Summary
Detta protokoll beskriver en process för tillverkning av lipidnanorörsnätverk med hjälp av glidande kinesinmotilitet i kombination med gigantiska unilamellar lipidblåsor.
Abstract
Lipidnanorörsnätverk (LNT) representerar ett in vitro-modellsystem för att studera molekylär transport och lipidbiofysik med relevans för de allestädes närvarande lipidrören som finns i eukaryota celler. In vivo LNTs är emellertid mycket icke-jämviktsstrukturer som kräver att kemiska energi- och molekylärmotorer monteras, underhålls och omorganiseras. Dessutom är sammansättningen av in vivo LNTs komplex, bestående av flera olika lipidarter. Typiska metoder för att extrudera LNTs är både tids- och arbetskrävande, och de kräver optisk pincett, mikrober och mikropipetter för att med våld dra nanorör från gigantiska lipidblåsor. Här presenteras ett protokoll för glidande motilitetsanalys (GMA), där storskaliga LNT-nätverk snabbt genereras från gigantiska unilamellarblåsor (GUV) med kinesindriven mikrotubulimotilitet. Med hjälp av denna metod bildas LNT-nätverk från ett brett spektrum av lipidformuleringar som efterliknar komplexiteten hos biologiska LNTs, vilket gör dem alltmer användbara för in vitro-studier av lipidbiofysik och membranassocierad transport. Dessutom kan denna metod på ett tillförlitligt sätt producera LNT-nätverk på kort tid (<30 min) med hjälp av vanligt förekommande laboratorieutrustning. LNT-nätverksegenskaper som längd, bredd och lipidpartitionering är också avstämbara genom att ändra lipidsammansättningen hos DE GUV: er som används för att tillverka nätverken.
Introduction
Tillverkningen av lipidnanorörsnätverk (LNT) är av ökande intresse för in vitro-undersökning av icke-jämviktslipidstrukturer 1,2,3. Celler använder lipidrör för diffusiv transport av proteiner4 och nukleinsyror5 samt cell-till-cell-kommunikation 6,7. Den endoplasmatiska retikulum- och Golgi-apparaten är särskilt intressanta, eftersom dessa membranbundna organeller är de primära platserna för lipid- och proteinsyntes samt transport av dessa integrerade biomolekyler inom cytoplasman i en cell 8,9. Membranen i dessa organeller består av flera lipidarter inklusive sfingolipider, kolesterol och fosfolipider10 som i slutändan hjälper till att definiera deras funktionalitet. För att närmare replikera och studera dessa organeller måste in vitro LNT tillverkas från vesiklar med alltmer komplexa lipidformuleringar11.
Jätte unilamellar vesiklar (GUVs) används genomgripande för att studera lipidmembranbeteende eftersom de kan syntetiseras på ett tillförlitligt sätt med komplexa formuleringar som inkluderar kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) och fosfatidylinositol (PI)12,13. Här beskrivs en metod för att tillverka LNTs från GUV med varierande lipidformuleringar med hjälp av glidmotilitetsanalysen (GMA), där LNTs extruderas baserat på det arbete som utförs av kinesinmotorer och mikrotubulifilament som verkar på GUV. I detta system driver kinesinmotorproteiner adsorberade till en yta biotinylerade mikrotubuli och omvandlar kemisk energi från hydrolysen av ATP till användbart arbete (specifikt extrudering av LNTs från biotinylerade vesiklar)11. Det resulterande LNT-nätverket tillhandahåller en modellplattform för att studera effekter av skillnaderna i lipidfaser på förändringar i LNT-morfologi.
