Artigo de método

Microwaving e Fluorophore-Tyramide para Imunocoloração Multiplex em Adrenals de camundongos − Usando Anticorpos primários conjugados da mesma espécie hospedeira

DOI:

10.3791/60868

⸱

21 de fevereiro de 2020

 ,  ,  , 
1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vários métodos diferentes foram estabelecidos para a imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Aqui, descrevemos o uso de anticorpos mediados por micro-ondas e de fluoroforre-tyramida para bloquear a reatividade cruzada de anticorpos durante a imunocoloração multiplex em seções adrenal de camundongos forjadas fixadas em formalina.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunocoloração é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para mostrar o padrão de expressão celular de uma determinada proteína. A imunocoloração multiplex permite rotular usando múltiplos anticorpos primários. Para minimizar a reatividade cruzada de anticorpos, a imunocoloração multiplex usando manchas indiretas requer anticorpos primários não rotulados de diferentes espécies hospedeiras. No entanto, a combinação apropriada de diferentes anticorpos de espécies nem sempre está disponível. Aqui, descrevemos um método de uso de anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira (por exemplo, neste caso, ambos os anticorpos são de coelho) para imunofluorescência multiplex em seções adrenal de camundongos forfinados fixadas (FFPE). Este método utiliza o mesmo procedimento e reagentes utilizados na etapa de recuperação de antígenos para despir a atividade do complexo de anticorpos primários anteriormente manchado. Slides foram manchados com o primeiro anticorpo primário usando um protocolo geral de imunocoloração seguido de um passo de ligação com um anticorpo secundário biotinylado. Em seguida, um método de desenvolvimento de sinal avidin-biotina-peroxidase foi usado com fluorofide-tyramida como substrato. A imunoatividade do primeiro complexo primário de anticorpos foi despojada através da imersão em uma solução de citrato de sódio fervente micro-ondas por 8 min. O deposição fluorofídeo insolúvel permaneceu na amostra, o que permitiu que o slide fosse manchado com outros anticorpos primários. Embora este método elimine a maioria dos sinais positivos falsos, alguns antecedentes da reatividade cruzada de anticorpos podem permanecer. Se as amostras forem enriquecidas com biotina endógena, um anticorpo secundário conjugado por peroxidase pode ser usado para substituir o anticorpo secundário biotinylado para evitar o falso positivo da biotina endógena recuperada.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na imunocoloração multiplex, a coloração direta usando anticorpos primários conjugados pode fornecer resultados informativos. Sem o uso de anticorpos secundários, o método de coloração direta tem baixo risco de falsos sinais de colocalização da reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, os repórteres conjugados (fluorofóbico, enzimas) ou biotina no anticorpo primário limitam seu uso futuro. Alternativamente, a imunocoloração indireta geralmente fornece sinais mais fortes usando um anticorpo primário não conjugado com um anticorpo secundário rotulado. Idealmente, anticorpos primários não conjugados usados na imunocoloração multiplex devem vir de diferentes espécies hospedeiras para evitar a reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, a combinação apropriada de anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras nem sempre está disponível.

Vários métodos foram estabelecidos para eliminar o risco do anticorpo secundário reagir com um anticorpo primário indesejado. Um método comum é o uso de um anticorpo monomérico F (ab) para bloquear quaisquer epítopos de ligação restantes no primeiro complexo primário de anticorpos antes de colorir com o segundo anticorpo primário1. A desmontagem de anticorpos, semelhante à tira e resonda de uma folha de manchas ocidentais, remove o complexo de anticorpos manchado anteriormente sem desmontar a deposição de moléculas de repórteres detectáveis, como 3,3'-diaminobenzidina tetracloridride (DAB)2 e a dposição de tyramida fluorescente3. Com este método, moléculas de repórteres em cores diferentes podem mostrar um resultado multiplex no mesmo slide. A coloração multiplex também é alcançável pela remoção completa das camadas anteriormente depositadas de anticorpos e o alinhamento de imagens posteriormente adquiridas de outros anticorpos4,5. Todos esses métodos dão resultados confiáveis, embora cada método tenha suas limitações e exija procedimentos complicados ou um sistema especial de imagem.

O protocolo atual mostra a aplicação de um método de desmontagem de anticorpos com o uso de buffers comumente disponíveis. Este protocolo pode ser usado para realizar manchas imunofluorescentes multiplex em seções adrenal de camundongos fixas de parafina fixas formalinadas (FFPE) com dois anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Colorir com o Primeiro Anticorpo

