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Artigo de método

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

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⸱

DOI:

10.3791/60848

⸱

30 de janeiro de 2020

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.

Resumo

Clamídia trachomatis é um patógeno intracelular obrigatório que tem sido historicamente difícil de manipular geneticamente. O progresso definitivo na elucidação dos mecanismos que C. trachomatis usa para criar e manter um nicho intracelular privilegiado tem sido limitado devido à falta de ferramentas genéticas. Felizmente, recentemente houve vários novos avanços nas técnicas de manipulação genética. Entre elas está o desenvolvimento da mutagênese de troca acetélica relatada por fluorescência (FRAEM). Este método permite exclusão genética direcionada juntamente com a inserção de uma resistência a antibióticos de codificação de de seleção e proteína fluorescente verde (GFP). A dependência dessa estratégia pode ser complicada quando se mira genes dentro de operões policistronicos devido ao potencial de efeitos polares em genes a jusante. A troca de acetélica de floxed (FLAEM), o protocolo para o qual está descrito aqui, foi desenvolvido para aliviar os efeitos polares induzidos por. FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção após exclusão direcionada por troca de algélico. As cepas resultantes contêm exclusões genéticas sem marcadores de uma ou mais sequências de codificação. Essa técnica facilita a avaliação direta da função genética e amplia o repertório de ferramentas para manipulação genética em C. trachomatis.

Introdução

A clamídia trachomatis é a principal causa de doenças sexualmente transmissíveis bacterianas e representa um fardo significativo para a saúde humana. Mais de 100 milhões de pessoas são infectadas todos os anos com C. trachomatis1. Aproximadamente 70% das infecções em mulheres são assintomáticas apesar dos efeitos prejudiciais à saúde reprodutiva, como doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e/ou infertilidade. As sequelas da doença estão diretamente relacionadas à imunopatologia iniciada pela infecção por C. trachomatis 2. Uma vacina eficaz ainda não foi desenvolvida; portanto, compreender a função de fatores de virulência bacteriana e outros produtos genéticos bacterianos é uma questão de pesquisa importante e urgente.

Como bactérias intracelulares, invasão celular hospedeira, replicação intracelular, liberação de descendência e evasão de respostas imunológicas hospedeiras são processos críticos. C. trachomatis forma uma membrana parasitophorous vinculada ao vacuole, denominada inclusão, para o desenvolvimento intracelular. O estabelecimento da inclusão e muitos outros processos críticos são alcançados por secreção de proteínas effectoras por meio de um sistema de secreção tipo III (T3SS)3. Elucidar as funções desses efetivadores secretos foi limitado por muitos anos devido à intração genética de C. trachomatis. Ao contrário de E. coli,muitas técnicas clássicas de clonagem não são aplicáveis à Clamídia. Algumas grandes limitações envolvem eficiência de transformação, falta de repórteres de contrasseleção, como sacb e manutenção plasmática. Enquanto os plasmídeos E. coli geralmente podem ser mantidos indefinidamente com origem de replicação e pressão seletiva adequada, os plasmídeos C. trachomatis exigem mais oito quadros de leitura abertos (pgp1-8) para manutenção que são encontrados no plasmídeo pL2 nativo dentro do L2 serovar4.

Nos últimos anos, foram geradas múltiplas ferramentas genéticas que acomodam a biologia única da Clamídia, mas ainda há limitações5,6,7. A mutação química pelo tratamento metanosulfona (EMS) pode introduzir mutações missenses, ou (menos frequentemente) pode resultar em transições de nucleotídeos introduzindo um codon parada prematuro para produzir uma mutação sem sentido8. A inserção transposon é eficiente para a interrupção genética, mas a tecnologia atual na pesquisa da Clamídia é trabalhosa edemorada 9. Tanto o tratamento ems quanto as técnicas de mutagênese transposon geram mutações aleatórias e exigem métodos rigorosos de triagem para isolar as cepas mutantes. Um método para interromper genes por inserção de intronas do grupo II (por exemplo, TargeTron) permite a mutação gênese dirigida; no entanto, este método é limitado pela eficiência, e o local de inserção nem sempre é devidamente previsto10.

