Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

Resumo

Aqui, fornecemos protocolos para realizar três ensaios simples de degeneração de axôntoinduzidos induzidos por lesões (morte de axônto) em Drosophila melanogaster para avaliar a preservação morfológica e funcional de axôntos cortados e suas sinapses.

Resumo

A degeneração do axon é uma característica compartilhada em doenças neurodegenerativas e quando os sistemas nervosos são desafiados por forças mecânicas ou químicas. No entanto, nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à degeneração do axôno permanece limitada. A degeneração do axôno induzido por lesões serve como um modelo simples para estudar como os axôns decepados executam sua própria desmontagem (morte de axôono). Nos últimos anos, uma cascata evolutivamente conservada de sinais de morte de axônto foi identificada de moscas para mamíferos, o que é necessário para que o axôono separado se degenere após lesão. Por outro lado, a sinalização de morte axônea atenuada resulta na preservação morfológica e funcional de axôntos cortados e suas sinapses. Aqui, apresentamos três protocolos simples e recentemente desenvolvidos que permitem a observação da morfologia axonal, ou função axonal e sináptica de axônios cortados que foram cortados do corpo celular neuronal, na mosca frutífera Drosophila. A morfologia pode ser observada na asa, onde uma lesão parcial resulta na morte do axônio lado a lado de axônios de controle ilesos dentro do mesmo feixe nervoso. Alternativamente, a morfologia axonal também pode ser observada no cérebro, onde todo o feixe nervoso sofre morte de axônio desencadeada pela ablação antenal. A preservação funcional de axônse decepados e suas sinapses podem ser avaliadas por uma abordagem optogenética simples, juntamente com um comportamento de preparação pós-sináptica. Apresentamos exemplos usando uma mutação de perda de função de alta tensão e por dnmnatsuperexpressor, ambos capazes de retardar a morte do axônio por semanas a meses. É importante ressaltar que esses protocolos podem ser utilizados além da lesão; facilitam a caracterização de fatores de manutenção neuronal, transporte axonal e mitocôndrias axonais.

Introdução

A integridade morfológica dos neurônios é essencial para a função sustentada do sistema nervoso ao longo da vida. A grande maioria do volume neuronal é tomada por axôns^1,2; assim, a manutenção ao longo da vida de axônios particularmente longos é um grande desafio biológico e bioenergético para o sistema nervoso. Vários mecanismos de apoio axonal-intrínseco e glial-extrínseco foram identificados, garantindo a sobrevivência axonal ao longo da vida. Sua deficiência resulta na degeneração do axôxio³, que é uma característica comum dos sistemas nervosos sendo desafiados em doenças, e por forças mecânicas ou químicas^4,5. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes da degeneração do axôon permanecem mal compreendidos em qualquer contexto, tornando o desenvolvimento de tratamentos eficazes para bloquear a perda de axôno desafiador. O desenvolvimento de terapias eficazes contra essas condições neurológicas é importante, pois criam um enorme fardo em nossa sociedade⁶.

A degeneração do axôno induzido por lesões serve como um modelo simples para estudar como axôns decepados executam sua própria desmontagem. Descoberto e nomeado em homenagem a Augustus Waller em 1850, a degeneração walleriana (WD) é um termo guarda-chuva que compreende dois processos distintos e molecularmente separáveis⁷. Primeiro, após a lesão axonal, os axôntos separados de seus corpos celulares executam ativamente sua própria autodestruição (morte de axôon) através de uma cascata de sinais de morte de axôno conservada mente conservada dentro de um dia após a lesão⁸. Em segundo lugar, a glia circundante e os phagocitas especializados se envolvem e limpam os detritos axonais resultantes dentro de três a cinco dias. A atenuação da sinalização de morte do axôrio resulta em axôns decepados que permanecem preservados durante as semanas^9,10,11,12, enquanto a atenuação do engolfamento glial culmina em detritos axonais que persistem por semanas in vivo^13,14,15.

Pesquisas em moscas, ratos, ratos e zebrafish revelaram vários mediadores evolutivamente conservados e essenciais da sinalização de morte de axôno⁸. Mutantes da morte de Axon contêm axôntos e sinapses decepadas que não conseguem sofrer a morte de axôno; permanecem morfologicamente e funcionalmente preservados por semanas, na ausência de suporte celular^{99,10,,12,,13,,16,,17,,18,,19,,20,,21,,22,,23}. A descoberta e caracterização desses mediadores levou à definição de um caminho molecular executando a morte do axôno. É importante ressaltar que a sinalização de morte de axôno é ativada não apenas quando o axôon é cortado, esmagado ou esticado^24,25; também parece ser um contribuinte em modelos animais distintos de condições neurológicas (por exemplo, onde os axôns se degeneram de forma independente de lesões⁴, mas com uma gama de desfechos benéficos^4,8). Portanto, entender como a morte do axôno executa a degeneração do axôno após lesão pode oferecer insights além de um modelo de lesão simples; também poderia fornecer metas para a intervenção terapêutica.

