Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

Abstract

A formação do complexo eIF4F tem se mostrado o nó fundamental a jusante para a convergência de vias de sinalização que muitas vezes sofrem ativação oncogênica em humanos. O eIF4F é um complexo de vinculação de tampas envolvido na fase de recrutamento mRNA-ribossomo de iniciação de tradução. Em muitos modelos celulares e pré-clínicos de cânceres, a desregulamentação do eIF4F leva ao aumento da tradução de subconjuntos específicos de mRNA que estão envolvidos na proliferação e sobrevivência do câncer. eIF4F é um complexo hetero-trimérico construído a partir da subunidade de ligação de tampa eIF4E, do eIF4A helicase e da subunidade de andaimes eIF4G. Fundamental para a montagem de complexos eIF4F ativos é a interação proteína-proteína entre proteínas eIF4E e eIF4G. Neste artigo, descrevemos um protocolo para medir o conjunto eIF4F que monitora o status da interação eIF4E-eIF4G em células vivas. O ensaio de interação proteína-proteína baseado em células eIF4e:4G também permite que as alterações induzidas por medicamentos na integridade complexa eIF4F sejam avaliadas com precisão e confiabilidade. Prevemos que este método possa ser aplicado para verificar a atividade de compostos disponíveis comercialmente ou para uma triagem adicional de novos compostos ou modalidades que interrompam eficientemente a formação do complexo eIF4F.

Introduction

O controle da expressão genética desempenha um papel fundamental na correta execução de programas celulares, como a proliferação do crescimento e a diferenciação. Um mecanismo de controle regulatório pode ser exercido tanto no nível da transcrição genética quanto no nível da tradução mRNA. Na última década, tornou-se cada vez mais evidente que o controle translacional pela modulação do processo de iniciação em vez das etapas posteriores de alongamento e término pode regular finamente a síntese de subconjuntos específicos de proteínas que desempenham uma ampla gama de funções biológicas.

O aumento da tradução das mRNAs envolvidas na sobreviv....

Protocol

A linha celular HEK293 foi utilizada para o protocolo e foi cultivada no Medium De Águia Modificada de Dulbecco, suplementada com soro bovino fetal de 10%, 2 mM L-glutamina e 100 penicilina/estreptomicina U/mL. As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO₂ em um ambiente umidificado.

1. Avaliação quantitativa da interrupção do complexo eIF4F via ensaio de complementação eIF4E:eIF4G^604-646

1. Ensaio de complementação de cultura celular e transfecção transitória de eIF4E:eIF4G^604-646 ensaio de complementação
   1. Use células recém-descongeladas com menos de 20 passagens para todos os experimentos....

Results

Para validar a sensibilidade do sistema de complementação eIF4E:eIF4G^604-646, a inibição mediada de 4EBP1 do conjunto complexo eIF4F foi avaliada por meio de inibidores mTOR. Ao inibir a fosforilação dependente mTORC1 quinase da família de proteínas 4EBP, a inibição do mTOR aumenta a associação 4EBP1 para eIF4E e, portanto, a desmontagem eIF4F¹⁵. Duas classes de inibidores mecanicamente diferentes de quinases mTOR foram testadas: rapalogs (por exemplo, R.......

Discussion

O método descrito neste artigo utiliza um ensaio de complementação baseado em luciferase para monitorar quantitativamente o conjunto complexo eIF4F através da medição direta da interação eIF4G-eIF4E em células vivas. Fornecemos detalhes para o uso do sistema de complementação eIF4E-eIF4G e também mostramos que o sistema é extremamente preciso na medição da dissociação mediada por medicamentos 4EBP1 da interação eIF4E-eIF4G¹⁶. Para facilitar o throughput deste ensaio, a configuração experimental de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células de 293FT	Thermo Fisher Scientific	R70007
Microplaca de cultura de células 96 poços, greiner F-Bottom	bio-one	655083
Título de células Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Leitor Multilabel	PerkinElmer	não aplicável Finnpipette
F2 Pipetas Multicanal 12 canais 30-300 ml	Thermo Fisher Pipetas	Scientific 4662070
Finnpipette F2 12 canais 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, sem vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	11058021
agitador orbital	Eppendorf	não appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S