Kortfattat införs kinesinmotorproteiner i en flödeskammare i en lösning innehållande kasein, vilket möjliggör adsorption av motorerna på kammarens glasyta. Därefter strömmar biotinylerade mikrotubuli i en lösning innehållande ATP genom kammaren och får binda till kinesinmotorerna och börja motilitet. En streptavidinlösning införs sedan i kammaren och får binda icke-kovalent till mikrotubuli. Slutligen införs GUV som innehåller en biotinylerad lipid i kammaren och binder till de streptavidinbelagda mikrotubuli, sedan extruderar LNTs för att bilda storskaliga nätverk under 15–30 min. Denna metod producerar stora, grenade LNT-nätverk med standard laboratorieutrustning och reagenser till en låg kostnad11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av stammikrotubulilösningar
VARNING: Skyddsglasögon, handskar och en labbrock bör alltid bäras i hela protokollet.
- Förbered 5x BRB80-buffert: tillsätt 24,19 g PIPES (piperazin-N,N′-bis[2-etansulfonsyra]) och 0,38 g EGTA (etylenglykol-bis[β-aminoetyleter]-N,N,N′,N′-tetraättiksyra) till en 1 L glasflaska. Tillsätt 1 ml 1 M MgCl2 och justera pH till 6,9 med KOH. Tillsätt avjoniserat vatten för att få lösningen till en slutlig volym på 500 ml.
- Förbered 100 mM lager av GTP-lösning: väg 52 mg GTP och suspendera i 1 ml destillerat vatten. Dela 100 mM lösning i 20 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Förbered GPEM-lösning: blanda 200 μl 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-lösning, 100 μl 100% glycerol och 600 μl avjoniserat vatten. Dela GPEM-lösningen i 100 μl alikvoter och förvara i -20 °C.
- Bered mikrotubulilösningen genom att bereda injektionsflaskor med kommersiellt tillgängligt, frystorkat tubulin (en injektionsflaska vardera med biotinylerat, fluorescerande märkt och omärkt) i kall (4 °C) GPEM-lösning till en stamkoncentration på 5 mg/ml.
- Utför mikrotubulipolymerisation genom att blanda 4 μL biotinylerat tubulin, 4 μL fluorescerande märkt tubulin och 24 μL omärkt tubulin (allt vid 5 mg / ml koncentrationer) för att skapa ett förhållande på 1: 1: 6 vid en slutlig volym på 32 ml. Håll den på is. Dela tubulinblandningen i 2 μl alikvoter och förvara vid -80 °C tills det behövs.
OBS: Effektiv polymerisation kräver att koncentrationen av tubulin är lika med eller över den kritiska koncentrationen (5 mg / ml)14. Här optimeras valet av tubulinförhållandet för en tillräcklig koncentration biotinylerat tubulin för att effektivt binda streptavidin och GUVs, samt en tillräcklig koncentration av fluorescerande tubulin för mikroskopisk karakterisering.
2. Beredning av jätte unilamellarblåsor (GUVs)
- Beredning av agarosfilm
OBS: Detta protokoll är anpassat från Greene et al.15.- Bered en 1 % w/v-lösning genom att blanda 1 g agaros i 100 ml avjoniserat vatten i 250 ml Erlenmeyerkolv. Använd en vanlig mikrovågsugn för att värma agaroslösningen i 1–2 minuter.
OBS: Lösningen blir genomskinlig när agarosen är helt upplöst. Låt lösningen svalna till 65–75 °C före användning. - Använd en skuren 1 000 μL pipettspets för att pipettera 300–400 μL agaroslösning på ett 25 mm x 25 mm glasöverdrag. Medan du håller kanten på täckglaset med handskar, använd ytterligare en 1 000 μL pipettspets för att sprida den smälta agarosen jämnt över täckglaset.
OBS: Att hålla agarosen vid 65–75 °C möjliggör effektiv spridning på täckglasytan. - Torka de agarosbelagda täckglasen i en 37 °C inkubator i minst 2 timmar, då agarosen blir transparent. Förvara täckglasen genom att placera den agarosbelagda ytan uppåt på en ren yta som luddfritt papper eller vaxbaserad film vid rumstemperatur (RT).
