O objetivo deste artigo é descrever um método refinado de intubação do rato de laboratório. O método é não invasivo e, portanto, ideal para estudos que requerem monitoramento serial da função respiratória e/ou instilação de tratamentos no pulmão.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Intubação Orotraqueal Repetida em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A literatura descreve vários métodos para intubação de camundongos que requerem visualização da grunagem através da cavidade oral ou incisão no pescoço ventral para confirmação direta da colocação da cânula na traqueia. A dificuldade relativa ou o trauma tecidual induzido ao sujeito por tais procedimentos pode ser um impedimento para a capacidade do pesquisador de realizar estudos longitudinares. Este artigo ilustra uma técnica na qual a manipulação física do camundongo após o uso de um depilatório para remover cabelos do pescoço ventral permite a visualização transcutânea da traqueia para intubação orotraqueal, independentemente do grau da pele Pigmentação. Este método é inócuo ao sujeito e facilmente alcançado com uma compreensão limitada da anatomia murina. Essa abordagem refinada facilita a intubação repetida, que pode ser necessária para monitorar a progressão da doença ou a instilação dos tratamentos. O uso deste método pode resultar em uma redução do número de animais e habilidade técnica necessária para medir a função pulmonar em modelos de camundongos de doenças respiratórias.
Introdução
O rato de laboratório é um modelo animal comum para doenças respiratórias humanas. Assim, existem vários métodos publicados para a intubação do rato para fins tanto de instilação de tratamentos quanto de medição da mecânica respiratória. A maioria dos procedimentos descritos requer visualização da gária através da cavidade oral com equipamentos especializados como laringoscópio ou fonte de luz de fibra óptica1,,2,,3,,4,,5,,6,7. No entanto, isso pode ser difícil quando uma cânula relativamente grande é necessária, pois pode obscurecer a visão do pesquisador. Limjunyawong et al.8 abordaram essa preocupação com um método de intubação no qual uma pequena incisão cutânea é feita ao longo da linha média do pescoço ventral permitindo a visualização da traqueia. Após o procedimento, a incisão é fechada com adesivo de tecido.
Para estudos que requerem intubações repetidas frequentes, a incisamento e o fechamento sucessivos deste local exigem debridamento das margens da pele e trauma tecidual no pescoço ventral. O objetivo da abordagem transcutânea de visualização traqueal para a intubação oral é fornecer uma técnica refinada e não invasiva especificamente adequada para estudos repetidos de intubação, bem como eventos de intubação única em camundongos.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todas as atividades de animais aqui descritas foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio e foram conduzidas em instalações credenciadas pela AAALAC.
1. Preparação do procedimento
- Construa a plataforma de entubação. Para alcançar a inclinação da plataforma apropriada, utilize um aglutinante de 3,6 cm (três polegadas). Dobre um comprimento de 15-20 cm de seda 3-0 ou outro material de rosca ao meio e adere as extremidades da rosca ao topo da plataforma inclinada com fita para criar um laço de suspensão(Figura 1).
- Selecione uma cânula do tamanho e comprimento apropriados.
NOTA: Para um mouse de 20-30 g, pode ser usado um cateter de 1-1,5 polegadas (2,5-3,8 cm) de comprimento até 18 G. Para este estudo, foram utilizados ratos BALB/c femininos de 18 semanas e C57BL/6 de 10 semanas (n = 3 de cada cepa). Uma bainha de cateter branco opaco fornece a melhor visualização transcutânea. - Corte um bisel na ponta distal do cateter e suavize a superfície de corte com papel abrasivo para criar uma ponta de bisel arredondada. Crie suavemente uma leve curvatura na cânula a aproximadamente 1 cm do bisel(Figura 2).
NOTA: Um novo cateter deve ser usado para cada rato. - Anestesiar o rato com cetamina (5,4 mg/g de peso corporal) e xilazina (16 μg/g de peso corporal) administrado intraperitonealmente. Aplique pomada oftalmológica estéril nos olhos.
NOTA: A profundidade anestéstica adequada é alcançada pela falta de resposta do mouse a uma pitada firme do dedo do dedo. - Suspenda o mouse em posição supina na plataforma de intubação, ligando os incisivos superiores ao redor do fio de seda na parte superior da superfície angular(Figura 3). Uma vez que o mouse esteja posicionado diretamente na recumbência dorsal, segure suavemente a base da cauda e retraia a cauda em direção à mesa. Coloque um pedaço de fita sobre a base da cauda para fixar o mouse.
- Aplique creme depilatório(Tabela de Materiais)na região cervical ventral por 30-45 s e, em seguida, remova todo o creme depilatório da região cervical usando uma gaze seca. Repita o processo de aplicação, se necessário. Enxágüe completamente a pele com água salina ou destilada para remover qualquer resíduo e depois enxugue.
2. Procedimento de intubação
- Use fórceps retas e planas na mão não dominante para retrair suavemente a língua de uma maneira que abra suficientemente a boca para a introdução da cânula.
NOTA: Os fórceps de dente de rato não devem ser usados, pois isso danificará a língua. - Com a mão dominante, avance a cânula para a boca de tal forma que a extremidade que é distal para a curva leve é contra o teto da boca do sujeito.