A mutagênese de troca acetélica relatada pela fluorescência (FRAEM) é uma estratégia usada para exclusão genética direcionada, juntamente com a inserção de um de seleção que proporciona resistência a antibióticos e um repórter de fluorescência11. No entanto, o FRAEM é complicado pelo potencial de efeitos polares induzidos por em genes a jusante, especialmente quando visam genes dentro de operões policistronicos. A troca de acetélica de floxed (FLAEM) é uma nova abordagem genética desenvolvida para aliviar os efeitos polares induzidos por anteriormente observados com o de seleção FRAEM12. FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção e restaurar a expressão de genes a jusante. O de seleção contendo resistência a antibióticos e proteína fluorescente verde (GFP) é reprojetado com locais de loxP flancos. Esses locais loxP podem se recombinar na presença de Cre recombinase e resultar em excisão do do genoma13. Esta estratégia tem sido demonstrada para aliviar os efeitos polares induzidos ao mirar tmeA para exclusão12,14.

Tanto os métodos FRAEM quanto flaem utilizam o mesmo vetor suicida, pSUmC 4.0, que pode ser mantido condicionalmente através da expressão induutível de pgp6. A expressão do pgp6 já se mostrou necessária para a retenção plasmática e, portanto, é aproveitada para controlar a manutenção plasmática11,15. Quando C. trachomatis é cultivado na mídia complementada com tetraciclina anidra (aTc) para induzir a expressão pgp6, o vetor é mantido. Na ausência de aTc, o vetor está perdido. A exclusão genética direcionada é alcançada através da troca alelica do gene para a de seleção. As regiões de 3 kb diretamente rio acima e rio abaixo do gene alvo servem como braços de homologia para recombinação. Estes braços são clonados no vetor pSUmC 4.0 flanqueando o de seleção. Eventos bem-sucedidos de transformação e recombinação de C. trachomatis são observados através de relatórios de fluorescência. Expressão de mCherry na espinha dorsal vetorial e gfp dentro do de seleção produz inclusões fluorescentes vermelhas e verdes. Uma vez que o ATc é removido da mídia cultural, as inclusões somente verdes indicam eventos de recombinação bem-sucedidos com a perda do vetor suicida e a integração do de seleção no genoma bacteriano.

FlaEM representa uma extensão do FRAEM através da transformação subsequente de um vetor crerecombinase expresso, pSU-Cre, na recém-criada cepa mutante. A recombinação cre facilita a recombinação entre sites loxP e excisão do de seleção. Eventos de recombinação são indicados através de relatórios de fluorescência. O vetor pSU-Cre codifica mCherry; assim, a transformação bem sucedida é indicada pela adição de fluorescência vermelha ao GFP-expressando inclusões. O cultivo na ausência de pressão seletiva para o resulta em recombinação mediada por Cre nos locais do loxP, e a perda do é indicada por inclusões somente vermelhas. Assim como no pSUmC-4.0, a expressão induutível do pgp6 é usada para manter condicionalmente o pSU-Cre. Uma vez que a seleção de aTc e antibióticos são removidos, o plasmídeo é curado, e a cepa de exclusão sem marcadores resultante é não fluorescente. Este método aborda a questão dos efeitos polares induzidos por.

