Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal

Resumo

Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, a fim de entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Particularmente, usamos microextração de fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa para analisar os componentes voláteis de odores animais e marcas de odor.

Resumo

Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, utilizando microextração em fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa, para entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das secreções do odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes na amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar compostos que possam estar envolvidos na sinalização. Os principais pontos fortes dessa abordagem atual são a gama de tipos de amostra que podem ser analisados; a falta de necessidade de qualquer preparação ou extração de amostras complexas; a capacidade de separar e analisar os componentes de uma mistura; a identificação dos componentes detectados; e a capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados. A principal limitação à metodologia diz respeito às próprias amostras. Uma vez que os componentes de interesse específico são voláteis, e estes poderiam facilmente ser perdidos, ou suas concentrações alteradas, é importante que as amostras sejam armazenadas e transportadas adequadamente após sua coleta. Isso também significa que as condições de armazenamento e transporte de amostras são relativamente caras. Este método pode ser aplicado a uma variedade de amostras (incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor). Esses odores consistem em misturas complexas, ocorrendo em uma variedade de matrizes, e, portanto, necessitam do uso de técnicas para separar os componentes individuais e extrair os compostos de interesse biológico.

Introdução

Muito pouco se sabe sobre as mudanças químicas que sustentam os sinais olfativos nos animais¹, também por causa dos desafios metodológicos no registro e quantificação de perfis químicos voláteis de odores². Existem várias armadilhas potenciais quando se trabalha com matrizes químicas altamente complexas; estes incluem na amostragem e análise das amostras de odor³.

No Centro de Ciências Rosalind Franklin, Universidade de Wolverhampton, estamos realizando a análise de odores e marcas de cheiro para entender como eles podem ser usados por animais. Combinamos semioquímica com ecologia comportamental, endocrinologia e citologia para melhorar nossa compreensão do papel desempenhado pelos sinais olfativos na comunicação animal.

Desenvolvemos uma metodologia e, em seguida, analisamos odores e marcas de uma variedade de espécies, incluindo vários primatas não humanos (ou seja, lêmures coroados, lêmures-vermelhos, macaques japoneses, babuínos de oliva, chimpanzés) e outros mamíferos (ou seja, gatos, vacas). Coletamos e analisamos uma variedade de amostras, incluindo urina, fezes, secreções de odor de cabelo e odor de glândulas odor. Estes odores e marcas de odor consistem em misturas complexas de compostos e, portanto, qualquer metodologia utilizada para sua análise precisa incluir alguma forma de técnica separada. Como ilustrado, também ocorrem em uma gama de matrizes que necessitam do uso de técnicas para extrair os componentes de interesse.

Estudos anteriores de Vaglio et al.⁴ e outros autores⁵ utilizaram extração dinâmica do headspace (DHS) com espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), enquanto a extração direta de solventes⁶ e extrações complexas de solventes⁷ também foram utilizadas. Particularmente, a amostragem dinâmica do headspace envolve a eliminação do espaço para a cabeça com um volume conhecido de gás inerte que, em última análise, remove todos os compostos voláteis, com exceção daqueles que mostram uma forte afinidade com a matriz amostral (por exemplo, compostos polares em amostras aquosas).

Para a metodologia atual, adotamos a técnica de microextração em fase sólida do headspace (HS-SPME) aliada ao GC-MS. Em particular, desenvolvemos e aprimoraram a metodologia já utilizada por Vaglio et al. em seu laboratório anterior GC-MS^8,9,10.

As técnicas de extração sem solvente são muito eficazes para analisar compostos pequenos e altamente voláteis (que de outra forma podem ser perdidos facilmente de uma amostra) porque esses métodos imobilizam compostos em um suporte de fase estável e sólido. O HS-SPME usa uma fibra revestida com um polímero adsorbente para capturar compostos voláteis no headspace da amostra ou para extrair compostos dissolvidos por imersão em um fluido biológico aquoso¹¹. O revestimento de polímero não liga fortemente os compostos, portanto, pelo aquecimento na porta de injeção do GC eles podem ser removidos. Este método é mais poderoso do que as técnicas de extração de solventes e também mais eficaz que o DHS.

