis22. Assim, aqui nos concentramos em solucionar problemas do protocolo atual para ajudar o pesquisador interessado a ter sucesso na fabricação de symNs. Durante todo o processo de diferenciação, a fim de obter dados consistentes, bem como células diferenciadas saudáveis, a contaminaç...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Heidi Ulrichs pela leitura crítica e edição do manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placas de cultura de células de 100 mmFalcon353003
Tubos cônicos de cultura de tecidos de 15 mLVWR/Corning89039-664
Placas de cultura de tecidos de 24 poçosFalcon353047
Placas de ultra-baixa fixação de 24 poçosCorning07 200 601 e 07 200 602
Incubadora de cultura de tecidos 5% CO2/20% O2Thermo Fisher/Life TecnologiasHeracell VIOS 160i
Tubos cônicos de cultura de tecidos de 50 mlVWR/Corning89039-656
Placas de cultura de tecidos de 6 poçosCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Solução de dissociação celular
Anticorpo anti-AP2aAbcamab108311Hospedeiro: Coelho; diluição
1:400Anticorpo anti-Ascl1BD Pharmingen556604Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:200
Anticorpo anti-CD49DBioLegend304313Hospedeiro: Camundongo IgG1; 5 μ l/milhão de células em 100 μ l volume
Anticorpo anti-CD49D (isotipo)BioLegend400125Hospedeiro: Camundongo IgG1; 5 μ l/milhão de células em 100 μ l volume
DAPI coranteSigmaD95421:1000 diluição
Anti-DBH anticorpoImmunostar22806Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500
Anticorpo anti-GFPAbcamab13970Hospedeiro: Frango; diluição 1:1000
Anticorpo Anti-HOXC9Abcamab50839Hospedeiro: Camundongo; diluição 1:100
Anticorpo anti-NET1MabNET17-1Hospedeiro: Camundongo; diluição 1:1000
Anticorpo anti-PRPHSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Hospedeiro: Camundongo IgG2a; diluição 1:200
Anticorpo anti-SOX10Santa Cruz Biotechnologysc-365692Hospedeiro: Camundongo IgG1; diluição 1:100
Anticorpo anti-THPel-FreezP40101-150Hospedeiro: Coelho; diluição 1:500
Ácido ascórbicoSigmaA8960-5GConcentração de estoque: 100 mM
Suplemento B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010Concentração de estoque: 50x
BDNFR& D Systems248-BDConcentração de estoque: 10 μ g/mL
BMP4R& D Systems314-BPConcentração de estoque: 6 mM
Contador de célulasThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Corrediças da câmara de contagem de célulasInvitrogenC10312
CentrífugaEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Concentração de estoque: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Concentração de estoque: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Concentração de estoque: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Concentração de estoque: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 gibco médioA15165-01
E8 gibco médioA15169-01Concentração de estoque: 1x
suplemento E8gibcoA15171-01Concentração de estoque: 50x
EDTASigmaED2SSConcentração de estoque: 0,5 M
Placas de eletrofisiologia (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
Beckman CoulterCytoFLEX (para FACS)
Máquina FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (para classificação)
Tubos FACS (tampa de filtro azul)Tubos Falcon352235
FACS (tampa branca)Falcon352063
Soro fetal bovino (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Concentração de estoque: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Matriz de membrana basal; Concentração de estoque: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina humana (FN)VWR/Corning47743-654Concentração de estoque: 1 mg/mL
de L-glutaminaThermo Fisher/Gibco25030-081Concentração de estoque: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA leitorAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse lamina I (LM)R & D Systems3400-010-01Concentração de estoque: 1 mg/mL
de suplemento de N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048Concentração de estoque: 100x
Meio neurobasalgibco21103-049Concentração de estoque: 1x
NGFPeproTech450-01Concentração de estoque: 25 μ g/mL
de solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco14190-136Concentração de estoque: 1x
bromidrato de poli-L-ornitina (PO)SigmaP3655Concentração de estoque: 15 mg/mL
Primocin (antibióticos)InvivoGenANTPM1Concentração de estoque: 50 mg/mL
de máquina de qPCRBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
placas de qPCRBio-Rad LaboratoriesHSP9601
FGF2 recombinanteR& D Systems233-FB/CFConcentração de estoque: 10 μ g/mL
Ácido retinóicoSigmaR2625Concentração de estoque: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Concentração de estoque: 10 mM
Azul de tripanoCorningMT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Concentração de estoque: 0,5 mg/mL
Banho-mariaVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Concentração de estoque: 10 mM
Máquina FACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

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