A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster (Drosophila) provou ser um sistema inestimável para a sinalização da morte do axôno. A pesquisa na mosca revelou quatro genes essenciais da morte do axônio conservado evolutivamente: highwire (hiw)^11,14, dnmnat^12,26, dsarm¹⁰ e axundead (axundead( axed)¹². A modificação desses mediadores - mutações de perda de função de hiw, dsarm e axed, e a superexpressão do dnmnat - bloqueia potentemente a morte do axônio para o tempo de vida da mosca. Enquanto axôns selvagens decepados sofrem morte de axônto dentro de 1 dia, axôns decepados e suas sinapses sem hiw, dsarm ou machado permanecem não apenas morfologicamente, mas também funcionalmente preservados por semanas. Resta determinar se a preservação funcional também pode ser alcançada através de altos níveis de dnmnat.

Aqui, apresentaremos três protocolos simples e recentemente desenvolvidos para estudar a morte do axônio (por exemplo, a morfologia e a função dos axônios cortados e suas sinapses ao longo do tempo) na ausência de suporte corporal celular. Demonstramos como a morte atenuada do axônio resulta em axônios cortados que são morfologicamente preservados com uma mutação de perda de função de hiw (hiw^⁄N) e como a morte atenuada do axônio resulta em axônios e sinapses cortadas que permanecem funcionalmente preservados por pelo menos 7 dias com superexpressão de dnmnat (dnmnat^OE). Esses protocolos permitem a observação da morfologia axonal e sináptica individual no sistema nervoso central ou periférico (CNS e PNS, respectivamente)^13,14, enquanto a preservação funcional de axônios cortados e suas sinapses no CNS pode ser visualizada pelo uso de uma configuração optogenética simples combinada com a preparação como leitura comportamental¹².

Protocolo

1. Observação da Morfologia de Axon durante a morte de Axon na PNS

1. Lesão na asa: lesão parcial de feixes de axôno
   1. Use 5 fêmeas virgens e 5 machos do genótipo direito(Figura 4A,Geração P₀₎ para realizar cruzes à temperatura ambiente (RT). Passe P₀ em novos frascos a cada 3-4 dias. Colete a prole adulta recém-fechada (geração_{F 1)} diariamente e vede-as por 7-14 dias.
   2. Anestesiar voa em almofadas de CO_2. Use micro tesouras para cortar a veia da asa anterior aproximadamente no meio da asa(Figura 1A). Use uma asa para a lesão e a outra como um controle não lesionado. Aplique uma lesão por asa e certifique-se de obter asas suficientes feridas (aproximadamente 15 asas).
      NOTA: A asa inteira pode ser cortada, mas é suficiente para cortar apenas a veia anterior da asa. Esta é a parte mais forte da asa.
   3. Recupere as moscas em frascos que contenham alimentos.
2. Dissecção de asa e visualização de axôns
   1. Espalhe 10 μL de óleo de halocarboneto 27 com uma pipeta ao longo de um slide de vidro inteiro(Figura 1B).
   2. Corte a ferida, bem como, a asa de controle ilesa nos pontos de tempo desejados (por exemplo, 1 ou 7 dias após a lesão). Use uma micro tesoura para cortar, e pinças para pegar a asa. Monte 4 asas máximas em óleo de halocarboneto 27(Figura 1B)e cubra-as com um slide de cobertura.
   3. Imagem da asa imediatamente usando um microscópio de disco giratório. Adquira uma série de seções ópticas ao longo do eixo z com tamanho de passo de 0,33 μm e comprima as pilhas z em um único arquivo para análises subseqüentes.
      NOTA: Não agarre a veia da asa anterior onde os corpos celulares e os axônses estão alojados. Pegue a asa no centro. O tecido nas asas não é fixo; manter o tempo de montagem de asas para imagens estes 8 min.

Figura 1: Observação da morfologia do axônio durante a morte do axônio na asa. (A) Asa de mosca esquemática com dois neurônios sensoriais pouco rotulados por GFP, que também são indicados separadamente abaixo. O local da lesão e o campo de observação são indicados. (B) Configuração esquemmática para imagens de asa. As asas de controle feridas e ilesas (cinza) são montadas em óleo de halocarboneto 27 (vermelho) em um slide de vidro (azul claro) e cobertas com um slide de cobertura (preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Observação da Morfologia de Axônio e Sinapse Durante a Morte de Axon no CNS