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Protocolo

1. Design e Montagem do pSUmC-4.0 com Homology Arms Específico para o Gene of Interest

  1. Identifique as regiões de ~3 kb diretamente rio acima e a jusante do gene destinado à exclusão para servir como os braços homologia de 5' e 3' para recombinação homologous (Figura 1).
  2. Design pcR primers to 1) amplificar o braço de homologia de 3 kb 5' do DNA genômico cromadial e 2) conter uma saliência específica de 15-30 bp específica para pSUmC-4.0 quando digerida no site da enzima de restrição Sall. Certifique-se de que as regiões de primer sobrepostas com pSUmC-4.0 tenham temperaturas de derretimento de 55 °C e que as temperaturas de derretimento do grampo de cabelo para toda a cartilha sejam <35 °C.
  3. Design pcR primers to 1) amplificar o braço de homologia de 3 kb 3' do DNA genômico cromadial e 2) conter uma saliência específica de 15-30 bp específica para pSUmC-4.0 quando digerida no site da enzima de restrição SbfI. Certifique-se de que as regiões de primer sobrepostas com pSUmC-4.0 tenham temperaturas de derretimento de 55 °C e que as temperaturas de derretimento do grampo de cabelo para toda a cartilha sejam <35 °C.
  4. Projete primers de triagem PCR que amplificarão a inserção de cada braço de homologia no vetor pSUmC-4.0 após uma reação de montagem de DNA16. Projete esses primers para anneal ~500 bp fora dos locais de restrição para permitir uma fácil visualização de um produto PCR mesmo que a inserção tenha sido mal sucedida(Figura 1).
  5. Amplificar os braços de homologia de 3 kb 5' e 3' do DNA genômico cromodial recém-extraído pela PCR em uma a duas reações para produzir fragmento suficiente para montagem de DNA posterior. Siga o protocolo do fabricante de polimerase de DNA para configuração específica de reação e condições de ciclismo.
  6. Verifique se ambos os produtos PCR são do tamanho correto e que as reações não contêm nenhuma faixa contaminante. Execute 5 μL de cada reação pcr em um gel de agarose de DNA de 1%.
  7. Purificar e concentrar os fragmentos de PCR por extração fenol/clorofórmio e precipitação de etanol.
    1. Pool todas as reações pcr de 3' juntos em um tubo de 1,5 mL e trazer para um volume final de 200 μL com H2O. Sem nuca Repetir este processo para as reações pcr de 5'.
    2. Adicione 200 μL de fenol a cada tubo e vórtice para 30-60 s. Gire cada tubo em um microcentrífuga a >21.000 x g por 20 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Transfira a camada superior de fase aquosa de cada tubo para um novo tubo de 1,5 mL, adicione um décimo do volume de acetato de sódio de 3 M a cada tubo e, em seguida, passe para misturar.
    4. Adicione 3 volumes de 100% de etanol a cada tubo e filme para misturar. Incubar ambos os tubos a -80 °C por 20 min.
    5. Pellet o DNA girando cada tubo em >21.000 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
    6. Lave a pelota de DNA com 100 μL de 70 % de etanol. Gire cada tubo em >21.000 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
    7. Lave a pelota de DNA novamente com 100 μL de 100% de etanol. Gire cada tubo em >21.000 por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