- Bered en 1 % w/v-lösning genom att blanda 1 g agaros i 100 ml avjoniserat vatten i 250 ml Erlenmeyerkolv. Använd en vanlig mikrovågsugn för att värma agaroslösningen i 1–2 minuter.
- Lipid formulering
- Hämta lipider upplösta i kloroform från en frys på -20 °C och placera dem i en kemisk dragskåp tills de når RT.
- Beräkna volymen lipidlager för varje komponentlipid som behövs för formuleringen med hjälp av följande formel:
Där: Vlipid är volymen lipid som ska användas, mol % är den molära procentandelen av lipidkomponenten, n är det totala antalet mol lipid som används i formuleringen och M är koncentrationen av lipid i molära enheter.
OBS: Om man till exempel använder en formulering innehållande 45 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) med en stamlösningskoncentration på 12,72 mM och 1 mikromol totala lipider i formuleringen, skulle volymen DOPC-stam som används i formuleringen vara:
- Blanda lipiderna i det beräknade förhållandet i en injektionsflaska av glas i den kemiska dragskåpet.
- Pipettera över 30 μL lipidlösning på de agarosbelagda täckglasen på en förvärmd värmeplatta som är inställd över smältpunkten för den mättade lipidkomponenten i formuleringen (t.ex. 50 °C värmeplatta för en lipid med Tm på 40 °C).
- Sprid lösningen över agarosfilmen i en cirkulär rörelse med den långa kanten på en 18 G nål tills kloroformen har avdunstat och ett enhetligt lipidskikt har bildats. Håll kanten på täckglaset med handskade fingrar medan du utför detta steg.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar agarosskiktet med nålen. - Placera täckglaset med agarosskikt och lipidfilm i en aluminiumfolieklädd petriskål, filmsidan uppåt och placera petriskålen i en vakuumdesickator i minst 2 timmar för att avlägsna kvarvarande lösningsmedel.
- Under tiden bereda 560 mM sackaroslösning genom att blanda 1,92 g sackaros med 10 ml avjoniserat vatten.
OBS: Koncentrationen av sackaroslösningen beror på osmolariteten hos buffert-GUV: erna späds ut i. Vanligtvis bör sackaroslösningens osmolaritet inte vara mer än 10% större än den buffert som GUV: erna kommer att spädas i, särskilt motilitetsbufferten (se steg 3.11). - GUV-bildning
- Fäst en självhäftande kammare på täckglaset belagt med lipidfilmen genom att försiktigt trycka limkammaren på det lipidbelagda täckglaset med lipidfilmen uppåt, vilket säkerställer att en tät tätning bildas.
- Tillsätt 400 μl 560 mM sackaroslösning (beredd i steg 2.3) till kammaren.
- Placera täckglaset i fuktkammaren och stäng locket.
- Placera fuktighetskammaren på en förvärmd värmeplatta ovanför smältpunkten för den mättade lipidkomponenten i formuleringen.
- Låt vesiklar bildas i ≥1 h före återhämtning.
OBS: Vesikelbildning kan kontrolleras med fluorescensmikroskopi med en 40x luftmållins.
3. Beredning av motilitetsanalyslager och reagenser
- Beredning av kaseinbestånd
- Tillsätt 3 g torrt kasein till ett 50 ml koniskt centrifugrör, tillsätt sedan 30 ml 1x BRB80 och rotera tills lösningen blir viskös. Centrifugera röret vid 15 000 x g i 30 min.
- Överför supernatanten till ett annat 50 ml koniskt centrifugrör och kassera pelleten. Filtrera lösningen genom ett 1 μm sprutfilter och samla lösningen i en 50 ml konisk injektionsflaska. Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm filter och samla lösningen i en 50 ml konisk injektionsflaska.
- Bestäm proteinkoncentrationen genom att mäta absorbansen vid 280 nm med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer och kvartskuvett.