1. Ablação antenal: lesão de pacotes de axôno inteiro
   1. Use 5 fêmeas virgens e 5 machos do genótipo direito(Figura 5A, geração P₀₎ para realizar cruzes no RT. Pass P₀ em novos frascos a cada 3-4 dias. Colete prole adulta recém-fechada (geração_{F 1)} diariamente e deixe-os envelhecer por 7 até 14 dias.
   2. Anestesiar voa em almofadas de CO_2. Use pinças para abturar o segmento de antenas 3^rd direito para ablação unilateral; ou ambos os segmentos de antenas^3ª esquerda e direita para ablação bilateral(Figura 2A-C). Isso removerá os corpos de células neuronais rotulados pelo GFP, enquanto suas projeções axonais permanecem no CNS.
      NOTA: A ablação de antenas parte todo o feixe de axôon. Se a ablação unilateral for realizada, o feixe de axôono no lado contralateral (a antena unablated) serve como controle interno. Certifique-se de realizar ablações antenas suficientes (aproximadamente 15 animais).
   3. Recupere as moscas em frascos que contenham alimentos.
2. Dissecção cerebral e visualização de axôns
   1. Misture a base de elastômero de silicone (9 mL) e o agente de cura (1 mL) em uma razão de volume de 10:1. Transfira cada mistura de 5 mL para uma placa de cultura de tecido de 35 mm e reduza o ar introduzido misturando-se com agitação suave na coifa durante a noite. A mistura se solidifica dentro de 24 h.
      NOTA: As placas de dissecção devem ser preparadas apenas uma vez e podem ser usadas várias vezes.
   2. Aanestesia voa em almofadas de CO₂ e decapita cabeças adultas usando duas pinças nos pontos de tempo desejados (por exemplo, 1 ou 7 dias após a ablação da antena). Use uma pinça para agarrar o pescoço, e a outra pinça para consertar o tórax. Puxe suavemente o pescoço e a cabeça para fora do tórax.
      NOTA: Deixe as cabeças decapitadas no bloco de CO₂ até que o número desejado seja alcançado, mas certifique-se de prosseguir para o próximo passo dentro de 30 minutos.
   3. Transfira todas as cabeças para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de solução de fixação contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e 0,1% Triton X-100 em solução de solução tamponada de fosfato (PBS) utilizando pinças que foram mergulhadas na solução de fixação.
      NOTA: Cabeças de mosca grudam bem em pinças molhadas. Torna viável transferir todas as cabeças prontamente para o tubo de microcentrífuga.
   4. Fixar as cabeças por 20 min com agitação suave em RT. Coloque o tubo de microcentrífuga no gelo, as cabeças gravitarão até o fundo do tubo de microcentrífuga. Remova o sobrenadante com uma pipeta e repita este procedimento com cinco lavagens de 2 minutos com 1 mL de tampão de lavagem contendo 0,1% Triton X-100 em PBS com agitação suave no RT, para remover a solução de fixação residual.
      NOTA: Vídeos sobre como dissecar cérebros drosophila adultos estão prontamente disponíveis²⁷.
   5. Transfira as cabeças com uma pipeta de vidro para uma placa de dissecção cheia de tampão de lavagem. Use uma pinça para agarrar e puxar o proboscis da cabeça, enquanto segura a cabeça com a outra pinça. Isso deixará um buraco onde o proboscis foi anexado ao exoesqueleto.
   6. Use duas pinças para remover o exoesqueleto entre o buraco e cada olho composto. Isso tornará viável abrir a estrutura da cabeça com as duas pinças, e riscar suavemente o cérebro dentro.
   7. Limpe cada cérebro removendo traqueia ou gordura presa a ele(Figura 2D, superior). Uma vez que o cérebro é limpo, coloque-o em um novo tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de tampão de lavagem no gelo.
      NOTA: Os lóbulos ópticos danificados ou perdidos não afetarão o lóbulo olfativo no centro do cérebro(Figura 2D,superior).
   8. Substitua o tampão de lavagem por 1 mL de solução de fixação uma vez que todos os cérebros sejam coletados e acumulados na parte inferior do tubo de microcentrífuga. Fix cérebros por 10 min com balanço em RT, seguido por cinco lavagens de 2 minutos em 1 mL de tampão de lavagem com balanço em RT.
   9. Aplique anticorpos primários (1:500) no tampão de lavagem durante a noite com balanço a 4 °C, seguido por 10 lavagens acima de 2h usando 1 mL de tampão de lavagem com balanço em RT.
   10. Aplique anticorpos secundários (1:500) no tampão de lavagem 2h com balanço em RT e enrole o tubo de microcentrífuga em papel alumínio para bloquear a luz. Mantenha o tubo de microcentrifugação coberto com papel alumínio durante o resto do procedimento. Aplique dez lavagens com 1 mL de tampão de lavagem acima de 2h com balanço em RT.
   11. Remova o sobrenadante e use uma única gota de reagente antifade para cobrir o cérebro no tubo de microcentrífuga. Incubar cérebros por pelo menos 30 min a 4 °C antes de prepará-los para montagem e imagem.
   12. Prepare um slide de capa, coloque fita de laboratório nele e corte uma forma "T" da fita(Figura 2D,parte inferior). O espaço resultante serve como área onde o reagente antifade²⁸ contendo cérebro será entubado, de preferência em ambas as câmaras.
       NOTA: Use uma ponta de pipeta de 20-200 μL onde 3 mm da ponta foi cortada para ampliar a abertura da pipeta. Isso tornará viável a pipeta do reagente antifade contendo cérebro. Cubra cuidadosamente o cérebro com um slide de cobertura.
   13. Use argila para preparar dois pequenos rolos uniformes. Certifique-se de que os rolos de argila não são mais altos do que a altura de um escorregador de vidro. Coloque os rolos de argila no escorregador de vidro(Figura 2D,inferior). Coloque o sanduíche de lâmina de cobertura contendo cérebro nos rolos de argila.
       NOTA: Axônse rotulados com GFP e suas sinapses estão localizados na frente do cérebro. É, portanto, mais fácil imaginá-los pela frente. No entanto, os cérebros vão se levantar, ou para baixo no sanduíche de slides de cobertura. Os rolos de argila servem como suportes de sanduíche, e durante a imagem, o sanduíche pode ser virado de cabeça para baixo. Isso tornará viável adquirir imagens da frente de cada cérebro.
   14. Adquira uma série de seções ópticas ao longo do eixo z com tamanho de passo de 1,0 μm usando um microscópio confocal, e comprima as pilhas z em um único arquivo para análises subseqüentes, para avaliar o número de projeções axonais permanecendo intactas.