  1. Depilação e rehidratação de ffpe slides com 5 min alocados em cada uma das seguintes etapas: xileno ou reagentes equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x e água destilada 2x.
    NOTA: Os slides devem permanecer úmidos a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final.
  2. Para recuperação opcional de antígeno, coloque os slides em 275 mL de solução de citrato de sódio fervente (10 mM, pH = 6,0) por 8 min. Para manter a solução fervendo, coloque os slides lisos na parte inferior de uma caixa de ponta de tubulação de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) com tampa e micro-ondas a solução em 70% de potência em um forno micro-ondas de 700 W por 8 min. Em seguida, retire a caixa de ponta pipette do forno de micro-ondas, abra a tampa e deixe a solução esfriar à temperatura ambiente (RT) por pelo menos 20 min.
  3. Transfira os slides para um frasco coplin contendo PBST (soro fisiológico tampão de fosfato com 0,1% de polisorbato 20/80). Lave com PBST por 5 min 3x. Se não estiver imediatamente se movendo para o próximo passo, armazene os slides nesta etapa com PBST em um frasco coplin na RT por algumas horas ou a 4 °C por 1-2 dias se não se mudar imediatamente para o próximo passo.
  4. Para preparar a solução de bloqueio use o soro normal das espécies hospedeiras do anticorpo secundário como o reagente de bloqueio. Outros reagentes de bloqueio comercial também podem ser usados. Se utilizar o soro normal empregado para o estudo apresentado neste estudo, adicione 100 μL de soro de burro normal a 4,9 mL de PBST. A solução de bloqueio pode ser armazenada a 4 °C por até 3 dias.
  5. Para bloquear, afaste o PBST dos slides e cubra-os rapidamente com solução de bloqueio suficiente. Incubar os slides na RT em uma câmara umidificada por 30 min.
  6. Prepare a solução primária de anticorpos (500 μL para dois slides) usando a solução de bloqueio para diluir o anticorpo primário à concentração desejada. A solução deve ser armazenada no gelo até o uso.
    1. Para 3βHSD, adicione 2 μL de 3βHSD em 498 μL de solução de bloqueio.
    2. Para TH, adicione 0,5 μL de anticorpo TH em 499 μL de solução de bloqueio.
    3. Para β-catenina, adicione 1 μL de anticorpo β-catenin em 499 μL de solução de bloqueio.
    4. Para 20αHSD, adicione 1 μL de anticorpo 20αHSD em 499 μL de solução de bloqueio.
    5. Para CYP2F2, adicione 2 μL de anticorpo CYP2F2 em 498 μL de solução de bloqueio.
  7. Incubar com o anticorpo primário sacudindo a solução de bloqueio dos slides, e cobrindo-os rapidamente com solução de anticorpos primários suficiente. Incubar os slides em uma câmara umidificada durante a noite a 4 °C. Durante a incubação, os slides podem ser cobertos por um pequeno pedaço de película de parafina para evitar a secagem.
  8. Na manhã seguinte lave os slides com PBST por 5 min 3x.
  9. Prepare a solução secundária de anticorpos (500 μL para dois slides) usando a solução de bloqueio para diluir o anticorpo secundário biotinylado à concentração desejada (por exemplo, 1 μL de anticorpo anti-rato de burro ou anticorpo anti-coelho burro em 499 μL de bloqueio solução). A solução deve ser armazenada no gelo até o uso.
  10. Incubacom o segundo anticorpo, sacudindo o PBST dos slides e cobrindo-os rapidamente com solução de anticorpos secundários suficiente. Incubar os slides em uma câmara umidificada por 1 h na RT.
    NOTA: Se a biotina endógena é uma preocupação, use um anticorpo secundário conjugado peroxidase em vez do anticorpo secundário biotinylado. Pule para a etapa 1.14 se usar um anticorpo secundário conjugado peroxidase na etapa 1.10.
  11. Lave os slides com PBST por 5 min 3x.
  12. Prepare a solução de streptavidin conjugada com rabanete (SA-HRP) (500 μL para dois slides) adicionando 0,5 μL de SA-HRP em 499 μL de PBS. A concentração final é de 1 μg/mL.
  13. Incubar com a solução SA-HRP. Afaste-se do PBST dos slides e cubra rapidamente os slides com solução SA-HRP suficiente. Incubar os slides em uma câmara umidificada por 0,5 h na RT.
  14. Lave os slides com PBST por 5 min 3x.
  15. Prepare a solução fluorofórde-tyramida diluindo fluorofóide com seu buffer de diluição de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, 5 μL de fluorofórdio-tyramida em 496 μL de tampão de diluição).
  16. Execute o desenvolvimento do sinal com fluorofórdio-tyramida sacudindo o PBST dos slides e cobrindo rapidamente os slides com solução fluorofórde-tyramida suficiente. Incubar em uma câmara umidificada por 1 min na RT. O tempo de incubação pode ser ajustado para obter a intensidade de fluorescência desejada. Pare a reação transferindo os slides para um frasco coplin contendo PBST. Lave slides com PBST por 3 min 2x.
  17. Os sinais podem ser rapidamente verificados um microscópio de fluorescência para confirmar o resultado nesta fase. Se os deslizamentos de cobertura não estiverem sendo utilizados, aplique uma gota de glicerol:PBS (1:1) em cada seção para manter as amostras úmidas. Lave slides com PBST por 3 min 2x. Os slides podem ser armazenados no PBST a 4 °C por alguns dias antes de passar para o próximo passo.