- Beräkna kaseinkoncentrationen i mg/ml med hjälp av följande formel:
- Späd lösningen till 20 mg/ml i 1x BRB80, dela upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Bered glukosoxidas (2 mg/ml) stamlösning genom att blanda 2 mg glukosoxidas med 1 ml 1x BRB80. Dela upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Bered stamlösning av katalas (0,8 mg/ml) genom att blanda 0,8 mg katalas med 1 ml 1x BRB80. Dela upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Förbered 2 M glukoslösning genom att suspendera 0,3 g D-glukos i 1 ml avjoniserat vatten. Dela upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Förbered 100 mM DTT-lager genom att suspendera 0,015 g DTT i 1 ml avjoniserat vatten. Dela upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Förbered 100 mM Mg-ATP-lager genom att suspendera 0,055 g dinatrium ATP i 1 ml lösning av 100 mM MgCl2. Dela upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Bered 100 mM Mg-AMP-PNP-lösning genom att suspendera 0,055 g AMP-PNP i en 1 ml lösning på 100 mM MgCl2, dela sedan upp i 100 μl alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Bered 100 mM Trolox lösning genom att tillsätta 25,03 mg Trolox till 1 ml metanol och förvara vid -20 °C.
- Bered 10 mg/ml streptavidinlösning genom att tillsätta 1 mg streptavidin till 100 μl BRB80, dela sedan upp i 2 μl alikvoter och förvara vid -80 °C.
- Förbered BRB90CAT genom att blanda 200 μL 5x BRB80, 20 μL kaseinlösning, 10 μL MgATP-lösning, 10 μL Trolox, 5 μL paklitaxellösning och 765 μL DI-vatten. Förvaras vid 4 °C.
- Bered motilitetslösningen genom att blanda 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glukoslösning, 2 μL glukosoxidaslösning, 2 μL DTT-lösning och 2 μL katalaslösning. Förvaras vid 4 °C.
- Bered en 1 μM kinesinlösning genom att späda ut stamkininlösningen i BRB80CAT (t.ex. 2 μL 50 mM kinesinlösning i 98 μL BRB80CAT) och förvara vid 4 °C.
- Förbered en 10 μg/ml mikrotubulilösning genom att späda ut 10 μl stabiliserade mikrotubuli i 90 μl rumstemperatur BRB80CAT. Förvara på RT.
- Bered en 10 μg/ml streptavidinlösning genom att tillsätta 0,1 μl 10 mg/ml streptavidinlösning i 99,9 μl motilitetslösning. Förvaras vid 4 °C.
- Bered en 12x GUV-lösning genom att späda ut 5 μL GUV-stam till 55 μL motilitetslösning. Förvaras vid 4 °C.
- Polymerisation av tubulin i mikrotubuli
- Samla upp en tidigare beredd alikvot på 2 μl tubulin från frysen på -80 °C (beredd i steg 1.5) och placera den i ett vattenbad på 37 °C i 30 minuter.
- Bered en 2 mM paklitaxellösning genom att tillsätta 1,71 mg paklitaxel i 1 ml vattenfri DMSO, dela upp i 10 μL alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Nybered BRB80T genom att blanda 99,5 μL 1x BRB80 med 0,5 μL 2 mM paklitaxel. Värm 100 μl BRB80T till 37 °C i vattenbadet.
- Efter 30 minuter, tillsätt 100 μL BRB80T till tubulin alikvoten för att stabilisera mikrotubuli. Förvara på RT.
4. Glidande rörlighetsanalys (GMA)
- Förbered en flödeskammare genom att fästa två remsor dubbelhäftande tejp åtskilda med 5 mm på en glasskiva. Upprepa denna process tills tre lager tejp består av varje remsa.
- Placera ett täckglas ovanpå tejpen och tryck sedan försiktigt ner täckglaset/tejpgränssnittet med en pincett eller penna för att säkerställa tillräcklig vidhäftning.