Figura 2: Observação da morfologia de axônio e sinapse durante a morte do axônio no cérebro. (A)Visão lateral de uma cabeça de mosca esquemática com corpos celulares rotulados por GFP, axônse e sinapses. (B) Visão frontal de alta ampliação dos neurônios receptores olfativos rotulados pelo GPF e seus axôntos e sinapses. Os corpos celulares estão alojados no segmento de antenas^3, e seus axôns projetam-se no CNS. Axôlogos formam sinapses em um glomerulus no lobo olfativo esquerdo, cruzam a linha média e formam sinapses no glomerulus no lobo olfativo contralateral. (C) Exemplos de cabeças de mosca com ablação antena unilateral. Controle não ferido. Meio: Ablação do segmento de antenas^3. Inferior: Ablação do^segmento antena 2 (e, portanto, também^3º). (D)Preparação cerebral. Topo: Cérebro de mosca dissecado esquemático com lóbulos olfativos indicados e projeções axonais no campo de visão. Inferior: Configuração esquemática para imagem cerebral. Dois rolos de argila (verde) são montados em um escorregador de vidro (azul claro), eles carregam um sanduíche de slides de cobertura, que contém cérebros de mosca (cinza). Os cérebros são montados em reagente antifade (roxo), cercado por uma fita de laboratório (laranja), e coberto por dois slides de cobertura (preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação induzida pela Optogenética como leitura para função Axon e Sinapse

1. Configuração optogenética
   1. Faça o experimento optogenético em uma sala escura. Certifique-se de que a configuração consiste em um holofote LED infravermelho de 850 nm (IR) para iluminar moscas no escuro(Figura 3A),um holofote LED vermelho de 660 nm piscando para ativar neurônios que expressam CsChrimson, e uma câmera monocromática com um filtro longpass de 700 nm, que impede o registro de flashes de luz vermelha.
   2. Use uma impressora 3D para gerar uma pequena câmara de comportamento circular com um diâmetro de 1 cm, cubra-a com um slide de cobertura e coloque um emissor de 860 nm acoplado ao holofote LED vermelho ao lado da câmara(Figura 3B).
      NOTA: O emissor indica quando o holofote LED vermelho está ligado, ativando assim os neurônios.
   3. Monte os holofotes de LED e a câmera na parte superior da câmara(Figura 3A, C).
   4. Ative os neurônios em flashes de 10 Hz durante 10 s. A duração da ativação pode ser ajustada de acordo com o projeto experimental.
2. Preparando moscas para optogenética
   1. Derreta comida de mosca no microondas. Após o alimento esfriar, antes da solidificação, adicione 1:100 de 20 mM toda a trans-retina em etanol (EtOH) a uma concentração final de 200 μM. Misture bem, e despeje o alimento imediatamente em frascos vazios.
      NOTA: Evite adicionar toda a retina trans a alimentos quentes, isso pode resultar em optogenética menos eficiente.
   2. Cubra frascos contendo alimentos solidificados com plugues ou bolas de algodão. Enrole frascos com papel alumínio. Em seguida, armazene os frascos que contenham alimentos em uma sala escura e fria.
   3. Use 5 fêmeas virgens e 5 machos(Figura 6A, geração P₀) do genótipo direito para realizar cruzes no RT. Pass P₀ em novos frascos a cada 3-4 dias. Colete progênese adulto recém-fechado (geração F₁) em uma base diária e deixe-os envelhecer por 7 até 14 dias em frascos cobertos de alumínio contendo 200 μM toda a trans-retina em alimentos para moscas.
   4. Coletar moscas batendo-as de frascos contendo alimentos em um frasco vazio sem comida. Esfrie o frasco em água contendo gelo por aproximadamente 30 s. Moscas vão dormir. Coloque moscas individuais rapidamente em pequenas câmaras cobertas com um slide de cobertura(Figura 3B).
      NOTA: Assim que as moscas se aquecem, elas acordam. É crucial espalhar rapidamente moscas individuais em câmaras individuais cada uma. Evite as almofadas de CO₂ para anestesiar moscas, isso afetará seu comportamento.
   5. Realize optogenética para provocar o preparo das antenas. Aqui, o protocolo consiste nos seguintes intervalos: 30 s onde a luz vermelha está ausente, seguido por 10 s de exposição à luz vermelha a 10 Hz. Repita este procedimento três vezes no total, seguido por um intervalo adicional de 30 s onde a luz vermelha está ausente^12,29,30.
      NOTA: Este protocolo pode ser ajustado de acordo com a preferência experimental.
   6. Coletar moscas individuais de cada câmara em almofadas de CO_2. Submeta-os a ferimentos na antena. Absolte tanto os segmentos^de antenaesquerda esquerda quanto a direita(Figura 2C). Isso removerá os corpos celulares dos neurônios do órgão de Johnston (JO), enquanto as projeções axonais permanecem no CNS. Recupere as moscas em frascos cobertos de alumínio contendo 200 μM toda a transretina.
      NOTA: Para o preparo das antenas induzida pela optogenética, os corpos das células sensoriais dos neurônios estão alojados no segmento de antenas 2^(Figura 2C).
   7. Em pontos de tempo correspondentes (por exemplo, 7 dias após a ablação da antena), sujeito voa para outro ensaio de preparação (voltar para o passo 3.2.4).

