Dois diferentes paradigmas de preferência em tempo real usando optogenética dentro da área tegmental ventral do mouse

Summary

Aqui apresentamos dois protocolos passo a passo fáceis de colocar paradigmas de preferência usando optogenética em camundongos. Usando essas duas configurações diferentes, comportamentos de preferência e evasão podem ser solidamente avaliados dentro do mesmo aparelho com alta seletividade espacial e temporal, e de forma direta.

Abstract

Entender como a ativação neuronal leva à produção comportamental específica é fundamental para a neurociência moderna. A combinação de optogenética em roedores com testes comportamentais em paradigmas validados permite a medição de consequências comportamentais sobre a estimulação de neurônios distintos em tempo real com alta seletividade espacial e temporal, e assim o estabelecimento de Relações causais entre ativação neuronal e comportamento. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para um paradigma de preferência em tempo real (RT-PP), uma versão modificada do teste de preferência de lugar com condição clássica (CPP). O RT-PP é realizado em um aparelho de três compartimentos e pode ser utilizado para responder se a estimulação optogenética de uma população neuronal específica é gratificante ou aversiva. Descrevemos também uma versão alternativa do protocolo RT-PP, o chamado protocolo de preferência de compartimento neutro (NCP), que pode ser usado para confirmar a aversão. As duas abordagens são baseadas em extensões da metodologia clássica origináriada da farmacologia comportamental e da recente implementação de optogenética dentro do campo da neurociência. Além de medir a preferência do lugar em tempo real, essas configurações também podem dar informações sobre o comportamento condicionado. Fornecemos protocolos passo a passo fáceis de seguir ao lado de exemplos de nossos próprios dados e discutimos aspectos importantes a considerar ao aplicar esses tipos de experimentos.

Introduction

A implementação da optogenética, uma ferramenta experimental moderna de neurociência na qual a luz é usada para controlar a atividade neuronal, nos últimos anos levou a grandes avanços na compreensão de como populações neuronais específicas impactam o comportamento^1,2,3. A excelente seletividade espacial e temporal da optogenética permite o estabelecimento de relações causais entre excitação ou inibição de grupos celulares de interesse e produção comportamental^2,3. A seletividade espacial na optogenética é comumente garantida através do sistema Cre-Lox no qual a atividade de Cre recombinase leva à recombinação de quaisquer sequências de DNA presentes entre os locais de Lox, os chamados alelos floxed (ladeados por locais lox)⁴. O objetivo com o uso do sistema Cre-Lox em optogenética é alcançar a expressão de optogenética sinuosas em neurônios específicos de interesse, deixando os neurônios circundantes desprovidos de expressão. Opsinas são proteínas sensíveis à luz que, após a estimulação de luz de comprimento de onda específico, permitem o fluxo de íons que afeta a excitabilidade neural ou influencia as funções celulares, modulando vias de efeito a jusante. Novas variantes de opsinas que diferem em ação (excitatória, inibidora, modulatória), mecanismo, ativação por comprimento de onda de luz e propriedades cinéticas⁵ estão continuamente sendo desenvolvidas para atender às necessidades de abordagens experimentais específicas. Em relação à excitabilidade, o uso de uma opsina despolarizante ou hiperpolarização dita a atividade dos neurônios (excitação ou inibição, respectivamente) sobre estimulação de luz a um comprimento de onda específico entregue no cérebro³.

A atividade seletiva de promotores direciona a expressão de Cre recombinase aos neurônios de interesse. Ao implementar uma alelo floxed da opsina de interesse, a recombinação mediada por Cre garantirá que a opsina seja expressa seletivamente em neurônios que co-expressam Cre recombinase^3,6. Esse uso de transgênicos duplos para seletividade espacial direta tem se mostrado muito eficiente em optogenética. Assim, enquanto a estimulação de luz para ativar as opsinas é amplamente entregue através de uma fibra óptica intracerebralmente implantada conectada a uma fonte de luz (LED ou laser)³, apenas neurônios expressando tanto Cre recombinase quanto a alleita floxed responderão a essa estimulação. O sistema Cre-Lox em roedores pode ser alcançado de diferentes maneiras usando apenas transgênicos (tanto Cre recombinase quanto a construção de opsina floxed são codificados em animais transgênicos), apenas injeções virais (construções de DNA para Cre recombinase e a opsina floxed são entregues através de um portador viral), ou uma combinação dos dois (por exemplo, A recombinação cre é codificada por um animal transgênico que é injetado com um vírus que carrega a construção de opsina floxed)⁵. A construção de DNA de opsina floxed é geralmente clonada em quadro com um gene repórter para permitir a visualização da recombinação mediada por Cre em seções teciduais. Embora a optogenética também possa ser realizada em ratos, os protocolos apresentados foram gerados para camundongos. Para simplificar, os camundongos que carregam tanto Cre recombinase quanto a opsina floxed serão chamados de "camundongos optogenéticos". Nos protocolos descritos abaixo, camundongos optogenéticos foram gerados por uma abordagem transgênica mista (Cre recombinase controle de dois promotores diferentes) e viral (usando um vírus associado ao adeno, AAV, para fornecer a construção de DNA de opsina floxed - no nosso caso a abordagem ChR2/H134R). A obtenção e manutenção das linhas transgênicas do mouse é uma parte essencial da metodologia. Camundongos transgênicos de opsina de motorista cre e floxed podem ser produzidos para cada fim, ou comprados se disponíveis comercialmente, assim como uma série de vírus carregando sequências de DNA codificando recombinase Cre e opsinas floxed em diferentes formas.