OBS: Kanalen ska vara 5 mm bred med 25 mm i längd med 300 mm i höjd. - Pipettera in 30 μl 1 mm kinesinlösning (framställd i steg 3.12) i flödescellen och låt den inkubera i 5 min.
OBS: Kaseinet bildar ett dubbelskikt på ytan av täckglaset/glasglaset och underlättar fastsättning av kinesinsvansen på ytan. - Pipettera in 30 μl 10 μg/ml mikrotubulilösning (beredd i steg 3.13) i flödescellen med hjälp av en laboratorietorkning som försiktigt pressas mot den motsatta änden av flödeskanalen för att underlätta lösningsutbytet. Inkubera i 5 min.
- Tvätta flödescellen 1x–3x med 1x motilitetslösning vid RT (beredd i steg 3.11).
OBS: Fluorescensmikroskopi med ett 40x luftmål kan användas vid denna tidpunkt för att bekräfta mikrotubulifäste och rörlighet. Mikrotubuli uppträder som fluorescerande filament (tiotals mikron i längd) som rör sig (glider) över ytan vid ~ 0,5 μm / s (figur 1). - Pipettera in 30 μL 10 μg/ml streptavidinlösning (beredd i steg 3.14) i flödescellen med hjälp av en laboratorietorkning som försiktigt pressas mot den motsatta änden av flödeskanalen för att underlätta lösningsutbytet. Inkubera i 10 min.
- Flöde 30 μL 12x GUV-lösning (beredd i steg 3.15) in i flödet med hjälp av en laboratorietorkning som pressas försiktigt mot den motsatta änden av flödeskanalen för att underlätta lösningsutbytet. Inkubera i 30 min.
- Tillsätt 2 μl 100 mM AMP-PNP-lösning (beredd i steg 3.7) för att stoppa rörligheten och försegla sedan kammaren med tätningsmedel.
5. Karakterisering av LNT-nätverk
- Överför flödeskammaren till ett inverterat mikroskop för avbildning.
- Välj lämplig filteruppsättning baserat på våglängderna för de fluorescerande lipiderna eller tubulin som används. När du till exempel använder Texas Red-märkta lipider, använd ett 560 nm / 25 nm excitationsfilter och 607 nm / 36 nm emissionsfilter.
- Använd ett 100x oljemål för att fokusera på ytan på täckglaset.
- Avbilda LNT-nätverken med fluorescensmikroskopi.
OBS: LNTs är linjära strukturer som extruderar från de större vesiklarna. LNTs mycket mindre än GUV och har svagare fluorescenssignaler. Således måste exponeringen och kontrasten justeras i enlighet med bild-LNT: er. Dessa justeringar leder också till överexponering av GUV: erna, och därför rekommenderas att lamellariteten och fasseparationen i GUV karakteriseras oberoende. - Fokusera mikroskopet på ett nätverk av intresse och ta en standard eller kaklad bild.
- Justera exponeringstiden och neutrala densitetsfilter för att avbilda LNTs och minimera mättad exponering av GUV: erna. Skaffa bilder både i röda och gröna kanaler.
OBS: Här tillåter den röda kanalen visualisering av Texas-Röda lipider, medan den gröna kanalen tillåter visualisering av mikrotubuli (t.ex. Oregon Green lipider och HiLyte488 färgämnen). - Skapa en sammansatt bild genom att lägga över de röda och gröna kanalerna (bild 1).
- Karakterisering av LNT-nätverk genom att mäta LNT-längd
- Öppna de förvärvade bilderna med hjälp av en bildanalysprogramvara som ImageJ.
- Kalibrera skalan för mikroskopet med hjälp av funktionen set scale, fyll i pixlarna till mm-konverteringsfaktorn och klicka på OK.