    8. Deixe a pelota totalmente seca, depois resuspenda suavemente o DNA em 12 μL de H2O sem nuclease, flicking para misturar.
  8. Digerir 500 ng de vetor pSUmC-4.0 em uma reação de 20 μL com 1 unidade de Sall e 1 unidade de SbfI de acordo com o protocolo da fabricação. Incubar a reação por aproximadamente 3 h ou durante a noite para garantir a digestão completa do vetor.
  9. Purificar e concentrar a espinha dorsal digerida por extração fenol/clorofórmio e precipitação de etanol como descrito anteriormente (passo 1.7.1-1.7.9).
  10. Combine o vetor pSUmC-4.0 digerido e os produtos PCR de braço de homologia de 5' e 3' juntos em uma proporção de 0,01 pmol pSUmC-4.0 a 0,09 pmol cada braço de homologia. Monte os fragmentos em uma reação de montagem de DNA de acordo com o protocolo da fabricação.
  11. Transforme 50 μL de E. coli eletrocompetente com 1 μL da reação de montagem de DNA. Plaquere a e. coli transformada em placas de agar LB contendo espectinomicina de 100 μg/mL, espalhando 150 μL por placa. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
  12. No dia seguinte, colônias de tela para fluorescência verde e vermelha usando um microscópio invertido de epifluorescência. Um total de 5-30 colônias por placa ágar é esperado.
  13. Escolha 5-10 colônias para inocular 4 mL de caldo LB complementado com 100 μg/mL spectinomicin. Incubar culturas a 37 °C durante a noite com tremor a 250 rpm.
  14. Usando as culturas E. coli durante a noite, realize a purificação de DNA em pequena escala. Elute o DNA com 50 μL de H2O sem nuplocação.
  15. Confirme a inserção de cada braço de homologia no vetor pSUmC-4.0 usando os primers de triagem PCR (projetados na etapa 1.4) para amplificar cada inserção. Se a montagem de DNA for bem sucedida, um produto PCR de ~4 kb deve ser observado em um gel de agarose de DNA de 1% para as regiões do braço de 5' e 3'. Um produto PCR de ~1 kb indica falta de inserção.
    NOTA: Se a inserção dos braços de homologia não for bem sucedida em uma reação de montagem de fragmento duplo, realize duas reações de montagem para inserir o braço de 5', em seguida, 3', individualmente. Digerir o vetor apenas com Sall antes de montar com o braço de 5', em seguida, digerir o vetor com SbfI para montar o braço de 3'.
  16. Transforme a barragem-/dcm- competente E. coli com 200 ng de pSUmc-4.0 montada com ambos os braços homologia. Coloque as bactérias transformadas em placas de agar LB contendo espectinomicina de 100 μg/mL espalhando 25 μL por placa. Incubar as placas a 37 °C durante a noite. Um total de 20-200 colônias são esperadas.
  17. Tela as placas para colônias fluorescentes vermelhas e verdes como descrito na etapa 1.13.
  18. Criar uma cultura para uma purificação de DNA em larga escala inoculando 100 mL de caldo LB contendo 100 μg/mL espectinomicina com colônias vermelhas e verdes. Incubar a cultura a 37 °C durante a noite com tremor a 250 rpm.
  19. Colher a cultura e purificar o DNA usando uma purificação de DNA em larga escala.
    1. Resuspender o DNA plasmídeo purificado em 100 μL de NF-H2O. Um rendimento total de DNA de pelo menos 2 μg/μL é ideal para a transformação de C. trachomatis.
    2. Sequencie as regiões do braço homologia de 5' e 3' para garantir o conjunto correto no pSUmC-4.0 antes de transformar C. trachomatis.