Figura 3: Configuração optogenética para induzir o preparo como uma leitura para a função axôno e sinapse. (A) Ilustração dos componentes montados necessários para a optogenética. Destaque de LED infravermelho (IR), câmera e holofote led vermelho (da esquerda para a direita, respectivamente). Os componentes, incluindo uma descrição detalhada, estão listados na Tabela de Materiais. (B) Ilustração de uma câmara de comportamento, incluindo um emissor de IR, para indicar ativação de holofotes led vermelhos. (C) Ilustração de uma única configuração de montagem. Um total de três configurações de montagem são necessárias para os dois holofotes led e a câmera, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Acima, descrevemos três métodos para estudar a morfologia e a função dos axônios cortados e suas sinapses. O primeiro método permite a observação em alta resolução de axônios individuais na PNS. Requer clones gerados pela técnica MARCM^14,31. Aqui, realizamos cruzamentos para gerar clones de MARCM mutantes de tipo selvagem e highwire (Figura 4A). Um simples corte no meio da asa induz a lesão de axôno de neurônios abrigados distais (por exemplo, no lado externo da asa), enquanto os neurônios proximais (por exemplo, entre o local de corte e o tórax) permanecem ilesos. Esta abordagem torna viável observar a morte do axôrio lado a lado dos axôns de controle ilesos no mesmo feixe nervoso(Figura 1A, Figura 4B). Aqui, usamos um fundo genético resultando em baixo número de clones rotulados por GFP (por exemplo, dois em cada experimento¹⁴). Apresentamos exemplos de 1 e 7 dias após a lesão de axôns do tipo selvagem, para fornecer exemplos de axôns de controle, axôonos submetidos à morte de axônto, e fragmentos axonais sendo limpos por glia circundante, respectivamente. Além disso, repetimos lesão axonal em mutantes highwire onde analisamos o resultado 7 dias após a lesão.

As asas de controle não feridas abrigam dois clones do tipo selvagem, portanto dois axôns selvagens rotulados por GFP(Figura 4B,tipo selvagem, controle ileso). Um dia depois de cortar o meio da asa pelo uso de micro tesouras, a morte do axôono é induzida em axôns rotulados por GFP onde os corpos celulares são distais para o local de corte, enquanto os axôns de corpos celulares proximamente alojados servem como um controle interno dentro do mesmo feixe nervoso(Figura 4B, tipo selvagem, 1 dia após a lesão). Note os detritos axonais na parte superior indicados pela seta. 7 dias após a lesão axonal, os detritos axonais rotulados por GFP são limpos por glia circundante, enquanto os axônons de controle não feridos permanecem no feixe nervoso(Figura 4B,tipo selvagem, 7 dias após a lesão, seta). Em contraste, os axôns mutantes de arame alto que foram cortados por 7 dias permanecem morfologicamente preservados, consistentes com os achados anteriores^11,14 (Figura 4B, highwire, 7 dias após a lesão, seta). Estes resultados demonstram a poderosa resolução visual da ala Drosophila. A morte de Axon pode ser observada lado a lado de controles ilesos no mesmo feixe nervoso. Enquanto os axôns do tipo selvagem sofrem morte de axônto dentro de 1 dia após a lesão e os destroços resultantes são limpos dentro de 7 dias, os mutantes deficientes da morte do axônto permanecem morfologicamente preservados por 7 dias.

Figura 4: Abordagem para estudar a morte de axôno de axôntos sensoriais rotulados por GFP na asa. (A) Cruzes esquemáticas para gerar clones de tipo selvagem e highwire na asa (geração P₀ e F_1, respectivamente). Fêmeas virgens estão à esquerda, machos à direita. Consulte A Tabela de Materiais para obter detalhes do genótipo. (B) Exemplos de controles e axôns com etiqueta gfp lesados. O campo de visão é indicado naFigura 1A. Da esquerda para a direita: axôns de controle do tipo selvagem ilesos, axôns do tipo selvagem 1 dia após a lesão, axôns selvagens 7 dias após a lesão, axôns mutantes highwire 7 dias após a lesão, respectivamente. As setas indicam axôns decepados, barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O segundo método descreve como visualizar pacotes de axôntos inteiros projetando-se no CNS onde formam sinapses, que pertencem a neurônios alojados em antenas esquerda e direita(Figura 2A-C). Aqui, realizamos cruzamentos para gerar clones de MARCM mutantes de tipo selvagem e highwire (Figura 5A). Não feridos, axôntos rotulados por GFP e suas sinapses podem ser visualizados ao longo de dias a semanas, na ausência de lesões(Figura 5B, Tipo selvagem, controle ileso). Alternativamente, os animais podem ser submetidos à ablação do segmento de antenas^3, e axôns com etiqueta gfp cortadas e suas sinapses podem ser observadas durante um curso de tempo durante horas a dias. Nós nos concentramos em 7 dias após a ablação antenal, porque neste momento, axônses e suas sinapses foram submetidas à morte de axôon, e os destroços resultantes são limpos pela glia circundante. Se a ablação unilateral da antena direita for realizada, então o feixe de axôon direito é cortado e desmontar-se e os detritos resultantes são totalmente limpos 7 dias após a lesão (Figura 5B, tipo selvagem, ablação unilateral, 7 dias após a lesão, setas), consistente com os achados anteriores¹³. Alternativamente, tanto as antenas direita quanto a esquerda podem ser abladas, que cortarão ambos os feixes de axôon, e 7 dias após a lesão, os axôntos e suas sinapses desapareceram (Figura 5B, tipo selvagem, ablação bilateral, 7 dias após a lesão, seta). Em contraste, a ablação unilateral das antenas direitas em mutantes de arame alto resulta em axôns decepados que permanecem preservados 7 dias após a lesão, consistente com os achados anteriores^11,14 (Figura 5B, highwire,ablação unilateral, 7 dias após a lesão, seta). Estes resultados demonstram que axôns de tipo selvagem decepados sofrem morte de axôno e os detritos resultantes são limpos dentro de 7 dias, enquanto os mutantes deficientes da morte do axônto não conseguem sofrer morte de axôone e permanecem morfologicamente preservados por 7 dias.