OBS: Omvandlingsfaktorn är beroende av mikroskopet, objektivlinsen och kameran, och den kan erhållas med hjälp av ett mikroskopkalibreringsglas. Det uttrycks vanligtvis i pixlar / mm. - Använd flerpunktslinjeverktyget för att mäta längden på nanorören med början från den överordnade GUV. Håll Ctrl + M för att mäta längden.
- Fortsätt mäta längderna på enskilda rör enligt stegen ovan. Bildbehandlingsverktyget sparar varje ny mätning i resultatfönstret.
- Håll Ctrl + D efter att ha ritat varje linje för att hålla reda på vilka rör som har mätts.
- Mätning av LNT-tjocklek (figur 2)
- Öppna bilden i ImageJ och välj Tröskelfunktionen under fliken Bild .
- Klicka på Tillämpa för att tillämpa tröskelvärdet.
- Rita en rektangel med känd längd över önskat rör (svarta pixlar har värdet 0 och röda pixlar har värdet 255).
- Mät områdets integrerade densitet.
- Dela densiteten med längden (i pixlar) på LNT för att få tjockleken (i pixlar).
OBS: Tjockleksmätningarna kan endast jämföras mellan bilder när bildinställningarna och tröskeln är identiskt inställda.
- Bestämning av lipidpartitioneringen i noder av LNTs (Figur 3)
- Öppna bilden i ImageJ.
- Använd linjeverktyget för att rita en linje över önskad nod.
- Mät nodintensiteten i både Oregon Green och Texas Red kanaler.
- Flytta linjen till LNT och mät LNT-intensiteten i både Oregon Green och Texas Red-kanalerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LNT-nätverk (figur 4) tillverkades med hjälp av det beskrivna protokollet, som använder det arbete som utförs av kinesintransport av mikrotubuli för att extrudera LNTs från GUV. Kortfattat framställdes GUV med användning av agarosgelrehydrering med användning av sackaroslösning, och mikrotubuli polymeriserades i GPEM-lösning och stabiliserades i BRB80T. Därefter infördes kinesinmotorer i en flödescell som bildade ett aktivt lager av motorer på ytan av täckglaset. Mikrotubuli introducerades sedan och en streptavidinlösning tillsattes, vilket underlättade bindningen mellan de biotinylerade lipiderna och GUV (som därefter introducerades).
Med alla komponenter närvarande i flödescellen fick LNTs bildas i 30 minuter, vid vilken tidpunkt AMP-PNP infördes för att stoppa rörligheten. Därefter avbildades LNT: erna under ett epifluorescensmikroskop med hjälp av ett 100x oljemål. LNTs kan vara ganska stora; Således kan ett lägre effektmål också användas för att fånga större LNT. LNT-nätverken kännetecknas av tunna, webbliknande utsprång som sträcker sig från och ansluter GUVs. Antalet och förgreningen av LNTs är beroende av flera faktorer, inklusive densiteten hos mikrotubuli på ytan, streptavidinkoncentrationen och antalet GUV som finns.
Denna metod kan generera GUV och LNTs som består av fasta, vätskestörda och vätskeordnade faser, samt fasseparerade vesiklar som uppvisar samexistensen av dessa faser över ett brett spektrum av olika kompositioner (Figur 4). Till exempel resulterar syntetiserande vesiklar med 45% mättad lipid och 55% omättad lipid i vesiklar som separeras i samexisterande flytande oordnade och fasta faser. Om kolesterol ingår kan emellertid vätske-flytande samexistens observeras. Till exempel kommer en blandning bestående av 50% omättade lipider, 30% kolesterol och 20% mättade lipider att skapa GUVs som separeras i samexisterande vätskebeställda (Lo) och vätskestörningar (LD) faser. Införlivandet av kolesterol i denna formulering fluidiserar de mättade lipiderna, vilket möjliggör bildandet av en flytande fas.