A optogenética aliada aos testes comportamentais provou ser uma ferramenta valiosa para estudar o papel de regiões cerebrais distintas, ou populações neuronais discretas, em determinados tipos de comportamento. No contexto do comportamento relacionado à recompensa, a optogenética permitiu a verificação de achados anteriores nos campos da farmacologia comportamental e da psicologia experimental, e também permitiu um novo nível de dissecção temporalmente relevante sobre como certos neurônios afetam o comportamento. Um método que tem sido usado em vários estudos para avaliar o comportamento relacionado à recompensa é uma versão modificada do método clássico conhecido como Preferência de Lugar Condicionado (CPP). O CPP clássico tem sido usado para avaliar as propriedades gratificantes ou aversivas de drogas de abuso através de sua capacidade de induzir associações pavlovianas com pistas do meio ambiente^7,8. Em termos pavlovianos, a droga é um estímulo incondicionado, uma vez que pode provocar aproximação ou retirada se for gratificante ou aversiva, respectivamente. A combinação contínua da droga com vários estímulos neutros, que por si só não provocam qualquer resposta, pode levar à abordagem ou retirada apenas mediante apresentação do anteriormente neutro, mas após a combinação, os chamados estímulos condicionados ⁹. A análise de CPP geralmente é realizada em um aparelho contendo dois compartimentos do mesmo tamanho, mas onde cada compartimento é definido por características distintas, como textura do piso, padrões de parede e iluminação (estímulos neutros). Os dois compartimentos são conectados por um corredor ou uma abertura entre os compartimentos. Durante o condicionamento, o sujeito, geralmente um pequeno roedor, recebe injeções passivas de uma droga enquanto se restringe a um dos dois compartimentos principais e salina enquanto restrito ao outro compartimento. Os efeitos gratificantes da droga são posteriormente avaliados em uma sessão sem drogas quando o assunto é autorizado a explorar livremente todo o aparelho. A quantidade de tempo gasto no compartimento anteriormente emparelhado (a resposta condicionada) é considerada para refletir os mecanismos de aprendizagem pavloviano mediados entre os efeitos gratificantes da droga e as pistas do compartimento associados à sua administração ( estímuloscondicionados). Se o animal passa mais tempo no compartimento emparelhado com drogas, a droga induziu uma preferência condicionada do lugar, o que significa que tem efeitos gratificantes no comportamento. Por outro lado, se a droga for percebida como aversiva, o animal evitará o compartimento emparelhado com drogas e passará mais tempo no compartimento salino, indicando aversão ao local condicionado (CPA)^8,9,10,11.

Uma vez que a optogenética pode ser implementada para controlar a atividade neuronal em "tempo real", o uso de um paradigma comportamental semelhante, mas distinto, a configuração do CPP permite a medição da preferência do local na ativação neuronal direta. A análise orientada por optogenética da preferência do lugar é, portanto, muitas vezes referida como um paradigma de análise de preferência em tempo real (RT-PP). No paradigma RT-PP, a estimulação optogenética de neurônios distintos através do sistema Cre-Lox substitui a entrega sistêmica de uma droga realizada no CPP clássico, de modo que o paradigma RT-PP, em vez disso, mede se a estimulação neuronal induzida optogeneticamente for percebido como gratificante ou aversivo. A descrição atual se concentrará em camundongos optogenéticos, mas também ratos optogenéticos podem ser testados usando protocolos semelhantes.

Em vez de condicionar-se a um compartimento de cada vez como no paradigma clássico do CPP, o mouse optogenético no paradigma RT-PP é permitido mover-se livremente em todo o aparelho e o comportamento é registrado ao longo da sessão. A entrada em um dos compartimentos é emparelhada com estimulação de luz intracraniana. parâmetros apropriados de estimulação de luz, os neurônios que expressam uma opsina excitatória serão ativados assim. Se a estimulação de luz for percebida como gratificante, o mouse optogenético permanecerá no compartimento com parealeve, enquanto se a estimulação de luz for percebida como aversiva, o mouse sairá do compartimento para escapar da estimulação. Esse tipo de análise permite avaliar a aprendizagem contingente: O sujeito pode desencadear estimulação de luz e, portanto, ativação neuronal entrando em um compartimento e parar a estimulação saindo do compartimento, semelhante à prensagem de alavancadurante uma tarefa instrumental. Além disso, os mecanismos de aprendizagem associativo podem ser avaliados durante as sessões subsequentes, onde o tempo gasto em cada compartimento é medido na ausência de estimulação. Dessa forma, o pesquisador pode dissociar entre os efeitos imediatamente gratificantes sobre a estimulação dos neurônios de interesse e a formação da memória associativa relacionada a ele¹².

No presente estudo, descrevemos dois protocolos de configuração passo-a-passo para o comportamento de preferência de lugar orientado por optogenética de camundongos em movimento livre. O primeiro protocolo descreve o RT-PP dentro de um aparelho de três compartimentos e foi delineado com base nos protocolos apresentados recentemente por Root e colegas¹³ e outros autores^{12,14,15,16,17,18}. O experimento consiste em duas fases que compreendem várias sessões diárias (mostradas na Figura 1A). Cada sessão é projetada para diferentes propósitos e os parâmetros de estimulação de acoplamento com um compartimento são alterados em conformidade. A primeira sessão, a "Pré-teste", é usada para avaliar a preferência inicial do sujeito a qualquer um dos compartimentos. Embora conectado ao cabo de remendo, o sujeito pode explorar livremente o aparelho na ausência de estimulação por 15 min. Se a preferência inicial a qualquer compartimento for superior a 80%, o mouse é excluído da análise, uma vez que o viés lateral inicial pode distorcer a análise. Depois do "Pretest","Fase 1" começa. A primeira parte consiste em duas sessões consecutivas, diárias, de 30 min de "RT-PP". Durante a "Fase 1", o mouse optogenética é conectado à fonte laser através do cabo de remendo e colocado na arena para explorá-lo livremente. O camundongo recebe estimulação laser intracraniana ao entrar em um dos compartimentos principais. Experimentos piloto podem ser realizados para determinar qual compartimento será atribuído como laser-emparelhado e que como sem par. Se a estimulação for demonstrada como recompensa, o laser será acoplado ao compartimento menos preferido durante o "Pretest" e ao mais preferido se a estimulação for áversiva. Assim, o protocolo RT-PP apresentado segue um design tendencioso no sentido de que a estimulação a laser não é atribuída aleatoriamente a nenhum dos dois compartimentos principais (design imparcial), mas é escolhida para evitar qualquer preferência inicial do mouse. A entrada no outro compartimento principal ou no compartimento neutro que conecta os dois compartimentos principais não dá origem à estimulação de luz intracraniana e, portanto, não são pareadas com a luz. Essas sessões permitem uma avaliação em tempo real das propriedades gratificantes ou aversivas da estimulação de populações neuronais específicas. No último dia da "Fase 1", acontece uma sessão de 15 min sem qualquer estímulo. Esta sessão serve para abordar as respostas condicionadas ("CR") que resultam da aprendizagem associativa entre a estimulação e o ambiente onde foi recebida. Pelo menos três dias após a "Fase 1", ocorre a " Fasede Reversão" que segue a mesma estrutura da "Fase 1", mas o compartimento principal não emparelhado anteriormente está agora emparelhado com estimulação de luz. Como no caso da "Fase 1", as duas sessões de estímulo são seguidas por uma sessão "CR". A "Fase de Reversão" é usada para confirmar que o comportamento do camundongo depende da estimulação optogenética e não está relacionado a parâmetros aleatórios. Cada sessão do experimento RT-PP deve ser programada separadamente dentro do software de rastreamento. O protocolo atual descreve tais configurações dentro de um software específico, mas qualquer outro software de rastreamento capaz de enviar sinais de modulação transistor-transistor-lógico (TTL) para a fonte de luz pode ser usado.