Na abordagem atual, as amostras estão contidas dentro de frascos de vidro. Estes frascos são aquecidos a uma temperatura de 40 °C para simular a temperatura do corpo animal, a fim de promover os componentes voláteis da marca do perfume para ocupar o espaço da cabeça do frasco. Uma fibra SPME, revestida com 65 μm de material sorbente de polidimtilsiloxano/divinylbenzene (PDMS/DVB), é exposta ao ambiente do headspace e componentes voláteis da amostra são adsorvidos na fibra. Ao aquecer a fibra na porta de entrada de um GC-MS, os componentes voláteis são desordenados da fibra e, em seguida, separados pelo GC. Padrões de fragmentação espectral em massa são obtidos para cada componente usando o MS. Comparando esses espectros de massa com bancos de dados espectrais em massa, pode ser possível identificar provisoriamente os componentes da marca do perfume. Através do uso de um amostrador automático, podemos analisar várias amostras em lotes de forma consistente.

Dado que cada tipo de fibra SPME tem uma afinidade diferente com produtos químicos polares, a fibra geralmente é escolhida dependendo da polaridade e/ou peso molecular dos compostos químicos alvo. Além disso, as condições de GC são alteradas dependendo do tipo de coluna GC e das características dos compostos químicos alvo.

Esta técnica permite a análise semi-quantitativa dos componentes voláteis das marcas de odor, permitindo a separação e a identificação provisória dos componentes da amostra, seguida pela análise das razões de pico de área para procurar tendências que possam significar componentes da marcação do odor que possam estar envolvidos na sinalização.

Os principais pontos fortes desta abordagem atual são:

• A gama de tipos de amostra que podem ser analisados.
• Não são necessárias preparações ou extrações complexas da amostra.
• A capacidade de analisar componentes voláteis.
• A capacidade de separar os componentes de uma mistura.
• Para ser capaz de identificar os componentes detectados.
• A capacidade de fornecer informações semi-quantitativas e potencialmente quantitativas sobre os componentes detectados.

Protocolo

1. Coleta de amostras

1. Odores amostrais que são um dos seguintes:
   1. Coletar espontaneamente liberado por sujeitos de estudo habituados (por exemplo, primatas do zoológico) através da marcação do perfume em papel filtro estéril (por exemplo, secreções de odor de glândulas odor) ou diretamente em frascos (por exemplo, urina).
   2. Coletar esfregando cotonetes de algodão estéreis após o treinamento dos sujeitos do estudo usando treinamento de reforço positivo.
   3. Coletar esfregando cotonetes estéreis de algodão após sedação de sujeitos de estudo.
2. Coloque amostras em frascos de vidro transparente estéreis com tampa de parafuso de 10 mL e vedação com tampas de rosca que incorporam FTFE/septa de silicone. Guarde-os imediatamente a -20 °C.
   NOTA: É vital o uso de equipamentos de proteção individual limpos, como luvas de nitrito; alterá-los com frequência; evite contato direto da pele com amostras e frascos. É preferível usar frascos novinhos; no entanto, no caso de frascos usados, é vital pré-limpar os frascos e, em seguida, usar o mesmo protocolo.
3. Leve espaços em branco ambientais toda vez que marcas de perfume forem coletadas. Por exemplo, colete os meios de amostragem (por exemplo, papel filtro ou cotonete) e um frasco de headspace que são expostos ao ambiente durante a realização da amostragem.

2. Preparação da amostra

1. Prepare as amostras no campo cortando com uma lâmina um quadrado aproximado de 10 mm de um papel filtro marcado pelo cheiro, ou na cabeça do cotonete, e colocando-a em um frasco de 10 mL com tampa de cabeça.
2. Depois de preparado, descarte ou limpe a lâmina usada para cortar a mídia de amostragem usando um lenço antibacteriano apropriado e/ou álcool e seque completamente.
3. Armazene todas as amostras a -20 °C.
   NOTA: Preferencial a -20 °C ou de outra forma o mais baixo possível no campo.