2. Transformação de C. trachomatis com pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion by Allelic Exchange

  1. Células McCoy de sementes, fibroblastos de camundongos normalmente usados para cultivar Clamídia,em duas 6 placas de poço (1 x 106 células/bem) com mídia de crescimento #1. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2 até que o monocamada seja confluente (aproximadamente 24 h).
  2. Em um tubo de 1,5 mL, adicione um volume de corpos elementares C. trachomatis WT sorovar L2 (EBs) que é suficiente para infectar 12 poços de uma placa de 6 poços em um MOI de 2. Pelotas os EBs em >20.000 x g por 30 min, em seguida, descartar o supernatant.
  3. Inicie a transformação clamídia resuspendendo suavemente os EBs em 600 μL de tampão CaCl2 e, em seguida, adicione 24 μg de armas pSUmC-4.0 + homologia ao tubo. Misture suavemente a solução flicking. Incubar o tubo no RTpor 30 min e mexa para misturar a cada 10 min.
  4. Adicione a solução de transformação a 24 mL da solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) e misture suavemente. Transfira 2 mL do inóculo para cada poço de células McCoy confluentes nas 6 placas de poço e infecte por centrífuga a 900 x g por 1 h a 20 °C.
  5. Remova o inóculo e substitua por 2 mL/well rpmI mídia de crescimento #2. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2.
  6. Após um mínimo de 7h, mas não mais do que 12h, substitua a mídia por 2 mL/poço de mídia de seleção #1. Continue a incubação a 37 °C por 48 h a partir do momento da infecção.
  7. Colher e passar as bactérias para uma nova monocamada de células McCoy.
    1. Usando um raspador de celular, raspe suavemente a monocamada McCoy para levantar as células para a mídia. Transfira o material de cada poço para um tubo de 2 mL. Pelotas o material celular em >20.000 x g em um microcentrífuga por 30 min a 4 °C.
    2. Remova e descarte o supernatante. Resuspender a pelota de célula em 1 mL de HBSS, canalizando suavemente.
    3. Pelotas os detritos da célula a 200 x g por 5 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um poço fresco de células McCoy confluentes. Adicione um 1 mL adicional de HBSS a cada poço para um volume total de 2 mL/well.
    4. Infecte por centrífuga ção a 900 x g por 1 h a 20 °C. Substitua o inóculo por mídia de seleção #1 imediatamente após a infecção.
  8. Continue repassando as bactérias para uma monocamada fresca de células McCoy (seção 2.7) a cada 48 h para três ou mais passagens até que as inclusões vermelhas e verdes sejam detectadas usando um microscópio invertido de epifluorescência 24 h pós-infecção (24 hpi).
  9. Uma vez detectadas inclusões vermelhas e verdes, continue passeando o monocamada (seção 2.7) usando #2 de mídia de seleção.
  10. Continue passeando o monocamada até que as inclusões somente verdes sejam detectadas 24 hpi (passagem #3 ou posterior), o que indica a perda do vetor pSUmC-4.0 e a incorporação do de seleção loxP no genoma.
  11. Escolha um poço de inclusões somente verdes para enriquecer passeando. Colher e congelar quaisquer outros poços que também contenham inclusões somente verdes no tampão de sucrose-fosfato-glutamato (SPG).
    1. Para enriquecer as inclusões somente verdes, passe a monocamada de um poço de 6 pratos de poço como feito na etapa 2.7, mas depois de pelotas os detritos celulares (passo 2.7.3), transfira o supernatant para um cônico com 12 mL de HBSS. Use este inóculo para infectar duas 6 placas de poço adicionando 2 mL por poço, em seguida, gire as placas a 900 x g por 60 min a 20 °C.
    2. Para congelar poços adicionais, colher o monocamada como na etapa 2.7.1, mas resuspender as pelotas em 1 mL de SPG em vez de HBSS. Desmonte os detritos celulares (passo 2.7.3) e transfira o supernatant para um criotubo de 1,5 mL. Congele o material a -80 °C.
  12. Depois de enriquecer as inclusões somente verdes para um MOI de 0,5-1.0 (uma a duas passagens após a detecção), colher as monocamadas em SPG como descrito na etapa 2.11.2. Obtenha alíquotas de 50 μL em tubos de 1,5 mL e congele a -80 °C.
  13. Bactérias somente verdes titer para determinar a inclusão, formando unidades/μL, de acordo com um protocolo padrão de titulação17.

3. Isolamento clonal do mutante de exclusão c. trachomatis somente verde contendo o de seleção ladeado loxP limitando diluição