Dessutom observerades noder (dvs. runda sfäriska strukturer större än LNT: erna) bildas i de fasseparerade blandningarna (figur 4). Partitionering av lipidtyper inom nanorör och noder kan karakteriseras med hjälp av linjeprofilverktyget var att hitta den maximala bakgrunds-subtraherade toppintensiteten för en nod. Linjeprofilerna för noden och LNT bestämdes och bakgrundsfluorescensen för dessa profiler subtraherades för att bestämma det maximala värdet. Partitionering beräknas sedan genom att dividera det maximala värdet för fluorescensen i noden med det maximala fluorescensvärdet för LNT. Detta tillvägagångssätt möjliggör partitionering av lipider i både LNT och noder som bildas i de större nätverken.
Figur 1: Sammansatt bild av LNTs tillverkade av GUV och mikrotubuli. LNTs extruderas från GUVs av rörliga mikrotubuli som glider ovanpå kinesinmotorer. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tröskelprocess för att få tjocklek. (A) Välj Tröskelvärde under fliken Bild | Justera. (C) Rita en rektangel av känd längd över önskat rör. Svarta pixlar har värdet 0 och röda pixlar har värdet 255. (D) Mät områdets integrerade densitet. För att beräkna rörbredden, dela den integrerade densiteten med 255 och dela sedan denna utgång med längden på rektangeln som skapades i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bestämning av lipidpartitioneringen i noder. (A) Öppna bilden i ImageJ och använd linjeverktyget för att rita en linje över önskad nod. (B) Mät nodintensiteten i Oregon Green-kanalen. (C) Flytta linjen till LNT och mät intensiteten i Oregon Green-kanalen. (D,E,F) Upprepa processen för Texas Red-kanalen. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: LNTs tillverkade av olika GUV-lipidformuleringar. LNTs extruderade från den flytande oordnade (LD) fasen är tunna och långa, medan LNTs extruderade från den vätskebeställda (Lo) fasen är korta och tjocka. LNTs av båda typerna observeras när Lo-L D fasseparerade vesiklar används i GMA. LNTs från flytande fast fas GUVs liknar de extruderade från LD GUVs. Vätskeordnade formuleringar kan skapas med hjälp av en kombination av mättade lipider och kolesterol, medan vätskestörda formuleringar skapas med användning av omättade lipider. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LNT-nätverk är ett användbart verktyg för in vitro-studier av membranegenskaper och transport av biomolekyler såsom transmembranproteiner. Dessutom möjliggör användning av komplexa lipidformuleringar för att tillverka LNT-nätverk mer biologiskt relevanta studier. Andra tillverkningsstudier har använt antingen 1) enkla lipidformuleringar och multilamellarblåsor eller 2) mer besvärliga rörlighetstekniker för att tillverka nätverk från GUVs som består av komplexa lipidformuleringar. Metoden som beskrivs här möjliggör effektiv tillverkning av storskaliga LNT-nätverk från komplexa lipidformuleringar och GUV och med hjälp av billiga reagenser och utrustning. Som sådan erbjuder denna metod möjlighet att studera en rad biologiska processer, inklusive fasseparation och membranproteintransport. Protokollet använder en in vitro-modell där sammansättningen av LNT: erna kan anpassas optimalt för att approximera deras biologiska analoger (t.ex. Golgi-apparater).
Bildandet av LNT-nätverk i den metod som beskrivs här har många fördelar. Till exempel polymeriseras mikrotubuli enkelt och snabbt med användning av frystorkat tubulin, och de förblir stabila vid RT i minst 1-2 veckor när de stabiliseras med paklitaxel16. Som sådan implementeras de enkelt för att driva extrudering av LNT och bildandet av ett storskaligt nätverk 1,2. Dessutom kan GUVs som består av flera lipidkomponenter (dvs. omättade och mättade lipider och kolesterol) snabbt bildas baserat på ett tidigare protokoll med små modifieringar. Dessa modifieringar möjliggör syntesen av GUV: erna som kan genomgå den fysikaliska kemiska processen för membranfasseparation. När de är förberedda kan GUVs lagras i veckor till månader beroende på lagringsförhållanden. Det rekommenderas dock att använda GUVS i upp till 1 månad innan du förbereder en ny sats. Lipidlösningar kan förvaras vid -20 °C eller -80 °C i flera månader, liksom agarosgelen och belagda täckglass, som kan förvaras på RT i månader. Lipidfilmerna på de agarosbelagda täckglasen måste förvaras i vakuum och rehydreras inom 48 timmar.