- Solte a língua e deslize a borda plana dos fórceps fechados ao longo do pescoço ventral até que o manúbrio seja atingido. Este movimento desloca lateralmente as glândulas salivares e achata o músculo que cobre a traqueia. A traqueia aparece transcutâneamente como uma linha branca (Figura 3A). Se necessário, gire os fórceps em uma direção craniodorsal, mantendo a tensão na pele em uma direção caudal para fazer com que as glândulas salivares deslocadas lateralmente aumentem. Esta manobra cria mais contraste em torno da traqueia (Figura 3B).
NOTA: Evite força excessiva no pescoço ventral, pois pode colapsar a traqueia e prejudicar a respiração. - Avance a cânula enquanto simultaneamente aconesto a ponta distal da cânula ventralmente pela supinação da mão dominante com flexão simultânea do pulso.
- A colocação adequada da cânula é indicada pela visualização da cânula opaca na traquéia (Figura 4B,D). Se a cânula foi avançada além do nível de origem do músculo masseter e a visualização da cânula na traqueia não foi confirmada, retraia a cânula e tente novamente a manobra.
- Confirme a colocação adequada da cânula conectando uma lâmpada de inflação pulmonar à cânula e observando a expansão torácica com a depressão simultânea do dispositivo.
- Sem deslocar a cânula, desengaque cuidadosamente os incisivos do mouse da plataforma de intubação. Mova o mouse para uma plataforma horizontal(Tabela de Materiais)e insira a cânula no adaptador no ventilador. Após a inflação profunda, ventile o mouse para 60 s e, em seguida, meça a resistência respiratória.
3. Recuperação
- Uma vez que o procedimento esteja concluído, mova o mouse para uma plataforma aquecida. Forneça estimulação constante através de pinças de dedo do dedo leve ou cauda para incentivar a respiração espontânea.
- A extubação pode ocorrer quando o rato começa a mastigar. Segure a cânula ao nível do cubo e puxe suavemente o tubo cranialmente e afaste-se do mouse até que a cânula seja completamente removida da boca do sujeito.
NOTA: É preferível fornecer suporte das vias aéreas com a cânula rígida pelo maior tempo possível durante o processo de recuperação. - Uma vez extubado, transfira o rato para uma gaiola de recuperação limpa com suporte térmico. Monitore continuamente o mouse até que esteja totalmente ambulatorial e a recuperação esteja completa.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Monitoramento serial da função pulmonar da linha de base
As fêmeas balb/c de dez semanas e os camundongos C57BL/6 de 10 semanas (n = 3 de cada cepa) foram entubados utilizando o método descrito nos dias 0, 3, 10 e 17. Após a intubação em cada dia, o sujeito foi conectado a um ventilador mecânico fornecido com 100% de oxigênio (Tabela de Materiais). A resistência respiratória (Rrs) foi medida utilizando-se a técnica de oscilação forçada para 60 s após uma inflação profunda de 25 cm H
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A intubação utilizando a técnica de visualização traqueal transcutânea oferece uma abordagem refinada ao método padrão de incisão cutânea. Com atenção especial a vários passos-chave, a intubação pode ser facilmente e rapidamente alcançada. O animal deve ser colocado diretamente em recumbência dorsal na plataforma de intubação com o rato preso em retração suave. Isso estenderá o animal para o alinhamento vertical e o posicionamento adequado para a intubação. Além disso, o creme depilatório não deve permanecer em contato c...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph e Lindsey Ferguson por sua assistência técnica e ao Laboratório Universitário recursos animais por seu apoio aos cuidados com animais. Este trabalho é financiado por NIH T35OD010977 e R01-HL102469.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cateter intravenoso de 18 G x 1 1/4", Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cânula para intubação |
| 70% de etanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cânula |
| de limpeza Papel abrasivo (lixa) | Porter-Cable | 74001201 | Preparação da cânula |
| Injeção AnaSed (solução estéril de xilazina) (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | |
| Fita de rotulagem Anesthesia Blue (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restrição na plataforma de intubação |
| Sutura de seda trançada sem agulha, não estéril, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Plataforma de intubação |
| Almofada Isotérmica | Deltaphase Braintree Scientific | 39DP | Mouse termorregulação e recuperação |
| Operação Deltaphase Placa | Braintree Scientific | 39OP | Recuperação de rato (antes da extubação) |
| Água destilada | ThermoFisher | 15230253 | Limpeza de rato após depilação |
| Tesoura ocular, angular, afiada/afiada | Harvard Apparatus | 72-8437 | Preparação da cânula |
| FlexiVent (Módulo FX 2) | Scireq | N/A | Registre os dados da função pulmonar (não é necessário realizar o procedimento, usado neste estudo para validar o procedimento) |
| Esponjas de gaze | Fisher scientific | 13-761-52 | Depilação |
| Heavy-Duty 3 "3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Plataforma de intubação |
| Instat Software | Graphpad N | / A | Software de análise estatística |
| Seringa de insulina (0,5 cc, U100) | Fisher Administração de | de 329461 | |
| Injeção de cetamina HCl, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratórios | Lista nº 4871 | Anestesia |
| Bulbo de insuflação pulmonar | Aparelho Harvard | 72-9083 | Confirme a colocação da cânula |
| Microfórceps, curva, lisa | Aparelho Harvard | 72-0445 | Retraia a língua e crie tensão no pescoço para visualização |
| da cânulaNair (loção depilatória), frasco de 9 onças | Church & Dwight | 42010440 | Depilação |
| Solução salina estéril (0,9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anestesia, limpeza da pele após a depilação |
Referências
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179(1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107(2013).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