Figura 5: Abordagem para estudar a morte de axôno de axôns sensoriais rotulados pelo GFP no cérebro. (A) Cruzes esquemmáticas para gerar clones de tipo selvagem e highwire no cérebro (Geração P₀ e F_1, respectivamente). Fêmeas virgens estão à esquerda, machos à direita. Consulte A Tabela de Materiais para obter detalhes do genótipo. (B) Exemplos de controles e axôns com etiqueta gfp lesados. Da esquerda para a direita: controles de tipo selvagem ilesos, tipo selvagem 7 dias após ablação antena unilateral, tipo selvagem 7 dias após ablação antena bilateral, e mutantes highwire 7 dias após ablação antena unilateral, respectivamente. As setas indicam feixes de axônim decepados, barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O terceiro método permite a observação da preservação funcional de axôns cortados e suas sinapses no CNS. Ele se baseia na manipulação de um subconjunto de neurônios JO alojados no^segmento de antenas 2 que são suficientes para induzir o preparo das antenas. A expressão de uma channelrhodopsin a vermelha (CsChrimson) nos neurônios JO, combinada com a suplementação dietética de toda a trans-retina, é suficiente para provocar um simples comportamento de preparação pós-sináptica sobre a exposição à luz vermelha^12,30. Aqui, realizamos cruzes para gerar neurônios JO do tipo selvagem, e neurônios JO super-expressantes(dnmnat^OE)(Figura 6A). dnmnat O tipo selvagem voa ou voa contendo neurônios JO com morte atenuada de axônio(dnmnat^OE),ambos abrigam um comportamento potente de preparação antes da lesão. No entanto, 7 dias após a lesão (por exemplo, ablação bilateral do^2º segmento antenal), o aliciamento não pode ser provocado pela optogenética em moscas do tipo selvagem devido à degeneração induzida por lesões e sinapse, enquanto animais com morte atenuada de axôno continuam a se preparar (Figura 6B, Filme 1,2). A morte atenuada do axônto é, portanto, capaz de preservar funcionalmente axôns decepados e suas sinapses por 7 dias.

Figura 6: Abordagem para visualizar função axonal e sináptica após a xotomia. (A) Cruzes esquemáticas para gerar neurônios sensoriais JO de tipo selvagem e dnmnat superexpressantes (P₀ e F₁ geração, respectivamente). Fêmeas virgens estão à esquerda, machos à direita. Consulte A Tabela de Materiais para obter detalhes do genótipo. (B) Etogramas individuais de comportamento de aliciamento induzidos pela optogenética. Topo: etogramas individuais do tipo selvagem voam antes e 7 dias após a lesão (azul). Inferior: etogramas individuais de moscas superexpressas dnmnat (dnmnat^OE) em neurônios JO antes e 7 dias após a lesão (vermelho). Cada caixa indica pelo menos 1 comportamento de limpeza dentro de 1 s. A linha preta indica a soma de todas as lixeiras. (C)Quantificação do comportamento de aliciamento. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão, p > 0,001 (ANOVA unidirecional, comparação múltipla com o teste pós-hoc de Tukey). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Comportamento representativo de aliciamento selvagem provocado pela optogenética antes e 7 dias após a ablação antenal. Clique aqui para baixar este vídeo.

Filme 2: Comportamento representativo de aliciamento provocado pela optogenética em moscas superexpressando dnmnat em neurônios JO antes e 7 dias após a ablação antenal. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

Os protocolos aqui descritos permitem a observação robusta e reprodutível da morfologia, bem como a função dos axônios e suas sinapses separadas de seus corpos celulares em Drosophila. O ensaio da asa facilita a observação da morte do axônio lado a lado dos axônios de controle ilesos no PNS¹⁴, enquanto o ensaio antenal facilita a observação de feixes nervosos inteiros de axônios rotulados por GFP e suas sinapses, para avaliar tanto a morfologia quanto a função no cérebro (CNS)¹². Existem etapas críticas e certas vantagens para cada abordagem para estudar a morfologia que devem ser levadas em consideração ao projetar experimentos.