O segundo protocolo descreve uma nova configuração chamada paradigma Neutral Compartment Preference (NCP). Este protocolo modificado do RT-PP aproveita o pequeno tamanho e transparência do corredor de conexão que é naturalmente evitado pelo mouse devido à sua composição estreita e transparente. Ao emparelhar ambos os compartimentos principais com estimulação de luz e apenas deixando o corredor livre de estimulação de luz, a configuração NCP pode ser usada para testar se a estimulação optogenética forçará o rato a passar mais tempo no corredor para evitar receber estimulação optogenética. Comparando o tempo gasto nos dois compartimentos com pareadas com o tempo gasto no corredor, uma verificação de aversão optogenética induzida pode ser feita. O experimento NCP consiste em duas sessões diárias consecutivas onde camundongos optogenéticos recebem estimulação (30 min cada) para medir a preferência em tempo real, e uma sessão sem laser (15 min) para avaliar respostas condicionadas de forma semelhante às do RT-PP Protocolo.

Os protocolos RT-PP e NCP fornecidos abaixo foram recentemente validados em nosso laboratório no estudo de como diferentes tipos de neurônios localizados na área tegmental ventral (VTA) estão envolvidos em vários aspectos do comportamento relacionado à recompensa¹². Aqui, para exemplificar a implementação dos protocolos RT-PP e NCP, transporte de dopamina (DAT)-Cre¹⁹ e transporte de glutamato vesicular 2 (VGLUT2)-Cre²⁰ ratos transgênicos foram injetados estereoticamente com AAV carregando uma construção de DNA canaldopsina2 (ChR2) no VTA onde uma fibra óptica foi implantada acima do VTA. Respostas comportamentais obtidas após a análise desses camundongos usando os protocolos RT-PP e NCP fornecidos mostram como a ativação de neurônios dopaminérgicos e glutamatergicos dentro do VTA leva a diferentes respostas comportamentais(Figura 1).

Protocolos passo a passo para paradigmas RT-PP e NCP são fornecidos com informações que vão desde genotipagem de camundongos transgênicos, injeções virais estereotaxiais e colocação de fibra óptica, até programação de software de rastreamento para controle a laser e comportamental Avaliação. Além disso, são discutidas sugestões de modificações do protocolo em termos de parâmetros de estimulação e aspectos experimentais que possam afetar o desfecho científico. Embora os protocolos sejam descritos no contexto do VTA, eles podem ser aplicados a qualquer área cerebral ou população neuronal, desde que as ferramentas optogenéticas relevantes, como o motorista cre relevante e opsinas floxed, estejam disponíveis.

Protocol

Este estudo foi realizado utilizando os camundongos heterozigos daT-Cre¹⁹ e VGLUT2-Cre²⁰ de ambos os sexos, idade >8 semanas e pesagem >20 g. Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Legislação sueca (Lei de Bem-Estar Animal SFS 1998:56) e a Legislação da União Europeia (Convenção ETS 123 e Diretiva 2010/63/UE) com permissão dos Comitês Locais de Ética Animal.

1. Genotipagem de ratos

1. Faça biópsias de ouvido usando um soco de ouvido para usar para genotipagem dos camundongos transgênicos.
2. Prepare os socos de ouvido para realizar uma reação de corrente de polimerase (PCR) usando primers feitos com propósito.
   NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas cartilha sedíolas dirigidas por Cre.
   1. Adicione 75 μL de tampão de lise (buffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) em cada tubo de 1,5 mL contendo um soco de ouvido.
   2. Incubar em um bloco de aquecimento a 96 °C por 30 min.
   3. Deixe as amostras esfriarem por 5 min e depois adicione 75 μL do buffer de neutralização (buffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
3. Executar PCR de acordo com os procedimentos padrão^12,21 usando as primers apropriadas (aqui: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
   ATENÇÃO: Trabalhe no gelo um capô pcr e preste atenção para não contaminar os reagentes e as amostras.
   1. Prepare o mix mestre pcr. Multiplique os seguintes volumes de acordo com quantas amostras serão analisadas, incluindo amostras de controle apropriadas. Misture os reagentes para uma única reação de volume final de 25 μL na seguinte ordem: água destilada (18,9 μL), buffer de 10x com MgCl₂ (2,5 μL), mix dNTP de 10 mM (0.5 μL), primer dianteiro de 10 μM (1 μL), primer reverso de 10 μM (1 μL), 5 polimererase de DNA U/μL (0,1 μL) e DNA de modelo (1 μL; será adicionado nos próximos passos).
      NOTA: Adicione sempre um controle negativo, positivo e um dna vazio (sem dna) para garantir resultados válidos.
   2. Adicione 24 μL de mix master em tubos PCR.
   3. Adicione 1 μL de DNA de modelo (vindo do soco de ouvido de cada mouse) em cada tubo PCR.
   4. Centrífuga os tubos PCR brevemente para garantir que o DNA do modelo esteja dentro da mistura master.
   5. Executar PCR com uma ciclor térmica usando o programa de ciclismo na Tabela 1.
4. Prepare um gel de agarose para executar as amostras usando eletroforrose.
   NOTA: O tamanho dependerá do número de amostras que precisam ser analisadas.
   1. Adicione 1% de pó de agarose em 1x tampão Tris-acetate-EDTA (TAE) em uma garrafa de vidro. Aqueça no micro-ondas até que a agarose esteja totalmente dissolvida, verificando regularmente que não ferve.
      ATENÇÃO: Tome precauções para evitar queimaduras.
   2. Deixe o gel esfriar até aproximadamente 50 °C e adicione uma mancha de gel ácido nucleico (0,5 μL/50 mL de gel).
   3. Despeje o gel na bandeja de fundição contendo pentes bem e deixe-o em temperatura ambiente até que fique completamente solidificado. Remova os pentes suavemente.
   4. Encha o tanque de eletroforese com tampão 1x TAE e coloque o gel no tanque.
   5. Adicione 2 μL de 1x dna carregando tinantes em cada uma das amostras de DNA.
   6. Carregue 4 μL de escada de DNA no primeiro poço do gel, depois prossiga para carregar o volume total das amostras nos poços restantes.
   7. Defina a fonte de energia da eletroforese a 140 V e corra por 25-30 min.
   8. Coloque o gel uma fonte UV e tire uma foto dos resultados.