3. Preparação para análise

1. Retire amostras do congelador e deixe aquecer naturalmente à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
2. Configure o método analítico no GC-MS da seguinte forma:
   1. Para condições de análise spme, siga as instruções do fabricante para condicionar as fibras SPME antes do primeiro uso: pré-condição de fibra (260 °C por 5 min), incubação de amostras (40 °C por 2 min), tempo de extração (15 min), tempo de dessorção (2 min) e pós-condição de fibra (260 °C para 20 min).
   2. Use as seguintes condições gc: coluna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura do injetor (270 °C), taxa de fluxo (1 mL/min), modo de injeção (splitless), perfil do forno GC (45 °C por 2 min; 4 °C/min a 170 °C; 20 °C/min a 300 °C), linha de transferência MSD (280 °C).
      NOTA: Para melhorar entre a consistência do tempo de retenção da amostra, o método analítico é o tempo de retenção bloqueado).
   3. Use as seguintes condições de MSD: atraso de solvente (2,5 min) e faixa de varredura (29 a 400 amu).
      NOTA: Um intervalo de 10 a 400 foi usado nos protocolos anteriores⁴.
3. Certifique-se de que o fornecimento de gás de purga para a unidade de condicionamento de fibras esteja ligado.
   NOTA: É vital que o conjunto SPME esteja corretamente instalado no amostrador automático e esteja alinhado às bandejas do amostrador automático, à unidade de condicionamento de fibras e à porta de entrada GC. O alinhamento incorreto pode resultar em danos ou destruição da fibra SPME.

4. Análise

1. Coloque um frasco de espaço para cabeça vazio (para agir como um sistema em branco) na primeira posição da bandeja de amostrador automático GC-MS. Coloque o vazio ambiental na segunda posição da bandeja do amostrador automático. Coloque as amostras para análise nas posições subsequentes da bandeja de amostra automática.
2. Crie uma sequência analítica para analisar cada amostra dentro da bandeja de amostras.
   1. Na tela inicial do MassHunter, selecione Sequência | Sequência de carga.
   2. Complete a tabela de sequência para todos os espaços em branco e amostras inserindo as informações apropriadas. Salve a tabela de sequência completa.
      NOTA: As informações exatas para a tabela de sequência dependerão da formatação dos laboratórios para a tabela. As informações mínimas normalmente incluem tipo de amostra, nome da amostra, localização e número de frascos, método analítico e localização e nome do arquivo de dados (a alocação de um nome de arquivo de dados que corresponde ao nome da amostra auxilia o processamento futuro de dados). Amostras adicionais podem ser adicionadas à sequência durante a análise.
3. Execute a sequência selecionando sequência | Sequência de execução.
4. Após análise, devolva amostras ao congelador o mais rápido possível.
   NOTA: pode ser possível reanalisar amostras, mas deve-se notar que alguns componentes voláteis podem ter sido totalmente extraídos durante a análise inicial e alguns compostos podem ter sofrido decomposição térmica e bacteriana a 40 °C, portanto, o cromatograma resultante pode não ser completamente representativo da marcação original do perfume.

5. Análise de dados

NOTA: A análise inicial de dados inclui a integração de cromatógrafos para obter dados de tempo de retenção e área de pico, juntamente com a identificação provisória de picos usando o software ChemStation e bancos de dados espectrais de massa do NIST (National Institute of Standards and Technology), versão MSD F.01.01.2317. A análise dos dados pode ser realizada manualmente ou através de um método semi-automatizado. Se o método semi-automatizado for usado, às vezes é benéfico realizar um grau de análise manual de dados para verificar identificações provisórias.

