Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

Resumo

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir fotogeração in vivo comutável de espécies reativas endógenas de oxigênio (ROS) em pele de camundongos. Essa produção transitória de ERO in situ ativa eficientemente a proliferação celular em nichos de células-tronco e estimula a regeneração tecidual, fortemente manifestada através da aceleração dos processos de cicatrização de queimaduras e crescimento de folículos pilosos. O protocolo é baseado em um tratamento fotodinâmico regulável que trata o tecido com precursores do fotossensibilizador endógeno protoporfirina IX e irradia o tecido com luz vermelha sob parâmetros físico-químicos rigorosamente controlados. De modo geral, este protocolo constitui uma ferramenta experimental interessante para analisar a biologia das EROs.

Introdução

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são o resultado da redução química do oxigênio molecular para formar água, e incluem o oxigênio singlete, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxila ^1,2,3. As ROS têm uma vida útil muito curta devido à sua natureza extremamente química reativa. Em organismos aeróbios, as ERO são formadas incidentalmente no interior das células como um importante subproduto da respiração aeróbica (cadeia de transporte de elétrons) nas mitocôndrias. O acúmulo transitório de altos níveis de ERO na célula resulta em uma condição de e....

Protocolo

Todos os procedimentos de criação e experimentação de camundongos devem ser conduzidos em conformidade com a legislação local, nacional, internacional e diretrizes sobre experimentação animal.

1. Indução do crescimento de pelos, indução de queimaduras e identificação de LRCs de BrdU a longo prazo no epitélio da pele da cauda íntegra

NOTA: Utilizar camundongos C57BL/6 com 10 dias ou 7 semanas de idade, preferencialmente ninhadas, para os planejamentos experimentais descritos abaixo. Em todos os procedimentos experimentais, os animais serão anestesiados por inalação de isoflurano a 3% ou eutanasiados por luxação cerv....

Resultados

A administração tópica do precursor mALA na pele do dorso e da cauda de camundongos resulta em acúmulo significativo de PpIX em todo o tecido e, visivelmente, no folículo piloso, como demonstrado pela fluorescência vermelho-rósea desse composto sob excitação à luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). A irradiação subsequente do tecido tratado com luz vermelha (636 nm) a uma fluência de 2,5−4 J/^cm2 promove a produção transitória de ERO no tecido, particularmente na região .......

Discussão

Aqui, apresentamos uma metodologia que permite uma ativação transitória da produção endógena de ERO in vivo em pele de camundongo com efeitos fisiológicos. A metodologia baseia-se em um procedimento fotodinâmico para induzir uma estimulação local e controlada do fotossensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Esta abordagem experimental é uma ferramenta interessante para estudar a biologia de ROS em sistemas experimentais in vivo, constituindo um avanço significativo sobre metodologias que ut.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2′,7′-Diclorofluorescina diacetato	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-desoxiuridina	Sigma	Aldrich B5002-500MG
Anti-Bromodeoxiuridina-Fluoresceína	Roche	11202693001
Creme depilatório (por exemplo, Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
Sistema de imagem in vivo, por exemplo, IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA na forma de creme tópico, por exemplo, METVIX Crema 160 mg/g	Medidor de energia Galderma
Power (por exemplo, ThorLabs Modelo PM100D)ThorLabs
Fonte de luz vermelha, por exemplo, lâmpada LED Aktilite de 636 nm	Photocure ASA