En utmaning med att använda denna teknik för att bilda LNTs från GUVs är att balansera koncentrationen av GUVs, streptavidin och mikrotubuli i flödescellen. Till exempel kommer LNT-bildningen att begränsas om förhållandet mellan mikrotubuli och GUV inte är korrekt. Om koncentrationen av GUVs är för låg kommer aggregat inte att bildas, vilket är det första steget i LNT-bildning. För de koncentrationer av mikrotubuli och GUV som beskrivs i detta protokoll resulterade en 10x utspädning av mikrotubulibeståndet och 12x utspädning av GUV-beståndet i allmänhet i goda LNT-nätverk. Utspädningar på 5x respektive 6x har också gett bra nätverk.
En annan utmaning är att säkerställa att GUV-lösningen är osmotiskt balanserad med mikrotubulilösningen. Om skillnaden i osmolaritet mellan de två lösningarna är för stor kommer GUVs att bli instabila och potentiellt brista. Om lösningarna inte är osmotiskt balanserade (t.ex. en skillnad på 10% mellan den uppmätta osmolariteten mellan de två lösningarna), bör en koncentrerad (t.ex. 2 M) sackaroslösning användas för att öka lösningens osmolaritet med den lägre uppmätta osmolariteten. En annan begränsning av detta system är stabiliteten hos de resulterande LNT-nätverken, vilka är stabila i storleksordningen timmar och mycket beroende av att flödeskammaren kontinuerligt hydratiseras (eller förseglas kammaren med tätningsmedel). När lösningen har avdunstat från flödeskammaren kommer LNT: erna inte längre att vara användbara, trots att närvaron av några kvarvarande LNTs kan kvarstå efter avdunstning.
LNT-nätverken som skapas från dessa glidande mikrotubuli och GUV kan vara användbara för att förstå lipid-dubbelskiktsdynamik såväl som protein (t.ex. transmembranproteiner) diffusion på membranytor. Protokollet som beskrivs här kan snabbt skapa LNT-nätverk som består av olika lipidformuleringar som lättare efterliknar biologiska LNT-liknande tunnelnanorör samt nanorör som finns i membranbundna organeller (dvs endoplasmatisk retikulum och Golgi-apparat). Förmågan att bilda storskaliga LNT-nätverk är ett viktigt första steg mot att studera cellkommunikation, studera nanofluidisk biomolekyltransport och utveckla syntetiska neuronala nätverk. Detta protokoll öppnar dörren för bredare studier om de fysiokemiska egenskaperna hos LNTs med hjälp av ett minimalt, in vitro-modellsystem där LNTs sammansättning lätt kan modifieras för att efterlikna naturliga cellulära strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sandia National Laboratories är ett laboratorium med flera uppdrag som förvaltas och drivs av National Technology &Engineering Solutions of Sandia, LLC., ett helägt dotterbolag till Honeywell International, Inc., för US DOE: s National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-NA-0003525. Detta dokument beskriver objektiva tekniska resultat och analyser. Eventuella subjektiva åsikter eller åsikter som kan uttryckas i tidningen representerar inte nödvändigtvis åsikterna från USA: s energidepartement eller USA: s regering.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntes och fluorescensmikroskopi utfördes genom ett användarprojekt (ZIM) vid Center for Integrated Nanotechnologies, en Office of Science User Facility som drivs för U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A.
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