2. Cirurgia estereotaxica

1. Depois da genotipagem, ratos separados mantendo os positivos para Cre. Espere até que eles tenham pelo menos 8 semanas de idade e pedaçam >20 g para realizar a cirurgia.
   1. Higienize o ambiente e esterilize as ferramentas cirúrgicas para realizar a cirurgia em condições assépticas.
   2. Injete os camundongos subcutâneamente com analgésico sino 30 min antes da cirurgia.
   3. Anestesiar os camundongos com isoflurano (2-3% no ar normal para indução e 1,5-2,0% para manutenção da anestesia). Certifique-se de que o nível adequado de anestesia seja alcançado testando a ausência de reflexos de dor, beliscando suavemente o dedo do pé do camundongo. Ajuste a entrega de isoflurano em conformidade.
   4. Coloque o mouse no aparelho estereotaxic. Adicione lubrificante oculares para evitar lesões oculares devido à ressecamento e raspe o cabelo da parte superior do crânio. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do mouse estável.
   5. Injete 100 μL de anestésico local a pele do crânio e permita que 5 min entrem em vigor.
   6. Prepare o local da incisão por três aplicações circulares de álcool ou soros eestéis alternando com iodo. Use uma ponta de algodão estéril e inicie a aplicação da linha de incisão, para fora.
   7. Levante suavemente a pele com fórceps, e faça uma incisão de ~1,5 cm ao longo do eixo rostrocaudal com tesoura cirúrgica para revelar a superfície do crânio.
   8. Usando uma vara de algodão, aplique a solução H₂O₂ para remover o periosteum.
   9. Enxágüe o crânio com soro limíonete estéril e seque-o usando aplicadores estéreis de ponta de algodão.
   10. Localize o bregma e a lambda.
   11. Averiguar o alinhamento do crânio plano posicionando a ponta da agulha de injeção, ajustada na moldura estereotaxica, em bregma e lambda. Meça as coordenadas ventral para cada posição e compare. Quando o crânio está plano, a coordenada ventral para bregma e lambda são idênticas. Se não, ajuste a posição da cabeça e tome as medidas novamente.
   12. Encontre e marque a posição (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm do bregma de acordo com Franklin e Paxinos²²) onde a injeção do vírus cre-dependente e a implantação da fibra óptica ocorrerão e fazer um pequeno buraco usando uma micro broca.
   13. Carregue 400 nL de vírus na seringa de 10 μL montada no aparelho estereotaxica usando uma bomba de precisão.
   14. Abaixe a agulha (34 G, chanfrado) cuidadosamente e injete 300 nL de vírus optogenético dependente do Cre (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5.6 x^{10 12} vg/mL]) no VTA (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm de bregma e -4,4 mm da superfície do crânio, de acordo com Franklin e Paxinos²²) a 100 nL/min taxa de injeção usando a bomba de precisão.
   15. Após a injeção, deixe a agulha no lugar por mais 10 min para permitir a difusão do vírus (Figura 2A).
   16. Retraia a agulha lentamente do local da injeção.
   17. Faça pequenos furos usando uma microbroca para encaixar parafusos de âncora que estabilizarão o complexo de fibra óptica e cimento dentário.
   18. Pegue as coordenadas do bregma novamente e implante a fibra óptica (200 μm de diâmetro, 0,37 NA) em: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm de bregma e -4,0 mm da superfície do crânio(Figura 2B) de acordo com Franklin e Paxinos²².
   19. Segure a fibra no crânio usando cimento dentário. Aplique cimento suficiente em torno do ferule de fibra óptica para fixá-lo ao crânio, mas preste atenção para deixar 3-4 mm da parte superior do ferule livre de cimento para permitir a conexão do cabo de remendo(Figura 2C).
       NOTA: Preste atenção para não preencher o buraco com cimento, pois isso pode causar danos no tecido cerebral. Materiais hemostáticos podem ser adicionados no buraco para evitar que isso aconteça.
   20. Use cola tecidual ou suturas absorvíveis para fechar qualquer ferida aberta e deixe o animal se recuperar por pelo menos duas semanas. Dê uma dose adicional de analgésico 12-24 h após a cirurgia.

3. Configurando o controle da fonte laser

1. Use microcontroladores de placa única para controlar a fonte laser. Escreva um script usando o software apropriado. Carregue o script na placa de microcontrolador usando o cabo de conexão apropriado ao computador.
   NOTA: O script deve incluir modulação externa (entrada) proveniente do software de rastreamento através de uma caixa TTL e uma saída para o laser para controlar parâmetros de estimulação. Para 10 ms largura de pulso a 20 Hz de frequência, use o script encontrado no Arquivo de Codificação Suplementar.
2. Conecte a placa ao laser e à caixa TTL do hardware de rastreamento.
   1. Use um cabo de rede para conectar a caixa TTL à placa (pino 5 para o script fornecido) (Figura 3A,C).
   2. Certifique-se de que o laser está configurado para controlar por modulação externa e conecte o laser à placa usando um cabo FC/PC (pino 13 para o script dado) (Figura 3B,C).
   3. Conecte os pinos apropriados às partes terrestres da placa.
3. Conecte a fonte laser à fibra óptica.
   1. Conecte a fonte laser a uma articulação rotativa (Figura 3D).
   2. Conecte um cabo de remendo(Figura 3E)à junta rotativa.
   3. Estabilize a articulação rotativa acima do aparelho, mas fora da área de gravação. Certifique-se de que o comprimento do cabo de remendo de fibra óptica é apropriado para permitir que o mouse se mova sem dificuldades na arena (Figura 3F).