Para observar a morfologia do axônio na Asa, os experimentos podem ser prontamente realizados, devido à transparência da asa: permite contornar a dissecção e a imunohistoquímica. No entanto, devido à falta de fixação, as asas devem ser imagemimediatamente após a montagem¹⁴. Atualmente, dois drivers Gal4 distintos são frequentemente usados, seja ok371Gal4 ou dpr1Gal4,e ambas as referências oferecem abordagens distintas para quantificar a degeneração^14,26. Recomenda-se rotular esparsos de alguns neurônios, utilizando-se "Análise de Mosaico com um Marcador Celular Repressível (MARCM)"^14,31, como a resolução da morfologia axonal é sem precedentes. Em contraste, a observação de sinapses não é possível nas asas, elas estão localizadas no cordão nervoso ventral dentro do tórax das moscas. Além disso, marcadores axonais adicionais não podem ser visualizados pela imunohistoquímica: a cutícula cerosa torna impossível a difusão de fixadores e anticorpos no tecido subjacente.

Para observar a morfologia de axônio e sinapse no SNC, é preciso fazer dissecções cerebrais. Eles oferecem a vantagem de visualizar marcadores axonais e sinápticos adicionais pelo uso de imunohistoquímica, e sinapses podem ser observadas ao lado de axôntos no mesmo campo de visão^10,13. Uma grande coleção de receptores olfativos caracterizados (ORN) Gal4 drivers é prontamente disponível³², e freqüentemente, OR22aGal4 é o condutor de escolha. Para ablação de antenas, os corpos celulares dos neurônios OR22a estão alojados no^3º segmento (Figura 2B). Uma quantificação baseada em intensidade de fluorescência é usada para quantificar a degeneração de axônses ou sinapses¹³. Por outro lado, os experimentos são demorados devido à dissecção cerebral e coloração de anticorpos.

Para visualizar a função axonal e sináptica após a axotomia, a optogenética é usada para desencadear o preparo das antenas: serve como uma leitura para a preservação funcional de axôntos cortados e suas sinapses¹². O circuito de preparação e os respectivos pilotos sensoriais, inter e motorizados Gal4 foram descritos completamente^29,30. GMR60E02Gal4 rotula um subconjunto dos neurônios sensoriais do órgão de Johnston (JO), que são necessários e suficientes para o preparo^29,30. Para ablação antenal, os corpos celulares dos neurônios JO estão alojados no^2º segmento de antenas(Figura 2B). Uma configuração optogenética pode ser prontamente construída do zero, ou uma configuração existente ajustada. É importante ressaltar que os experimentos devem ser realizados em uma sala escura, e voa assim visualizados com um holofote LED infravermelho (IR). Ao usar csChrimson como canal, é crucial fornecer ao alimento toda a retina trans e um holofote LED vermelho para ativar os neurônios JO²⁹. Alternativamente, canais sensíveis à luz azul e um holofote LED azul, ou o canal TrpA1 e a temperatura podem ser usados para ativação neuronal^29,33. A quantificação do comportamento de aliciamento já foi descrita^12,29.

Quando esses ensaios são usados para estudar especificamente a morte do axônto, é importante notar que o fenótipo da preservação morfológica ou funcional deve ser robusto ao longo do tempo. Há casos em que a morte do axônto leva a um fenótipo consistente, porém menos pronunciado, na preservação morfológica^34,35, e se tal fenótipo se traduz em preservação funcional continua a ser determinado.