2. Tire o Primeiro Anticorpo

  1. Coloque os slides em 275 mL de solução de citrato de sódio fervente (10 mM, pH = 6,0) por pelo menos 8 min. Mantenha a solução fervendo colocando os slides planas na parte inferior de uma caixa de ponta de tubulação de 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) com uma tampa e microwaving a solução em 70% de potência em um forno micro-ondas de 700 W para 8 min. Se um tempo mais longo de despição for preferido, pode ser necessário completar o buffer usando uma solução de citrato de sódio fervente para manter os slides imersos na solução tampão o tempo todo. Retire a caixa de ponta da pipeta do forno de micro-ondas, abra a tampa e deixe a solução esfriar na RT por pelo menos 20 min.
  2. Transfira os slides para um frasco coplin contendo PBST. Lave com PBST por 5 min 3x. Se o próximo passo, se não for realizado imediatamente, armazene os slides em um frasco coplin com PBST na RT por algumas horas ou a 4 °C por 1-2 dias.

3. Mancha com o Segundo Anticorpo

  1. Comece a partir da etapa de bloqueio e siga os mesmos procedimentos na etapa 1.5 até a etapa 1.14. Nas etapas de desenvolvimento do sinal (passo 1.15 e passo 1.16), use o fluorofórdia-tyramida em um espectro diferente de fluorescência.
    NOTA: Os slides podem ser despojados usando este método várias vezes para permitir a coloração multiplex. O último anticorpo não requer fluorofóide-tyramida como repórter. Um anticorpo secundário conjugado com fluorofóforo pode ser usado para mostrar sinais do último anticorpo primário.
  2. Deslizamentos incubados com 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou solução hoechst para 1 min na RT se for necessário a coloração de contador nuclear. Em seguida, lave os slides com PBST por 3 min 2x.

4. Imagem usando um microscópio de fluorescência para detectar sinais

  1. Monte um deslizamento de cobertura com uma gota de montagem média adequada para imunofluorescência.
  2. Para imagens, use um microscópio de fluorescência para detectar sinais de cada canal de fluorescência. Comece com o canal de coloração nuclear (DAPI) e a lente 4x para localizar o tecido no slide.
  3. Mude para a lente de 10x para imagem. Ajuste o tempo de exposição (300 ms) e a intensidade da fonte de luz (80% de intensidade). Ajuste essas configurações se o sinal estiver muito brilhante ou muito escuro. Tire fotos de cada canal sem mover o palco. O redirecionamento pode ser necessário para cada canal. Mesclar as imagens de cada canal usando o software do microscópio ou ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os resultados foram obtidos a partir de amostras tratadas com todas as etapas descritas, incluindo a etapa 1.2 de recuperação de antígenos. Todos os anticorpos secundários usados aqui estavam biotinylated. O fluoroforreio-tyramida foi usado para desenvolver sinais do primeiro e segundo anticorpos primários. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência equipado com um cubo FITC (para fluorescência verde), um cubo TxRED (para Cy3) e um cubo DAPI (para DAPI).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunocoloração multiplex é útil para examinar a colocalização celular de dois ou mais antígenos. Esta técnica amplamente utilizada dá resultados convincentes de colocalização quando os anticorpos primários são conjugados com diferentes repórteres (coloração direta). No entanto, a coloração direta geralmente fornece sinais mais fracos em comparação com a coloração indireta, que envolve anticorpos secundários conjugados para detectar os anticorpos primários. Na coloração indireta, um resultado de imunocoloração multiplex...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado pelo NIH R00 HD032636.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de Montagem AntifadeVector LaboratoriesH-1000
Burro biotinilado anti-ratoJacksonImmuno715-066-151Diluição 1:500
Burro biotinilado anti-coelhoJacksonImmuno711-066-152Diluição 1:500
DAPIBioLegend4228012 μ g/mL em água destilada
Microscópio de fluorescênciaECHORevolve 4
Estreptavidina conjugada com peroxidase de rábanoJacksonImmuno016-030-084Diluição 1:1.000
Forno de microondas, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2Santa CruzSC-374540Diluição 1:250
Mouse anti-THSanta CruzSC-25269diluição 1:1.000
Soro normal de burroJacksonImmuno017-000-121Soro a 2% em PBST
Rabbit anti-20α HSDKerafastEB40021:500 diluição
Coelho anti-3β HSDTransGenicKO607diluição 1:250
Coelho anti-THNOVUSNB300-109Diluição 1:1.000
Coelho anti-β-cateninaAbcamab32572Diluição 1:500
Estreptavidina Rábano Peroxidase (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-084Diluição 1:1.000
TSA Cy3 TyramidePerkinElmerSAT704B001EADiluição 1:100
TSA Fluoresceína TiramidaPerkinElmerSAT701001EAdiluição 1:100

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043(2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Decapagem por micro ondasRecupera o Antig nicaAvidina Biotina PeroxidaseMicroscopia de Fluoresc nciaCortes FFPEReatividade Cruzada de Anticorpos

Artigos relacionados