4. Configurando o experimento para a abordagem RT-PP dentro do software de rastreamento

1. Calibrar a configuração da arena. Use uma régua para medir uma parte específica do aparelho físico, desenhe uma linha correspondente à peça medida na imagem dentro do software a Escala de Saque para Calibrar a guia e digitar o valor já conhecido (passo 1 na Figura 4).
2. Projete a arena. Desenhe a área onde o movimento dos ratos será registrado (etapa 2 na Figura 4).
3. Crie as zonas. Desenhe as zonas que eventualmente serão atribuídas como emparelhadas a laser, sem combinação a laser e "neutras" (passo 3 na Figura 4).
4. Valide a configuração para confirmar que não há parâmetros conflitantes, por exemplo, zonas fora da arena (passo 4 na Figura 4)
5. Defina os parâmetros experimentais as configurações de controle de teste da guia (passo 5 na Figura 4).
   1. Defina o tempo de teste como mostrado na etapa 1 na Figura 5 para uma sessão RT-PP de 30 min.
   2. Certificando-se de que o "controle de hardware" está ativado, atribua um compartimento como emparelhado a laser no qual a entrada do mouse acionará um sinal TTL através do software de rastreamento para a placa de microcontrolador. Na Figura 5 (passo 2) o compartimento emparelhado a laser é o compartimento A. Para a fase de reversão, troque os compartimentos para que o compartimento B seja emparelhado a laser e o compartimento A não será emparelhado. Faça isso substituindo A por B e B por A no software.

5. Modificação da configuração para testar as propriedades aversivas da estimulação usando a abordagem NCP

1. Siga os passos 4.1-4.4 como descrito anteriormente.
2. Defina o tempo do experimento para 30 min através da opção "Repita até" nas configurações da caixa "Referência" (passo 1 na Figura 6).
3. Atribuir zonas A e B como emparelhadas a laser (passo 2 na Figura 6) adicionando "quando o ponto central está em qualquer uma das Zonas A e Zona B" para a caixa de condições relacionada sao as configurações para compartimentos A e B. Observe que o laser desligará quando o animal estiver localizado no compartimento neutro.

6. Realizar um experimento usando estimulação a laser

1. Configure as configurações de detecção.
   1. Use um boneco para se assemelhar ao mouse, a fim de garantir configurações de detecção apropriadas.
   2. Coloque o boneco em um compartimento do aparelho e use configuração automatizada com subtração dinâmica.
   3. Remova o boneco e coloque-o no compartimento oposto. Certifique-se de que o boneco está totalmente detectado e, se não, ajuste as configurações através do software para alcançar a detecção adequada.
      1. Durante esta etapa também verifique se a estimulação funciona como deveria. Inicie a aquisição usando as configurações de controle de teste previamente configuradas e coloque o boneco no compartimento emparelhado a laser e veja se a estimulação é acionada como deveria. Em seguida, coloque o boneco no compartimento não emparelhado e/ou no compartimento neutro e veja se a estimulação está parada.
2. Use um medidor de energia com um sensor para definir a potência laser em 10 mW usando o botão no laser(Figura 3B). Execute esta etapa cada vez que a estimulação a laser é usada.
   ATENÇÃO: Use equipamentos oculares protetores, pois a exposição direta à luz laser pode causar danos oculares permanentes.
3. Coloque o mouse no aparelho.
   1. Leve suavemente o mouse para fora de sua gaiola e conecte o implante de fibra óptica ao cabo de remendo de fibra óptica usando uma manga cerâmica.
   2. Coloque o mouse suavemente no compartimento neutro do aparelho de três compartimentos.
   3. Espere até que o mouse seja detectado pelo software.
   4. Remova as portas deslizantes verticais que restringem o animal de entrar nos compartimentos principais.
   5. Permita que o animal explore livremente sem distúrbios.
      NOTA: O mesmo procedimento é seguido quando o animal não está recebendo estimulação com exceção de que a etapa 6.2 não é necessária e que o laser está fora o tempo todo.

Results

O aparelho de três compartimentos (Figura 3F) é adequado para abordar os efeitos gratificantes das drogas e avaliar em tempo real as propriedades gratificantes ou aversivas da estimulação direta de neurônios usando optogenética. Ele consiste em dois compartimentos principais (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) e um compartimento de conexão menor (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). Os compartimentos principais têm textura e padrões distintos da parede e do piso, a fim de facilitar o aprendizado associativo, enquanto o compartimento de conexão/neutro é estreito e transparente para que os ratos gastem naturalmente menos tempo nele. Como descrito acima, o software de rastreamento pode ser usado para registrar vários parâmetros comportamentais dos camundongos, incluindo movimento e tempo gasto em cada compartimento, e para controlar a estimulação a laser. Todo o experimento RT-PP ocorre ao longo de 8 sessões (Figura 1A) e permite tanto a avaliação das propriedades gratificantes ou aversivas da estimulação direta (dias 3, 4, 6 e 7) quanto a formação de associações, positivas ou negativas, em resposta à experiência anterior (dias 5 e 8"cr").

Em primeiro lugar, testamos camundongos DAT-Cre injetados com vírus AAV-ChR2-eYFP no VTA para atingir neurônios dopaminérgicos. De acordo com a literatura, observou-se que os camundongos preferiram passar tempo no compartimento emparelhado com a estimulação ( Figura1B,fase 1, dias 3 e 4, círculos azuis, medidas repetidas [RM] análise de variância [ANOVA], efeito do compartimento F_(2,18) = 141, p < 0,001; efeito da sessão x compartimento F_(12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F (12.108) = 42,1, p < 0.001; efeito da sessão x compartimento F ( O teste pós-hoc de Tukey emparelhou vs p < não emparelhado; 0,001). A fase de reversão, onde a combinação dos compartimentos à estimulação a laser foi trocada, confirmou essas observações (Figura 1B, dias 6 e 7, círculos azuis, teste pós-hoc de Tukey emparelhado vs compartimento não emparelhado p < 0,001) excluindo assim a possibilidade de que os resultados obtidos a partir da fase 1 estavam relacionados a vieses laterais ou parâmetros aleatórios. A média do tempo gasto em cada compartimento durante os quatro dias de RT-PP confirmou que os camundongos passaram em média cerca de 70% do seu tempo no compartimento emparelhado a laser em oposição aos não emparelhados (~20%) e o neutro (~10%) compartimentos ( Gráfico de barrasFigura 1B, RM ANOVA unidirecional, efeito da estimulação F_(2,6) = 139, p < 0,001, post de Tukey como emparelhado sem pares vs compartimentos não emparelhados e neutros p < 0,001). Além disso, na ausência de estimulação, nos dias 5 e 8, os camundongos passaram significativamente mais tempo no compartimento anteriormente emparelhados com estimulação a laser (tukey pós hoc p < 0,001), indicando que a experiência anterior foi suficiente para induzir comportamentos de aprendizagem associativo refletidos como "busca" da estimulação. Esses dados estão de acordo com a literatura e demonstram que o método atual pode ser usado de forma confiável para investigar os efeitos gratificantes da estimulação optogenética de populações neuronais específicas no VTA.