  1. Sementes uma placa de cultura de tecido de 384 poços com 50 μL de células McCoy em ~2.000 células/bem em mídia de crescimento #1. Incuba-se a 37 °C com 5 % de CO2 para ~24h ou até confluente.
  2. Diluir uma alíquota de bactérias somente verdes no HBSS para alcançar ~50 EBs por 20 mL. Transfira o inóculo diluído para uma bandeja de reservatório.
    1. Remova a mídia da placa de poço 384, enfiando firmemente a placa inteira de cabeça para baixo em um recipiente de lixo. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de C. trachomatis inoculum a cada poço. Infecte por centrífuga ção a 900 x g por 1 h a 20 °C.
      NOTA: Tenha cuidado para não mexer tão forte que o monocamada se desprende. Se as células forem sobre-confluentes, elas se desprenderão mais facilmente.
  3. Remova o inóculo mexendo e substitua por 50 μL/well growth media #2. Placas incubadas a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: Nesta fase, a integração do de seleção ao genoma é estável, de modo que a seleção de antibióticos com espectinomicina não é mais necessária.
  4. Depois de incubar a placa por 5 a 12 dias, identifique poços individuais com inclusões fluorescentes verdes usando um microscópio invertido de epifluorescência ou uma plataforma de triagem de alto conteúdo.
  5. Colher poços com inclusões somente verdes raspando a monocamada com uma ponta p-10 e transferindo todo o conteúdo do poço para um tubo contendo 2 mL de HBSS. Misture suavemente e aplique o 2 mL de inóculo a um monocamada McCoy de confluente fresco em uma placa de 6 poços para infecção.
    NOTA: Ao identificar poços individuais com inclusões, as inclusões estarão em um cluster devido à expansão da inclusão inicial. Se um poço tem vários clusters, é provável que mais de um EB inicialmente infectou tão bem. Esses poços não devem ser colhidos, e em alguns casos, várias rodadas de isolamento clonal por diluição serial podem ser necessárias.
  6. Infecte a placa de 6 poços por centrífuga a 900 x g por 1h a 20 °C. Substitua o inóculo por 2 mL/well growth media #2. Incubar a 37 °C com 5 % de CO2 para 48 h.
  7. Repita as etapas 2.11-2.13 para enriquecer, congelar e congelar populações clonais.
  8. Confirme a exclusão de genes direcionados de C. trachomatis clonamente isolados usando qPCR como descrito anteriormente12.

4. Transformação de C. trachomatis FRAEM Mutante com pSU-Cre para iniciar remoção de de seleção ladeada loxP

  1. Repita o processo de transformação em uma placa de 6 poços como descrito anteriormente (passos 2.1-2.8) usando o mutante C. trachomatis FRAEM isolado clonalmente, vetor pSU-Cre e mídia de seleção #3.
    NOTA: Uma transformação bem sucedida é indicada por inclusões vermelhas e verdes fluorescentes.
    1. Passagem do monocamada até que sejam detectadas inclusões somente vermelhas por meio de um microscópio invertido de epifluorescência, o que indica perda do de seleção (duas a três passagens). Continue passeando a monocamada até que as inclusões somente vermelhas sejam enriquecidas a um MOI de ~0,5.
  2. Isolam clonalmente as inclusões somente vermelhas limitando a diluição em uma placa de 384 poços, como descrito anteriormente (passos 3.1-3.8); no entanto, use a mídia de seleção #3 para todas as etapas.
  3. Enriqueça populações clonais passeando até um MOI de 0,1. Uma vez enriquecido, substitua a mídia de seção por mídia de crescimento #2 para iniciar a perda do vetor pSU-Cre (aproximadamente três a quatro passagens).
  4. Clonalmente isolar bactérias não fluorescentes (passos 3.1-3.8); no entanto, digitalizado manualmente a placa com um microscópio de campo brilhante para detectar inclusões. Enriquecer e congelar bactérias (passo 2.11-2,12).
  5. Tela para a cepa mutante usando PCR quantitativo em tempo real, manchas ocidentais e sequenciamento de DNA de genoma inteiro como descrito anteriormente12.

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Resultados

O método de exclusão de genes sem marcadores em C. trachomatis usando FLAEM depende de técnicas cuidadosas de clonagem e transformação. A recombinação acetélica bem sucedida é um primeiro passo essencial e requer a identificação e inserção de braços de homologia no vetor de clonagem pSUmC-4.0(Figura 1). Um segundo passo essencial para a exclusão genética sem marcadores é a remoção do repórter de fluorescência e de seleção de antibióticos pela edição do genoma Cre-lox, representada n...