1. Abra o arquivo de dados clicando no arquivo apropriado na barra de navegação à esquerda. O cromatógrafo de íon total (TIC) será exibido na janela superior da tela de análise de dados.
2. Para integrar o TIC usando o integrador RTE, selecione o Croromatograma | Integrar.
3. Ajuste os parâmetros de integração para que os picos superiores a 3 x ruídos da linha de base sejam integrados. Selecione | de cromatograma Parâmetros de integração de sinal MS. Na caixa de saída ajuste a área mínima de pico conforme apropriado (1.0 produz resultados aceitáveis em nossos exemplos).
4. Para identificar picos e gerar um relatório de resumo, selecione Relatórios de exportação | Os resultados da pesquisa da biblioteca reportam-se ao XLS.
   NOTA: As bibliotecas espectrais a serem pesquisadas juntamente com o número de correspondências de biblioteca a serem exibidas precisam ser predefinidas dentro do software antes que uma pesquisa na biblioteca possa ser realizada.
5. O relatório de planilha resultante contém dados de integração para cada pico e uma tentativa de correspondência de biblioteca espectral para atribuir identidade. Normalmente, a correspondência de qualidade/biblioteca da biblioteca deve ser >80 para aceitar a identificação provisória. Salve a planilha.
6. Identifique um pico diretamente do TIC.
   1. Escolha o pico de interesse.
   2. Se o pico for pequeno, amplie desenhando uma caixa ao redor do pico segurando o botão do mouse da mão esquerda para baixo, estique a caixa sobre o pico e solte.
   3. Coloque a linha do cursor para que ela esteja no ponto mais alto do pico (ou logo depois).
   4. Clique duas vezes no botão do mouse da mão direita e o espectro de massa para o pico aparecerá na janela inferior da tela de análise de dados.
   5. Para pesquisar na biblioteca espectral, mova o cursor em qualquer lugar da janela espectral e clique duas vezes no botão do mouse da mão direita. Os resultados da pesquisa da biblioteca aparecerão em uma nova janela.
   6. Para remover o ruído de fundo de um espectro de interesse, clique primeiro em dobro no botão do mouse da mão direita no pico em questão. Em seguida, clique duas vezes no botão do mouse da mão direita em uma área sem picos imediatamente em frente ao pico de interesse. Selecione | de cromatograma Espectros subtraídos. O espectro subtraído será exibido na janela inferior da tela de análise de dados e exibirá '(-)' ao lado dos dados SCAN no cabeçalho da janela.

Resultados

Seguindo este protocolo, identificamos provisoriamente um total de 32 compostos químicos voláteis a partir da análise de 14 marcas de odor ano-genital liberadas espontaneamente em papel filtro por lêmures de babados vermelhos(Varecia variegata rubra) e comparamos perfis de odor com características do sinalizador¹². Compostos voláteis de ocorrência natural, como hidrocarbonetos, terpenos, álcoois terpenos e cetonas, estavam presentes dentro desses perfis e incluíam compostos que haviam sid...

Discussão

O uso de amostras de controle, ambos os controles ambientais criados no momento da coleta de amostras e espaços em branco do sistema, são cruciais para a interpretação das amostras de marca de odor. Quaisquer picos atribuídos ao ambiente amostral ou ao sistema instrumental precisam ser excluídos das amostras de marcas de odor para que apenas os picos de interesse sejam incluídos em qualquer interpretação. Esses controles também podem desempenhar um papel na avaliação e monitoramento da "saúde" da instrumentação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de amostrador automático de 10 mL	Agilent	5188-5392	Frascos de rosca de 10 ml com
tampas de frascos de 18 mm	Agilent	8010-0139	Magnético com septos de PTFE/silicone
Amostrador automático	Agilent	GC120 PAL amostrador
Coluna capilar Agilent		HP5-MS	30 m x 0,25 mm; 0,25 µ m
Software de análise de dados	Agilent-ChemStation
Cromatógrafo gasoso	Agilent	7890B
Septo de entrada	Agilent	5182-3442	Merlin microseal
Detector seletivo de massa	Agilent	5977A
Software de relatório		Microsoft-Excel
Biblioteca espectral	NIST	-	NIST/EPA/NIH Mass Spectral
Library Programa de pesquisa de biblioteca espectral	NIST-MS		Search v.2.2
Splitless Inlet liner	Agilent	5190-4048
SPME fibres	Agilent	SU57345U	65 µ m Fibra PDMS/DVB

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