Em seguida, testamos camundongos VGLUT2-Cre injetados com AAV-ChR2-eYFP no VTA como acima, para atingir neurônios glutamatergicos do VTA. Neste experimento, observamos um fenótipo comportamental oposto daquele demonstrado pelos camundongos DAT-Cre. Assim, os camundongos evitaram o compartimento emparelhado à estimulação e passaram mais tempo no não emparelhado durante todos os dias rt-PP (Figura 1C esquerda, RM ANOVA bidirecional, efeito do compartimento F_(2,12) = 40,9, p < 0,001; efeito da sessão x compartimento F_(12,72) = 16,1, p < 0,001; Teste pós-hoc de Tukey emparelhado vs p < não emparelhado; 0,001; Figura1C direito, efeito RM ANOVA de ida e volta da estimulação F_(2,6) = 162, p < 0,001, tukey pós hoc emparelhado vs compartimentos não emparelhados e neutros p < 0,001). Curiosamente, durante os dias "CR" 5 e 8, os ratos não mostraram uma clara evasão do compartimento anteriormente emparelhado (sem diferenças entre compartimentos emparelhados e não emparelhados). É possível que a falta de resposta condicionada se deve ao tempo inadequado gasto no compartimento emparelhado a laser, o que impediu a formação de associações entre a ativação a laser e o ambiente específico onde ocorreu isso. Para explorar ainda mais esse fenótipo de prevenção, usamos um protocolo modificado que chamamos de "preferência de compartimento neutro", abreviado NCP. Neste experimento, ambos os compartimentos principais foram emparelhados à estimulação e o compartimento neutro permaneceu livre de estimulação(Figura 7A). Nós supõe que, se a estimulação tiver propriedades áversivas, então o mouse será forçado a passar um tempo no compartimento menor e neutro, para evitá-lo. De fato, em ambos os dias de estimulação (Stim1 e Stim2) os camundongos passaram a maior parte do tempo no compartimento neutro (cerca de 80%) em comparação com os compartimentos emparelhados (Figura 7B,C; esquerda: efeito RM ANOVA de duas vias do compartimento F_(2,8) = 70,9, p < 0,001; efeito da sessão x compartimento F_(4,16) = 6,9, p = 0,002, o compartimento neutro pós-hoc "Estimulação 1" de Tukey vs compartimento neutro 1 e 2 p < 0,01, "Estimulação 2" compartimento neutro vs compartimento 1 e 2 p < 0,001; direito: RM ANOVA de ida, efeito de estimulação F (2,2) = 54,2 p, p< 0,001; direito: RM ANOVA de ida, efeito de estimulação F_(2,2) = 54,2, p.p, p.p, p.p 0,018, o teste pós-hoc de Tukey emparelhou 1 e 2 vs p < neutro; 0,05). Como no caso dos dias de "CR" durante o teste RT-PP, os camundongos não pareciam formar associações negativas entre os compartimentos e a estimulação; ou seja, na ausência de estimulação (CR), exploraram todos os compartimentos no mesmo grau (Figura 7B, sem diferenças entre o tempo gasto em compartimentos emparelhados e compartimento neutro). Os resultados desses experimentos confirmaram o fenótipo comportamental observado durante a configuração RT-PP e, assim, apoiam a implementação combinatória dos paradigmas RT-PP e NCP.

Figura 1: Testes comportamentais usando optogenética no paradigma RT-PP. (A)Representação esquemática da linha do tempo dos experimentos. (B,C) Superior esquerdo: gráfico representando a porcentagem de tempo gasto em cada compartimento durante todo o experimento RT-PP para DAT-Cre (N = 10) e VGLUT2-Cre (N = 7) ratos injetados com aAV-ChR2-eYFP. Círculos azuis: compartimento emparelhado a laser; brancos, círculos pretos: compartimentos principais; círculos cinza: compartimento neutro. Canto superior direito: percentual médio de tempo gasto em cada compartimento durante os dias 3, 4, 6 e 7 (RT-PP). Fundo: mapas de calor representativos do tempo gasto em cada compartimento para um DAT-Cre e um mouse VGLUT2-Cre. Todos os dados foram normalmente distribuídos (teste Shapiro-Wilk). Os resultados são apresentados como média ± SEM. ***p < 0,001 emparelhado sem par; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0,001 emparelhado vs compartimento neutro; §§p < 0,01, §§§p < 0,001 compartimento não emparelhado versus neutro. Este número foi modificado de Bimpisidis et al.¹². Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Procedimento cirúrgico para experimentos optogenéticos. (A)Injeção de vetor viral dependente do Cre no VTA. (B)Implantação da fibra óptica acima do local da injeção. Observe os parafusos de âncora usados para estabilização. (C)Ancoragem permanente da fibra no crânio usando cimento dentário. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Equipamento usado nos experimentos de optogenética. (A)A caixa TTL utilizada nos estudos. Ele recebe entrada do software de rastreamento e envia sinais TTL para a placa de microcontrolador. (B)Frente (superior) e retrovisor (inferior) da fonte laser usada para os experimentos. (C)A placa de microcontrolador usada para controlar a estimulação a laser. Observe as conexões da caixa TTL e da fonte laser. (D) Articulação rotativa. (E)Acorde de patch de fibra óptica usado nos experimentos. (F) O aparelho de três compartimentos usado para experimentos RT-PP e NCP. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 4: Projetando arena e zonas dentro do software de rastreamento. Passo 1: Calibração da configuração. Passo 2: Desenho de toda a arena. Passo 3: Zonas de desenho dentro da arena. Passo 4: Validação de configuração. Passo 5: Guia de configurações de controle de teste para configurar parâmetros de tempo e estimulação. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 5: Configuração de parâmetros de tempo e estimulação de um experimento RT-PP dentro do software de rastreamento. Adicionando regras específicas para a duração (passo 1) e as condições para estimulação de luz (passo 2). As condições podem ser facilmente alteradas para se adequar aos requisitos para a fase de reversão. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 6: Configuração de parâmetros de tempo e estimulação de experimentos NCP dentro do software de rastreamento. A duração das sessões de estimulação (etapa 1) é semelhante às do RT-PP, mas as condições para ativação da estimulação de luz (passo 2) são diferentes. A entrada em qualquer compartimento principal (aqui denominada zona A e zona B) resulta em estimulação optogenética que só é encerrada quando o mouse entra no compartimento neutro. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 7: Testes comportamentais usando optogenética no paradigma NCP. (A)Representação esquemática da configuração experimental. (B) Esquerda: gráfico representando a porcentagem de tempo gasto em cada compartimento durante os dois dias de estimulação (Stim1 e Stim 2) e durante a sessão de resposta condicionada (CR) para ratos VGLUT2-Cre injetados com AAV-ChR2 no VTA (N = 5). Certo: percentual médio de tempo gasto em cada compartimento durante os dois dias de estimulação do NCP. (C)Mapa de calor representativo do tempo gasto em cada compartimento para um mouse VGLUT2-Cre durante um dos dias de estimulação. Os dados eram normalmente distribuídos (teste Shapiro-Wilk). Os resultados são apresentados como média ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 não emparelhado vs emparelhados 1 e emparelhado2 compartimentos. Este número foi modificado de Bimpisidis et al.¹². Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Passo	Temperatura	Duração	Ciclos
1. Desnaturação inicial	95 °C	4 min.	1
2. Denaturação	95 °C	30 s	30
3. Annealing	55 °C	30 s
4. Extensão	72 °C	40 s
5. Prorrogação final	72 °C	6 min.	1
6. Hold	4 °C	Até parar pelo experimentador	1