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Discussão

O protocolo descrito aqui para a geração de exclusões genéticas sem marcadores em C. trachomatis pela FLAEM permite a exclusão direcionada de genes não essenciais e elimina efeitos polares induzidos por. O protocolo conta com um design cuidadoso de braços homologia de 5' e 3' inseridos no vetor suicida pSUmC 4.0, transformação eficiente de C. trachomatis e triagem cuidadosa de cepas mutantes isoladas. A engenharia de genomas bem sucedida através deste método resulta em bactérias que não são fluorescente...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho contou com o apoio de bolsas do Serviço Público de Saúde do Instituto Nacional de Saúde, NIAID (subsídios A1065530 e Al124649), para campos k.a.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseKSE ScientificBMK-A1705
Cloridrato de AnhidrotetraciclinaACROS Organics233131000
CaCl2 Tampão10 mM Tris pH 7,4, 50 mM Cloreto de cálcio di-hidratado
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigmaC7902-500GAdequado para cultura
de célulasCicloheximidaSigma7698-1G
dam-/dcm- Competente E. coliNew England BioLabsC2925H
DMSOATCC4-Xtestado para cultura de células filtradas estéreis Sigma
G8415-100Gde ácido L-glutâmico
#1Meio RPMI 1640 suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS).
Meio de crescimento #2RPMI 1640 suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1 µ g / mL de cicloheximida
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS) (1x) Gibco24020-117
Soro bovino fetal inativado por calor qualificado One Shot (FBS)GibcoA38402-02
McCoy CellsATCCCRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BioLabsT1010SPurificação
de DNA em pequena escalaNaH2PO4SigmaS3139-250GFosfato de sódio monobásico
Na2HPO4SigmaS5136-500GFosfato de sódio dibásico
NEB 10-beta Eletrocompetente E. coli CélulasNew England BioLabsC3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Kit de clonagemNovo Inglaterra BioLabsE5520SKit de montagem Gibson
Penicilina G sal de sódioSigmaP3032-10MUBiorreagente adequado para cultura de células
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162Purificação de DNA em larga escala
Q5 Hot Start DNA polimerase de alta fidelidadeNew England BioLabsM0515Fragment PCR Polimerase
RPMI 1640 Médio (1x)Gibco11875-093Contendo 2mM L-glutamina
Sall-HFNew England BioLabsR3138S
Sbfl-HFNew England BioLabsR3642S
Selection Media #1RMPI 10% FBS, 1 µ g/mL de cicloheximida, 500 µ g/mL de espectinomicina e 50 ng/mL de tetraciclina anidra dissolvida em
Meio de Seleção DMSO #2RMPI 10% FBS, 1 µ g/mL de cicloheximida, 500 µ g/mL de espectinomicina
Meio de Seleção #3RPMI 10% FBS, 1 µ g/mL de cicloheximida, 50 ng/mL de aTc e 0,6 µ g/mL de solução
tampão de acetato de sódioSigmaS7899-100ML3M
SOC Meio de crescimentoNew England BioLabsB9020SVIAL
dicloridrato de espectinomicina pentahidratado, grau de cultura celularAlfa AesarJ61820
SacaroseSigmaS1888-1KGBiorreagente adequado para cultura
de célulasTampão sacarose-fosfato-glutamato (SPG)37,5 g de sacarose, 1,25 g de Na2< / sub>HPO4< / sub>, 0,18 g de NaH < sub>2< / sub>PO4< / sub>, 0,36 ácido glutâmico para 500 ml de água de grau de cultura de tecidos
TrisAMRESCO0497-5KG
Tripsina-EDTA de grau ultrapuro (1x)Gibco25200-0560,25%
ÁguaSigmaW3500-500MLFiltrado estéril, BioReagente, Adequado para cultura de células
de grau de biologia molecular Ácido glutâmico Meio de crescimento de penicilina

Referências

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