Fenótipos da morte de axôontambém foram observados em neurônios durante o desenvolvimento de larvas de Drosophila, onde os nervos foram esmagados em vez de feridos^11,23. Aqui, focamos especificamente nos neurônios drosophila adultos que completaram o desenvolvimento. Neste contexto, o uso da interferência de RNA³⁶, ou crispr/cas9³⁷ específico do tecido pode ser facilmente implementado. É importante ressaltar que as técnicas acima podem ser utilizadas em um contexto independente da morte do axônio: facilitam a caracterização dos fatores de manutenção neuronal³⁸, transporte axonal³⁹, alterações mitocôndrias axonais dependentes da idade⁴⁰e morfologia das mitocôndrias axonais⁴¹.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinças (alta precisão, ultra finas)	EMS	78520-5	de ablação antenal
(borda de corte de 5 mm)	EMS	72933-04	Lesão na asa
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	30120086.0000
Prato de cultura de tecidos de 35mm	Sarstedt	83.3900
Cover Slips, Espessura 1	Thermo Scientific& comércio;
Lâminas de Microscópio Superfrost	Thermo Scientific™
Câmera CMOS USB 2.0 de Alta Sensibilidade, 1280 x 1024, Obturador Global	Thorlabs	DCC1240M	Configuração da Câmera
Anel de Retenção SM1 para Ø Tubos e Montagens de Lente de 1"	Thorlabs	SM1RR
25mm Lente de montagem C de 1/1.2"	de M112FM25		Tamron
com Roscas Externas M27 x 0.5 e Roscas Internas SM1	Thorlabs	SM1A36
Lente Condensadora Asférica, Ø 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm	Thorlabs	ACL2520U-B
Ø Filtro Longpass Premium de 25,0 mm, Comprimento de Onda Cut-On: 700 nm	Acoplador Thorlabs	FELH0700
SM1 (1.035"-40), Roscas Externas, 0.5" de Comprimento	Tubo de Lente Thorlabs	SM1T2
SM1 Sem Roscas Externas, 1" de Comprimento, Dois Anéis de Retenção Incluídos	Thorlabs	SM1M10
850 nm, 900 mW (Min) LED Montado, 1200 mA	Thorlabs	M850L3	Refletor LED IR
Acoplador SM1 (1.035"-40), Roscas Externas, 0.5" de Comprimento	Tubo de Lente Thorlabs	SM1T2
SM1 Sem Roscas Externas, 2" de Comprimento, Dois Anéis de Retenção Incluídos Lente	Thorlabs	SM1M20
, Ø 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm	Thorlabs	ACL2520U-B
Ø Filtro Longpass Premium de 25,0 mm, Comprimento de Onda Cut-On: 850 nm	Thorlabs	FELH0850
Anel de Retenção SM1 para Ø Tubos e montagens de lente de 1"	Thorlabs	SM1RR
660 nm, LED montado em 940 mW (Min), 1200 mA	Thorlabs	M660L4	Refletor LED vermelho
Lente condensadora asférica, Ø 25 mm, f=20,1 mm, NA=0,60, ARC: 650-1050 nm	Acoplador Thorlabs	ACL2520U-B
SM1 (1,035"-40), Roscas Externas, 0,5" de Comprimento	Tubo de Lente Thorlabs	SM1T2
SM1 Sem Roscas Externas, 2" de Comprimento, Dois Anéis de Retenção Incluídos	Thorlabs	SM1M20
15 V, 2,4 A Unidade de Fonte de Alimentação com Conector Jack de 3,5 mm para Um Cubo K ou T	Thorlabs	KPS101	LED controlador
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current	Thorlabs	LEDD1B
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Placa de Ensaio de Alumínio, Torneiras de Dupla Densidade M6	Thorlabs	MB1530/M	Base de Montagem
Ø Suporte de Poste Universal de 12,7 mm, Parafuso de Travamento com Mola, L = 75 mm	Montagem Thorlabs	UPH75/M	, 3x (LED IR, LED vermelho, came)
Ø Anel deslizante de 1,20" para tubos de lente SM1 e tubos de extensão C-mount, Thorlabs de torneira M4		SM1RC/M
Ø Poste óptico de 12,7 mm, SS, parafuso de fixação M4, macho M6, L = 150 mm	Thorlabs	TR150/M
Ø Poste óptico de 12,7 mm, SS, parafuso de fixação M4, macho M6, grampo	Thorlabs	TR40/M
para Ø Postes de 1/2", 5 mm Hex	Thorlabs	RA90/M
M6 x 1.0 Parafuso de Cabeça de Aço Inoxidável, 16 mm de Comprimento, Pacote de 25	de SH6MS16	Thorlabs	para montagem na base
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O e NI-DAQmx	National Instruments	782604-01 Controlador de	holofote LED vermelho
20k Ohm 1 Gang Potenciômetro de Montagem em Painel	Linear TT Electronics/BI	P230-2EC22BR20K	fintuner para indicador
IR (860nm) emissor, 100 mA radial	Osram	475-1365-ND	indicador de luz vermelha
	-	-	Misc
All-trans retinal	Sigma	R2625
Etanol absoluto	Vwr	20821.296
Óleo Halocarbono 27	Sigma	H8773
Mowiol	Merk	81381
Paraformaldeído	Sigma	F8775
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma	P5493
Sylgard 184 base de elastômero de silicone	Dow Corning Corp	4019862
Sylgard 184 agente de cura de elastômero de silicone	Dow Corning Corp	4019862
Triton X-100	Sigma	T8787
Anticorpos anti-GFP de frango	Rockland	600-901-215	Anticorpos
Goat Dylight anti-Chicken	Abcam	ab96947
FM7a, B	BDSC	RRID:	cromossomo X
FRT19A[hs-neo]	BDSC	RRID:BDSC_1709
hiw[Δ N]	BDSC	RRID:BDSC_51637
hs-FLP[12]	BDSC	RRID:BDSC_1929
tub-Gal80[LL1]	BDSC	RRID:BDSC_5132
w[1118]	BDSC	RRID:BDSC_3605
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus	BDSC	RRID:BDSC_55135	2º cromossomo
5xUAS-Gal4[12B]	Kyoto	RRID:Kyoto_108492
5xUAS-HA::d nmnat	BDSC	RRID:BDSC_39702
5xUAS-mCD8::GFP[LL5]	BDSC	RRID:BDSC_5134
ase-FLP[2d]	Laboratório Freeman	Neukomm et al., 2014 (PNAS)
CyO	BDSC	RRID:
dpr1-Gal4	BDSC	RRID:BDSC_25083
OR22a-Gal4	BDSC	RRID:BDSC_9952
ey-FLP[6]	BDSC	RRID:BDSC_5577	3º cromossomo
GMR60E02-Gal4	BDSC	RRID:BDSC_39250
TM3,Sb,e	BDSC	RRID:BDSC_3644