Tabela 1: O programa de ciclismo PCR.

Arquivo de codificação suplementar. Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).

Discussion

No presente estudo, apresentamos dois protocolos passo a passo de como realizar diferentes tipos de análises de preferência de lugar usando optogenética em camundongos. Os protocolos traçados foram utilizados para avaliar os fenótipos comportamentais gratificantes ou aversivos dos neurônios VTA (Figura 1 e Figura 6)¹², mas também podem ser utilizados para explorar o papel comportamental dos neurônios em outras regiões cerebrais.

Vários estudos recentes descreveram paradigmas RT-PP em aparelhos de dois compartimentos^23,24 e três compartimentos^{13,14,15,16,17,18}. Os protocolos atuais descrevem configurações detalhadas para os protocolos RT-PP e NCP em um aparelho de três compartimentos semelhante aos tradicionalmente usados em experimentos de CPP para avaliar efeitos comportamentais na administração de drogas de abuso. Embora os resultados sejam apresentados aqui apenas como a porcentagem de tempo que o mouse passou em cada compartimento, o software de rastreamento permite a análise de vários outros parâmetros comportamentais, como transições para zonas, velocidade, tempo gasto imóvel e muito mais. A análise de diferentes parâmetros pode ser importante para a interpretação dos dados.

Os protocolos RT-PP atuais são flexíveis e podem ser modificados para testar se diferentes tipos de padrões de estimulação tiverem efeitos gratificantes. Os parâmetros de controle a laser podem ser facilmente alterados através do script da placa de microcontrolador ou dentro do software de rastreamento, demonstrando a versatilidade da configuração. Sugerimos uma frequência de estimulação de 20 Hz que está dentro da faixa, e às vezes menor, das frequências aplicadas em estudos anteriores utilizando a mesma variante de opsina (ChR2/H134R) para estudar neurônios dopaminérgicos e glutamatergicos e seus terminais^{13,14,16,17,18,23,25,26,27}. Estudos recentes demonstraram que frequências de estimulação mais altas podem ter os efeitos opostos sobre o comportamento do que os mais baixos, e que esses efeitos são mediados através de um bloco de despolarização causado por frequências mais altas²⁸. Da mesma forma, diferenças na produção comportamental têm sido mostradas ao estimular neurônios glutamatergicos e gabaergicos na área pré-óptica lateral¹⁵. Esses estudos examinaram neurônios de diferentes áreas do VTA e os maiores efeitos foram observados em altas frequências de neurônios não glutamatergicos^15,28. Nossa escolha em 20 Hz é baseada em estudos anteriores de neurônios VTA glutamatergicos e dopaminérgicos demonstrando que, por frequências variadas de estimulação, a produção comportamental relacionada à recompensa não é significativamente alterada^24,26.

Um parâmetro adicional que pode ser ajustado e que pode influenciar o resultado experimental é o poder da fonte de luz. Maior potência a laser pode aumentar o tamanho da área estimulada pela luz, o que pode ser benéfico em alguns tipos de experimentos, mas com a desvantagem de um aumento na temperatura⁵. De fato, um estudo recente demonstrou que aumentos induzidos por laser na temperatura podem alterar a fisiologia cerebral e afetar as medidas comportamentais²⁹. Essas observações destacam a importância de incluir controles opsina-negativos no projeto experimental. No protocolo atual, usamos 10 mW de energia laser semelhante e já se mostrou eficaz no estímulo aos neurônios dopaminérgicos e glutamatergicos no VTA^16,24,26. Ao configurar experimentos, é importante prestar atenção ao tamanho da área em que as células de interesse estão localizadas e as propriedades de fibra óptica e cordão de remendo (abertura numérica, diâmetro do núcleo). Esses parâmetros são essenciais para levar em consideração ao realizar cálculos relacionados à energia a laser. Para mais detalhes, a calculadora desenvolvida pelo laboratório de Karl Deisseroth(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)pode ser usada.

A verificação histológica da recombinação Cre-Lox é outro aspecto crítico na aplicação de experimentos optogenéticos. A validação da eficiência de recombinação deve sempre ocorrer em uma coorte piloto antes do início de quaisquer experimentos comportamentais em um grande grupo de animais. Isso é importante por razões éticas, mas também para a produção experimental otimizada. Cada construção viral pode apresentar especificidade variável para tipos neuronais distintos e em diferentes regiões⁵, parâmetro que pode afetar os experimentos de maneiras imprevisíveis e até enganosas. Por exemplo, validamos anteriormente o padrão de recombinação Cre-Lox dos vírus AAV5 no VTA de camundongos DAT-Cre e descobrimos que as injeções unilaterais eram suficientes para atingir a maioria da área de interesse. Quando estudamos então subpopulações espacialmente restritas dentro do VTA, como uma caracterizada pela expressão NeuroD6, observamos que as injeções virais bilaterais eram mais eficientes para atingir um número maior de neurônios que davam efeitos comportamentais mais pronunciados sobre a estimulação de luz optogenética¹². Além disso, o tempo da cirurgia ao início de experimentos comportamentais deve ser abordado cuidadosamente. Duas semanas é tempo suficiente para que uma construção de DNA ChR2 seja expressa em corpos celulares como mostramos aqui, mas tempos de espera mais longos (~8 semanas) podem ser necessários se o investigador estiver testando o efeito da estimulação nas áreas de projeção^13,14,15,17.

Vale ressaltar que o volume de vírus injetado (no nosso caso 300 nL) pode ser adequado ao estudar neurônios no VTA, mas o volume e o titer devem ser ajustados dependendo da eficiência da transdução e do tamanho da estrutura estudada. Além disso, para estruturas bilaterais localizadas a uma distância do eixo mediolateral, pode ser necessário realizar injeções bilaterais, e também implantar fibra óptica bilateralmente para garantir ativação/inibição em ambos os hemisférios.

Por fim, é sempre necessário realizar análise histológica pós-morte para validar e confirmar a eficiência da recombinação Cre-Lox e verificar o local correto de implantação da fibra óptica no local pretendido. Uma recombinação cre-lox inesperada, excessiva ou excessiva pode ocorrer devido à distribuição desconhecida de neurônios expressando Cre fora das fronteiras da área pretendida, ou devido a diferenças no sorotipo do vírus, mau manuseio do vírus, entupimento do seringa para entrega de vírus ou outros problemas relacionados à cirurgia. A verificação da recombinação cre-lox satisfatória e a implantação correta da fibra óptica deve ser realizada para confirmar quaisquer resultados estatísticos das avaliações comportamentais, a fim de tirar conclusões seguras.

Em termos dos dados aqui fornecidos como exemplos de como os dois paradigmas comportamentais podem ser usados, a preferência significativa ao lado de pareleve obtido pela estimulação optogenética de neurônios dopaminérgicos no VTA, analisando camundongos DAT-Cre no paradigma RT-PP foi esperado com base em achados anteriores^{23,24,25,26,27,} enquanto a evasão deste lado mostrada pelo VGLUT2-PP não foi antecipada. Os neurônios VGLUT2 do VTA e suas projeções têm se mostrado envolvidos tanto na recompensa quanto na aversão^{16,17,24,30,31}, e, portanto, realizamos a análise do NCP para avaliar o aparente comportamento de evasão observado na configuração atual do RT-PP com mais detalhes. Usando o corredor estreito e transparente como o único compartimento emparelhado não leve para confirmar as propriedades aversivas da estimulação de neurônios glutamatergicos VTA, é evidente que nesta configuração específica de três compartimentos, a ativação optogenética desses neurônios causa uma resposta aversiva. Esses experimentos, que aqui foram mostrados para exemplificar situações que poderiam se beneficiar do uso tanto dos protocolos RT-PP quanto do NCP, fizeram parte de um estudo publicado recentemente, e o conjunto completo de dados, bem como discussões sobre esses achados podem ser encontrados nesta publicação¹².

Além do NCP, formas alternativas de confirmar a aversão incluem a forte iluminação de uma área dentro de uma área de campo aberto, ao mesmo tempo em que emparelha o resto da arena à ativação a laser, ou realizar uma tarefa de evasão ativa na qual o mouse tem que executar um padrão específico de comportamento para acabar com a estimulação a laser¹⁵.

Resumindo, os protocolos descritos fornecem informações críticas de como realizar com sucesso a análise RT-PP e NCP da maneira mais eficiente, a fim de desvendar o papel da ativação neuronal na recompensa e aversão. Dependendo da hipótese científica, uma série de parâmetros podem ser analisados usando esses protocolos, e cada protocolo também pode ser combinado com outros paradigmas validados para análises comportamentais otimizadas implementando optogenética para abordar cérebroespecífico áreas e neurônios de interesse.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
vetor UNC	de vírus dependente de AAV-Cre	-	uma grande variedade de vírus para atender às necessidades de qualquer projeto
Agarose	VWR Life Science	443666A
Tampão para PCR	KAPA BIOSYSTEMS	KB1003	10x, contém 1,5mM MgCl2 a 1x
Bupivacaína (Marcain)	Aspen	N01BB01	anestésico local, solução de 5 mg/ml, requer receita médica
Carprofeno (Norocarpo)	N-Vet	27636	anti-inflamatório, analgésico; solução de 50 mg / ml, requer prescrição
dNTP conjunto	Thermo Fisher Scientific	R0181	100mM, tem que ser diluído para 10mM e
escada de DNA	Thermo Fisher Scientific	SM0243	100 bp, 50 μ g Gene Ruler
DNA loading dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	6x, diluir para 1x antes de usar
perfurador de orelha	AgnThos	AT7000	perfurador de orelha para coletar amostras de tecido para PCR ou para marcar animais
Cabos de fibra óptica	Lentes dóricas	MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Lentes dóricas	de fibra óptica implantáveis	MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT	as propriedades das fibras podem mudar dependendo do experimento
Bomba de infusão para injeções de vírus	AgnThos	Legato 130	contém bomba remota para prender a seringa diretamente na estrutura do stereotexi
Isoflurano (Forano)	Baxter	N01AB06	Anestésico volátil, requer prescrição
Parafusos de joalheria	AgnThos	MCS1x2
Fonte de laser	Placa Microcontroladora Marwell Laser Systems	CNI MBL-III-473-100mW
	A placa Arduino	"Uno"	pode ser encomendada de várias empresas
Microdrill	AgnThos	1474	pode ser encomendada com ou sem suporte estereotáxico
Agulha (34G)	World Precision Instruments	NF36BV
Mancha de gel de ácido nucleico - GelRed	Biotium	Tubos de PCR 41003-T
	Axygen	PCR-0208-CP-C
Medidor de potência	Thorlabs	PM100D
Aparelho de Preferência de Lugar	Panlab	76-0278
Lentes Dóricas	de Junta Rotativa	FRJ_1x1_FC-FC
	Mangas Lentes Dóricas	SLEEVE_ZR_1-25	manga de acoplamento para conectar o patchcord com a óptica implantada cimento de estabilização de fibra
	Ivoclar Vivadent	Tetric EvoFlow
Syringe (10ul)	World Precision Instruments	NanoFil
Taq polimerase	KAPA BIOSYSTEMS	KE1000	500U
tampão TAE	Omega BIO-TEK	SKU:	concentração de 50x, tem que ser diluído antes do uso
Termociclador	BIO-RAD S1000	1852148	necessário para realizar reações de PCR
Cola de tecido	AgnThos	Vetbond
Software de rastreamento	Noldus	Ethovision XT
Caixa TTL	Noldus	Caixa USB-IO
Transiluminador UV	Modelo		c200